GnRH主动免疫雌性大鼠调控机制研究

GnRH主动免疫雌性大鼠调控机制研究

曹晓涵1，韩兴发1，杜小刚1，陈志渝1，孟风艳1，储明星2，曾宪垠1*

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室，北京12.00193)

卵巢切除组和摘 要：旨在探讨GnRH主动免疫雌性SD大鼠的调控机制。24只雌性SD大鼠随机分为免疫组、

，免疫组于1卵巢切除组1空白对照组不空白对照组(n＝8)2周龄注射疫苗，4周后加免；1周龄外科手术摘除卵巢；

作任何处理。使用放射免疫分析法测定血清激素E2、荧光定量PCR分析各基因mRNA表达P4、FSH和LH含量，情况。结果显示，主动免疫显著降低血清E2、至5但4P4、FSH和LH含量，6周处死时，E2和LH含量有微弱上升，

。与空白对照组相比，种激素含量均显著低于空白对照组(主动免疫显著下调下丘脑GPR5P＜0.05)4、KiSS-1、

垂体GnRHGnRH和ER--R、FSH-LHR和ER-αmRNA，αmRNA的表达水平β和LH-βmRNA以及卵巢FSHR、

(。结果表明，降低血清性激素含量，通过下丘脑ERP＜0.05)GnRH主动免疫能显著抑制雌性SD大鼠性腺发育，-/Ki但GnRH主动免疫造成的动物去势存在恢复的可能。-GPR54SS-1通路保持动物较长时间去势；αmRNA关键词：GnRH；主动免疫；调控；机制；雌性大鼠中图分类号：S852.4 文献标志码：A 文章编号：0366-6964(2016)03-0502-07

(四川农业大学生命科学学院，雅安61.25014；

1，DUXCAOXiao-han1，HANXin-faiao-anhi-u1，MENGFen-an1，ggg1，CHENZygy

CHUMin-xinian-in1*gg2，ZENGXy

(1.ColleeoieScience，SichuanAgriculturalUniversitn625014，China；gfLfy，Ya’a2.KeboratorrmAnimalGeneticResourcesandGermplasmInnovationonistrriculture，yLayofFafMiyofAgInstituteoimalScience，ChineseAcademyoriculturalSciences，Beiin00193，China)fAnfAgjg1Abstract：ToexlorethereulatorchanismsofactiveimmunizationaainstGnRHinfemalepgymegSDrats.24adultfemaleSDratswereallocatedto3grousof8animalseachrandoml8ratspy.wereimmunizedaainstGnRHat12weekofae，4weekslateraneualdoseboosterwasadmin-ggqistered.8ratsweresuricallvarictomyat11weekofaewhile8intactratswithoutanreat-gyogytments.Bloodsampleswerecollectedatda0wpv)untiljustbeforesacrificedat56wpv.Serumy0(levelsofFSH，LH，E2andP4weredeterminedusinIA.Aftersacrificed，hothalamusandpitu-gRypitarreremoved，themRNAexressionsofreroduction-relatedgenesweredeterminedbe-yweppyr

；al-timefluorescencequantitativePCR(RT-PCR)Ovarieswereexcised，adiosetissueswerere-p

moved，thenthemRNAexressionsforreroduction-relatedgenesweredeterminedb-PCR.ppyRTAfterimmunizationtwiceaainstGnRH，theconcentrationsofE2，P4，FSHandLHinimmunizedg

P＜0.05).Moreover，activeimmuni-ratsshowedasinificantlowerthanthatinControlgrougylp(

zationaainstGnRHsinificantlown-reulatedthemRNAlevelsofGnRH，GPR54，KiSS1andggydg

，ER-nthehothalamus，GnRH-R，FSH-ndLH-nthepituitarP＜0.05)aswellasαiypy(βaβi

ReulatorchanismsofActiveImmunizationaainstGnRHgyMeg

inFemaleRatsandItsMechanism

收稿日期：2015-05-27

；基金项目：四川省科技厅国际合作项目(四川农业大学双支计划(2012HH0013)00770107)

