单细胞代谢组学：分析和生物学观点

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近年来，单细胞基因组学，转录组学，蛋白质组学和代谢组学的发展和应用激增。代谢组被定义为在特定的细胞，器官或生物体中发现的小分子代谢物的完整补体。单细胞代谢组学最有意义的潜在应用可能在于癌症领域 - 例如，识别导致转移的循环癌细胞。预计单细胞代谢组学将受到影响的其他领域包括系统生物学，干细胞研究，衰老和耐药性的发展;更一般地说，它可以用来发现细胞应对化学或环境压力的化学策略。相对于其他单细胞“组合”测量，代谢组学提供了细胞功能（即表型）的更直接和动态的图像，但也可以说是最难测量的。这是因为代谢组可以在非常短的时间范围（几秒或更短时间）内对环境做出动态反应，因为代谢物的结构多样性和巨大的动态范围很大，因为不可能扩增代谢物，并且因为用荧光标签会扭曲它们的正常功能。 进展

尽管尚未获得基于单细胞代谢组学的深入生物学见解，但为实现这一目标已经采取了重要步骤。质谱（MS），质谱成像，毛细管电泳，光学光谱和荧光生物传感器的发展现在允许同时测定单个细胞中数百种代谢物，并具有对阿托咪隆范围的敏感性。现代阵列格式，特别是微流体平台，有助于我们快速且高吞吐量地执行此类测量的能力。最近的几项研究显示了如何从单细胞代谢组学中提取新的生物学见解。已经发现不同蜗牛神经元的代谢组的实质差异，例如在B1和B2型神经元中，在分离它们之后和过夜培养后立即发现。鞘糖脂可以用荧光标记标记，并且在与这样的缀合物孵育的神经元的裂解物中，来自它们的所有代谢产物都是荧光的并且可以被鉴定。用癌症药物治疗后，可以在淋巴瘤细胞和实体瘤中磷酸化3'-脱氧-3'-氟胸苷。可以遵循用2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）处理酵母细胞对代谢组的生物学效应。单细胞测量显示代谢物浓度的扩散比群体测量大得多的事实被用于确定许多代谢物 - 代谢物相关性，其在2DG处理的酵母细胞中相对于对照改变。 外表

代谢组是表型异质性的极好指标，当人群遭受重大化学或环境挑战时，已被公认为稀有细胞存活的关键因素。 然而，单细胞水平的代谢组学仅仅是成熟的。 预期改进导致代谢组更完整的覆盖，更好和更快的代谢物鉴定以及无损测量。 摘要

目前对单细胞的广泛分子谱分析非常感兴趣;细胞的代谢组 - 它的小分子代谢物的全部补充 - 是单细胞表型多样性的直接指标，并且几乎立即读出细胞如何对环境影响作出反应。然而，由于快速的代谢动力学，分子的结构多样性以及无法扩增或标记小分子代谢物，代谢组在单细胞水平上很难测量。测量技术包括质谱，毛细管电泳，以及光谱学和荧光检测的较小程度，已经在单细胞代谢组学方面取得了令人瞩目的进展。尽管目前这些方法都不能完全，快速和无损地测量单个细胞的代谢组学，但进展已足以使该领域正在目睹从可行性研究转向产生新的生物学见解的研究。特别有趣的应用领域是癌症生物学，干细胞研究以及单细胞水平组织切片中异生素和药物的监测。

科学文献包含了大量的工作，其中大量的细胞被打开并均化以制备用于生物化学表征的样品，当然，从这些研究中已经学到了很多。但最近，已经有可能监测单个细胞中的事件，因此允许研究人员测试来自传统大规模分析的许多细胞状态的现有“平均”读数是否准确地代表了正在研究的各个细胞的行为。这种单细胞测量提供了丰富的信息 - 有时是无法预料的，而且往往是先前被模糊的 - 关于细胞如何响应干扰或信号。在这个特刊中，三篇评论提供