，作者简介：曹晓涵(女，四川成都人，讲师，博士，主要从事生殖免疫调控研究，1984-)E-mail：caoxiaohan2007@hotmail.com曾宪垠，研究员，主要从事动物生殖免疫调控研究，E-mail：xzen1966@163.com*通信作者：yg

3期

503

FSHR，LHRandER-novaries(P＜0.05).ThisstudndicatedGnRHhadexcellentimmuno-αiyienicandwasagoodalternativeofsuricalcastration.ActiveimmunizationaainstGnRHcauseggg

/Ki--GPR54SS-1，andanimalsinalon-terminfertilitrsterilithefeedbackloofERαgyoybytpo

thefertilitfimmunocastratedratsshowatendancorecover.yoytKerds：GnRH；activeimmunization；reulatormechanisms；femaleratgy；ywo

曹晓涵等：GnRH主动免疫雌性大鼠调控机制研究

理于雌性野生动物，

更有可能因为无计划怀孕带来诸多问题由于存在发情行为，饲养雌性动物不仅难于管[1]；而对物数量，

对其进行避孕能更好的地控制动环境带来的压力，方便管理[，也能减轻过度的动物数量给自然性2]inS。研究表明，GnRH主动免疫雌RHD大鼠有很好的去势效果[3]：雌性SD大鼠接受维持极低水平ne)

，抗体滴度仍保持较高水平主动免疫后直至16wpv，(且血清生殖激素Weekspostvac-免疫的雌性。但随着时间延长，接受GnRH主动腺轴各个生殖相关基因SD大鼠血清生殖激素未见报道mRNA、下丘脑-垂体-性去势疫苗。相关基因的变化情况，考察初次免疫本研究即对雌性大鼠主动免疫表达的变化规律还5GnRH疫的调控机制的应用提供理论依据，为GnRH，探讨雌性动物6周后其生殖激素和生殖GnRH主动免。

主动免疫去势疫苗更广泛 1 材料与方法

合成G材料

remi)nxE，反转录试剂盒RH并列二聚体卵清蛋白复合物xTaqTM、荧光定量P(本实验室免疫分析药盒lus(TaKaRa公司Ⅱ)；(

LHPerf、eFcSHtR、eEalTCiRme染料)、2、P4碘[12RNASYBR

5I]

放射iso盒2)

。(北京北方生物研究所人源性试剂 鼠24动物选取只健康性成熟、分组及处理Sraue-Daw物中心，10周龄，体重180~2pg购自四川大学华西动ley(

SD)雌性大(In＝8。)，组随机分为Ⅰ3组2，0分别是组g(

Ⅰ、组Ⅱ、组Ⅲ加免G)。)1为免疫组(FemaleImmuneGroup，卵巢切除组，加免时注射剂量及方法同初次免疫2周龄时腿部肌肉注射1mL疫苗，4周后时进行手术(Ova。。1组Ⅱ为

重腹腔注射麻醉。3%r戊巴比妥钠iectomygro，u按照p，

OVX)1周龄皮。在大鼠腰部肾区偏下中间位置。麻醉成功后趴卧30mg·kg－1体(，距离脊柱约常规消毒，备1

c射青霉素m位置)

开口，切除卵巢。术后前3d每天肌肉注洗伤口(Contro，l观察伤口愈合情况2万U，

同时使用硫酸庆大霉素注射液冲group，

Con)，不作任何处理。组Ⅲ为空白对照组。试验期间所1.有动物均按常规标准饲养3 ，自由饮水和采食。w周空腹尾尖采血pv初次免疫当天记为样品采集及处理

每2周空腹尾尖采血0w1p次v。初免当天起至84℃wpv)。所有血样于1次4℃，每次，从第8wpv起每4放置过夜1.5mL，，直至处死(56血清激素含量离心15min，分离血清－20℃35保存00r，

·min－1，用于测定，

死，处死后迅速分离下丘脑各组大鼠于。56wpv(初免后第、垂体14个月)断颈处Czooln的EP管中4℃保存用于提取总，放入含RNA1mLT；fIGr和-1.Tri4z o分离双侧卵巢l，去除脂肪组织，放入含1mL应用血清激素含量测定的EP管中4℃保存用于提取总RNA。RIA测定雌鼠血清中FSH、LH、E1.含量5 ，操作步骤按试剂盒说明书进行2和P4基因表达测定

。测其完整性使用苯酚转录成。-完整氯仿法提取各组织总RNA利用反转录试剂盒将其反RNA，电泳检行定量检测cDNA重复，内参基因选择，再以cDNAβ为模板在特定引物下进退火延伸。PCR程序：预变性95℃1-acti0sn。变性每个样品93次环恒温；熔解曲线分析58~60(5℃28~5s60；)读取荧光值；℃直至95℃，共5℃5s；，每400.个循1.C曲线法进行计算5s。目的基因F6XM anaer2.1，荧光定量mRNA5℃分析软件处理P相对表达水平采用标准CR。结果使用引物序列见表Bio-R1a。d差分析利用统计分析g“，采用SPSS2Du0.nc0an软件对所测数据进行单因子方法进行数据间比较表示数据差异显著平均值±标准误(m。

ean±SEM)”表示。P，结果以＜0.05Gc1.PP1.f1i504

表1 引物序列Table1 Primerseuenceofbodissuegenesqyt基因GenBank收录号GeneGenBankaccessionNo.

畜 牧 兽 医 学 报47卷

引物序列(产物大小/b5′-3′)p

PrimerseuenceProductsizeq：FGCTGCTGCTTCTCCTCTGTGTKiSS-1AY19698388R：CTGTTGGCCTGTGGGTTCAGGAACTCACTGGTCATCTTCGTF：GPR54NM_02399269R：GTACGCAGCACAGAAGGAAAGTF：GGCAAGGAGGAGGATCAAAGnRHNM_012767142CCAGTGCATTACATCTTCTTCTGR：F：TCTGCAATGCCAAAATCATCGnRH-RNM_031038164GTAGGGAGTCCAGCAGATGACR：F：CTTCTCCTCTTCTGATGC_LH-NM01285880βR：TTTATTGGGAGGGATGGTCATCCTACTCTGGTGCTTF：FSH-NM_00100759784βR：CACTCTTCCTTCTCTACTGA：FTTACACATAACCACCATACC_LH-RNM012978134R：TCCAGCGAGATTAGAGTCF：GAATGATGTCTTGGAAGTAATAGFSH-RNM_199237163R：CTTAATGCCTGTGTTGGACAGGCTTTGGGGACTTGAATCTF：ER-NM_012689148αR：TGATTCCTGTCCAAGAGCAAGTTAGF：CACAGCTGAGAGGGAAAT_-actinNM031144155βTCAGCAATGCCTGGGTACR：

促性腺激素释放激素；促性腺激素释放激KiSS-1.KiSSetin编码基因；GPR54.KiSSetin受体编码基因；GnRH.GnRH-R.pppp素受体；促黄体生成素β亚基；促卵泡生成素β亚基；LH-FSH-LH-R.促黄体生成素受体；FSH-R.促卵泡生成素受体；β.β.雌激素α受体；ER--actin.-肌动蛋白α.ββKiSS-1.KiSSetinencodinene；GPR54.KiSSetinrecetorencodinene；GnRH.Gonadotroin-releasinormone；Gn-ppggpppggpghRH-R.Gonadotroin-releasinormonerecetor；LH-Luteinizinormoneβsubunit；FSH-Folliclestimulatinormoneβpghpghghβ.β.subunit；LH-R.Luteinizinormonerecetor；FSH-R.Folliclestimulatinormonerecetor；ER-Estroenαrecetor；-ac-α.ghpghpgpβ-myosintin.β