了对细胞调控的基本见解的实例，当可以测量单个细胞中的酶活性，转录反应或代谢状态时，这些实例被揭示。

单细胞测量的一个明显优势是能够测量单个细胞对相似或相同条件的响应中的变化或“噪音”。在很多情况下，可以监测细胞反应的时间过程。基因转录可能特别嘈杂，在一些细胞中发生RNA合成爆发，但不存在相同群体中的其他细胞。因此，这些系统的性质产生了根本性的问题。也许响应的变化有利于节约资源或确保某些细胞在不断变化的环境中生存。或者可能是少量分子的生物物理限制和工作中酶的特征决定了这种不可避免的变化。 Sanchez和Golding回顾了最近在模型系统中从细菌到动物细胞的工作，试图解决转录动力学是否编码在DNA启动子序列的结构中 - 因此可能在整个基因组中变化 - 或者通过物理或生物物理特性将在整个细胞中施加更多的全局约束。

Levine等人探索另一个以前隐藏的现象蛋白质激活的连续测量显示，许多人经历异步脉动响应，这在来自细胞群体的平均测量中是模糊的。他们讨论了蜂窝电路如何连接以产生这样的响应以及这种控制系统的优点。

Zenobi强调了方法学的进展，特别是在质谱中，可以对单细胞分子组分的丰度进行定量。为了表征个体细胞快速变化的代谢状态，目标是进行同步测量。但是，对广泛学科的新见解的承诺是持续努力，以挖掘隐藏在单个细胞范围内的大量新知识。

每个人都是不同的，这种个体表型是基于遗传，表观遗传，发育和环境的差异。克隆或同基因文化中的细胞，其成员都来源于一个共同的祖先？即使在这种情况下，由于环境影响（包括细胞周期），原始细胞的年龄以及影响培养物中单个细胞表型的其他因素，表型也有差异。设想一个假设的情况，即克隆群体中的所有细胞都完全同步并在完全相同的条件下生长。即便如此，经过一段时间后，人群中也会出现不同的表型，这通常是随机生物过程的结果（图1A）。生物学背景中的“随机”是指生物化学反应进行的速率中的不规则性或“噪音”。对于涉及非常少量或单个分子的过程，例如DNA转录和蛋白质表达，这一点非常明显（1）。为了评估产生的表型的差异，单细胞测量是必要的;人口测量结果只产生平均值（图1B）。组织分层也可能需要单细胞测量。例如，神经元是一种细胞类型，其中功能需要个体差异。激励哺乳动物中的单个神经元可以启动胡须的运动，改变学习，从而影响整个有机体的行为。即使在复杂的感觉神经元集合中，单个神经元也具有不同的受体区域，因此是不同的。

近年来，单细胞分子分析的开发和应用急剧增加[关于以代谢组学为重点的综述，见（2-8）]。代谢组可定义为特定细胞，器官或生物体中发现的小分子代谢物（分子量小于〜2kD）的完整补体（9）。就目前而言，代谢组（图1C）包括内源性以及外源性小分子[如丙酮酸，乳酸，糖，腺苷一磷酸（AMP），二磷酸腺苷（ADP），三磷酸腺苷（ATP）等] ，药物及其代谢物（通常称为异生素）和脂质，以及不是蛋白质降解产物的肽（例如，在细胞信号传导中重要的神经肽）。具有短序列的核酸可能具有分子量的优势，但它们被认为是细胞转录组的一部分，而不是代谢组。盐不被视为代谢物。

细胞的基因型描述了它的“潜力”，而表型描述了它的功能，但是两者之间的联系往往是模糊的（10）。相对于单细胞基因组学，转录组学或蛋白质组学，代谢组学提供了细胞功能（即表型）的最直接和最动态的图像，但也可以说是最难以测量的：尽管基因组或多或少静态，并且转录组和蛋白质组在几分钟到几小时的时间范围内发生变化（11），代谢组在几秒甚至几毫秒的时间范围内对环境影响作出反应（12）。这种快速动态是单细胞代谢组学的主要挑