2 结 果

2.1 RNA完整性

，图1)提取的总RNA1%琼脂糖凝胶电泳显示(

样品2无DNA8S和18S条带清晰，5S条带基本可见，污染和降解，纯度符合标准，可进行后续试验。

总RNA样品2.2 血清激素含量M.RNAmarker；1~4.；RNAmarker1-4.TatolRNAsamples2.2.1 雌鼠血清E2含量 雌鼠血清E2含量如M.图1 总RNA1%琼脂糖凝胶电泳

i1 TotalRNAelectrohoresiswithaarosegel(1%)imaeg.pgg图2A所示，箭头表示免疫时间。fIG血清E2浓度F

在初次免疫后便急剧下降，，并一直维持与OVX相同水平至46wpv时即处于检测限0.05)8wpv，从显著低于Co附近，2wpv时，E2含量出现微弱上升，至试验结束(56n(20.6~29.9pP＜5g·mL－1)(

3期曹晓涵等：GnRH主动免疫雌性大鼠调控机制研究

。OVX血清时，仍然显著低于Cowpv)n(P＜0.05)

E2含量在0wpv时，即已处于极低水平，从2wpv

。开始低至不可测水平，显著低于Con(P＜0.05)

2.2.2 雌鼠血清P4含量 雌鼠血清P4含量如图2B所示，箭头表示免疫时间。Con血清P4含量整个试验期间保持较稳定状态，波动为15.97~21.91nfIG血清P4含g·mL－1。初次主动免疫后，

加强免疫继续快速下降，至2量下降，8wpv时低至

。与血清E2显著低于Co不可测水平，n(P＜0.05)

含量变化情况类似，OVX血清P4含量在0wpv时即已处于极低水平，从6wpv开始低至不可测水平，

。显著低于Con(P＜0.05)

2.2.3 血清FSH含量 雌性大鼠血清FSH含量见图2C，箭头表示免疫时间。在整个试验期间Con血清FSH含量维持平稳，波动为3.19~4.28mIU·mL－1。主动免疫引起雌性大鼠血清FSH含

505

量下降，初次免疫后，第2周开始便显著低于Con(，从8wp血P＜0.05)v直至试验结束时的56wpv，清FSH含量一直保持在不可测的低水平。OVX血清FSH浓度从手术后开始升高，显著高于Con(。P＜0.05)2.2.4 血清LH含量 雌性大鼠血清LH含量见图2D，在整个试验期间Con血清LH含量维持较平稳状态，在3.68~4.44mIU·mL－1波动。主动

初次免疫后，免疫引起雌性大鼠血清LH含量下降，

，从8~4第2周开始便显著低于Con(P＜0.05)0

血清LH含量一直保持在不可测的低水平。wpv，从4血清LH含量缓慢上升，但是至试4wpv开始，

。验结束时的56wpv，仍显著低于Con(P＜0.05)

OVX血清LH浓度从手术后开始升高，显著高于

。Con(P＜0.05)

、、图2 雌鼠血清E2(和LH(含量变化P4(nFSH(mIU·mL-1)mIU·mL-1)pg·mL-1)g·mL-1)

Fi2 SerumE2,P4,FSHandLHlevelsoffemaleratsg.

主动免疫能显著降低雌性大鼠血清 综上表明，

并能保持长达5E2、P4、FSH和LH含量，6wpv。

2.3 下丘脑-垂体-性腺轴生殖相关基因mRNA表达变化2.3.1 下丘脑生殖相关基因mRNA表达变化 下丘脑生殖相关基因表达变化情况如图3试验5a，6

观察到GnRH主动免疫显著下调雌性SDwpv时，大鼠下丘脑GPR54、KiSS-1、GnRH和ER--αmR

；外科去势手术也同样显著下NA表达(P＜0.05)

调下丘脑GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-αmRNA

。的表达(P＜0.05)

2.3.2 垂体生殖相关基因mRNA表达变化 垂

试验5体生殖相关基因表达变化情况如图3b，6wpv

时，观察到与Con相比，GnRH主动免疫显著下调

506畜 牧 兽 医 学 报47卷 雌性SD大鼠垂体GnRHR、FSH-c所示，试验56β和LH-βmRNA巢生殖相关基因表达情况如图3

；表达(而外科去势手术显著上调雌性SDwp观察到GnRH主动免疫显著下调雌性SDP＜0.05)v时，

大鼠垂体GnRHR、FSH-LHR和ER-αmRNA表达情况β和LH-βmRNA表达大鼠卵巢FSHR、(。(。P＜0.05)P＜0.05)2.3.3 卵巢生殖相关基因mRNA表达变化 卵

与空白组相比差异显著*.Comparedtointactcontrols，onatesasinificantdifference*dg图3 GnRH主动免疫对下丘脑、垂体和卵巢生殖相关mRNA表达水平的影响Fi3 EffectsofactiveimmunizationaainstGnRHonthemRNAexressionlevelsofhothalamicGnRHandER-αg.gpyp

核(的kAVPV)issetin神经细胞引发产生GnRHpp

分泌峰，继而调控雌激素对GnRH的正反馈调其余位于下丘脑ARC的k节[8]；issetin神经细胞pp

则参与GnRH的产生和雌激素对GnRH分泌的负反馈调节[9]。有报道研究E2对小鼠前脑KiSS-1系统的调节作用。位于弓状核的KiSS-1基因，在卵巢切除的小鼠中表达升高，在卵巢切除后，雌激素替代治疗的小鼠中表达降低：而位于前腹面室旁核的KiSS-1基因的表达正好与此相反。由此得出结论：位于弓状核的KiSS-1神经元可能在GnRH分泌的负反馈中起到一定作用，而位于AVPV的KiSS-l3 讨 论

并且通过试有研究结果表明，接受GnRH主动免疫的动物可能参与了GnRH分泌的正反馈调节，

iSS-1的效应主要是通过ER-α介导其血清促性腺激素及性激素浓度[4-6]均有降低。本验证实E2对K

研究也得到相似结果。P4和E2是由卵巢分泌的重的[10]。研究发现，下丘脑GnRH信号的上调可促

提高血液P4、要孕激素和雌激素，本研究中免疫雌鼠血清P4和进垂体FSH和LH合成和分泌，E2浓

从而改善母鹅繁殖性能[11]。反之，显示达到了很好的免疫度，GnRH信号E2含量均显著低于空白组，

与本去势效果，这与GnRH主动免疫动物的研究结果一的下调则抑制垂体FSH和LH的合成和分泌，

致[5，7]。并且，fIG和OVX血清P4和E2含量无显研究结果一致。垂体FSH和LH的合成与分泌受

，表明在进行GnRH主动免疫5著差异(GnRH主动免疫降低下丘脑Gn-P＞0.05)6下丘脑直接调控，

继而导致FSH和LH分泌减少。wpv后，fIG保持与去卵巢大鼠一样的去势效果。RH含量[12-13]，

去势的雄性恒河猴模型，青春期组KiGnRH主动免疫雌鼠后，血清FSH、LH、P4及E2SS-1

，但GPR5含量与空白对照组相比显著下降(这与mRNA表达明显高于少年组，4mRNA水P＜0.05)

平无差别；雌性恒河猴模型青春期组KiSS-1mR-GnRH主动免疫动物的研究结果一致。

4mRNA水平都显著高于少年组，表Kissetin-GPR54信号系统通过两种方式调NA和GPR5pp

节GnRH来控制排卵周期，位于下丘脑前腹侧室周明KiSS-1受体和配体共同参与中枢神经生殖内分

GnRH主动免疫对雌鼠生殖相关基 综上所述，

因mRNA的表达调控有显著的长期的影响：明显下调下丘脑GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-αmRNA、垂体GnRH-R、FSH-β和LH-βmRNA以及卵巢FSHR、LHR和ER-αmRNA表达水平。而外科去势对雌鼠生殖相关基因mRNA表达调控有不同影响：显著下调下丘脑GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-α显著上调垂体GnRHmRNA；-R、FSH-β和LH-βmRNA表达水平。

507曹晓涵等：GnRH主动免疫雌性大鼠调控机制研究

3期

泌调控[疫后14]均显著下降，下丘脑。本研究也得到一致结论GPR54和KiSS-1mRNA：GnRH表达水平主动免

w显著低于pv在垂体水平。

后，GnRH-R，本研究发现mRNA和LHG-nβRGmRNA主动免疫560上升，接近ConCo的水平n，二者，而表F达SH-βmRNA表达开始仍处于(脉系统到达垂体前叶与.05)。下丘脑正中隆起分泌的量无Gn显RH著通过垂体门差异P＞效应GnRH-R结合产生生物学mRNA明，对大鼠使用，刺激FSH的数量[1G和5]n；RHLH的合成和释放。有研究表另外拮抗剂会下调垂体，M.Loot[16]等学者给母羊GnRH-RmRNA第三脑室灌注mRNA含量升高GnRH，观察到腺垂体中p

GnRH-R原因是G的数目的稳定维持需要。这些结果说明垂体nRH的存在能够刺激GGnnRHRH-R激素参与GnRH-RmRNA，G表达或增加。的素参与nRH-RGnRH-RmRNA结构的稳定性垂体，结合本研究结果可推测mRNA的数目的稳定维持需要，主动免疫后GnRH，雌鼠激G下丘脑nRHGnRH激素的分泌受到影响，至56wpv时，F0SH-此外的分泌可能还未恢复至正常水平R，GnRH主动免疫还显著下。调了卵巢RH.05)，与前人研究成果一致mRNA和LH-RmRNA[17]。由此可推断的表达(PGn＜

R量mRNA主动免疫通过下调卵巢基因表达FSH-RmRNA和LH--ER身发育的作用，在性腺水平减弱甚至阻止，降低卵巢FSH-R和LH-R数，达到去势效果。FSH本研究还表明和LH对性腺自是因为外周低含量的-αmRNA表达显著低于空白组(P＜0.05)，，卵巢同样达[18-20]E2影响其受体mRNA的表wGpv，

本研究结果显示。雌性大鼠仍然保持很好的去势状态，在进行主动免疫后的，这为将56

供了较好的理论依据nRH免疫去势疫苗推广到控制野生动物数量提不确定性[本研究对雌性动物进行间隔仅一个月的两次免疫即21]，为定时定点免疫造成了一定障碍。由于野生动物在野外活动的。而可造成长达一年的去势状态之前有针对地对动物进行免疫。若能在动物的发情期度过发情期而不会导致怀孕。，可以保证动物顺利参考文献[1] THOMP(RefeSrONenceDs)L.：ImmunizationagainstGnRHin[2] Smcailes，20p0e0ci，e6s0-(6co1m：4p5a9r-a4ti6v9.easpects)[J].AnimReprodtEPfOWERSJG，BAKERDL，DAVISTL，etal.fieofmnoectsofgonadotropin-releasinghormoneimmuniza-alernroecpkroductuivnefunctionandbehaviorincaptive[3] [曹晓涵J].BiolReyprmodo，2t0a1i1ne，8l5k(6(C)e：1rv1u5se2-1l1a6p0.husnelsoni)2下丘脑8(2)：-，33垂体韩兴发5-3-卵巢轴调控的影响，陈志渝，等.GnRH[J].主动免疫对雌鼠

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畜 牧 兽 医 学 报47卷

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pttWiveviladc--(编辑 程金华)