战之一。它需要一些协议来猝灭研究细胞的新陈代谢，因为他们经历了样本制备本身作为环境压力并会对其作出反应（13）。其他挑战包括包含代谢组的化合物的巨大结构多样性（图1C），大动态范围（从每个细胞的几个分子到更大细胞中的主要代谢物的1010个分子），我们无法扩增代谢物（如通常用DNA完成）以及避免荧光标记的需要：极少数代谢产物是自发荧光的，附着标签在大多数情况下会阻止代谢物发挥其生物学功能。

检测和了解癌细胞是单细胞代谢组学最有意义的潜在应用之一（14,15）。在正常代谢的许多其他癌症细胞中，包括导致转移的循环癌细胞的癌症细胞的检测将是这样的应用之一。在癌症治疗的框架中，人们可能会发现组织中对药物治疗产生抗药性的细胞，或者更普遍地，发现一些细胞如何成功地应对化学或环境压力，而另一些细胞却死亡的化学策略（16）。单细胞代谢组学的其他潜在用途（相对于其他“组学”方法）是获得细胞代谢数学模型的输入和输出数据（17），更多地了解老化（18,19），并预测干细胞的发育命运。

单细胞代谢组学数据已经产生了深刻的生物学洞察力吗？我会争辩说，情况并非如此。其中一个原因是研究代谢产物通常不能跟随随机性。来自随机生化过程的代谢组只有间接的且通常很小的作用。此外，重要的代谢物出现在细胞中代谢网络的众多节点中;即需要主要代谢物之间的多重相关性以获得任何见解，或者需要对具有高度专业化作用的稀有和低浓度代谢物进行精确测量，这是困难的。然而，下面讨论的一些研究（20-23）已经增强了我们对生物系统的了解。

这篇综述主要关注快速发展的分析方法学，但也讨论了如果代谢组学数据是在单细胞水平上而不是从总体平均数据中收集的（图1B），如何在代谢组学中收集代谢组学数据在许多单细胞中可以提供有关细胞变异性的原因和后果的新信息，以及这些变异是适应性的，表观遗传现象还是生物化学的基本性质。 单细胞代谢组学的一般注意事项

除非样品是细胞悬液，否则取样的第一步（2,6）是从显微镜观察下有机物分离适当的细胞，有时人工完成。一旦细胞分离出来，一些方法直接对单个细胞进行取样;其他涉及细胞培养，例如，在微流体装置中。如上所述，一个主要问题是合适的样品制备，不会破坏待研究细胞的代谢。解决这个问题的一种方法是尽可能长时间地将细胞保持在本地环境中。文献中已经提出了许多非常成功的微流控芯片，它们可以轻柔地捕获细胞（24-27）。这些微流体平台的关键功能是分离细胞，在良好控制的条件下培养它们，将高度定量的化学品注入生长培养基中，并选择性释放细胞进行分析，这可能涉及片上裂解步骤（28）。另一种选择是在对细胞进行测量（23）以猝灭新陈代谢之前将细胞震荡冷冻。

另一个问题是所需的灵敏度。细胞大小差别很大。典型的哺乳动物细胞直径约10微米（体积= 1微米）;海参Aplysia californica的巨大神经元，经常用于早期单细胞研究，因为它们可以在显微镜下手动操作，可以达到500μm。大小范围的另一端是模型生物，如酵母（直径≈5μm）和直径约1μm（体积= 1 fl）的细菌。假设代谢物浓度为1 mM，那么需要在这些微小体积中检测到的绝对量在1 amol至1 fmol范围内，即使对主要代谢物来说也是具有挑战性的。有趣的是，浓度敏感性不是问题：在6-fl细菌细胞内存在单个分子转化为0.28nM的浓度;也就是说，通常不需要测量低于纳摩尔浓度的浓度。

此外，细胞通常在富含分子的培养基中生长，所述分子与代谢物相似或甚至相同。因此，区分周围介质中的代谢物（足迹）和细胞内的代谢物（指纹）是至关重要的。

最后，用于采样细胞的高通量格式显然是必要的;对单个细胞的孤立测量可能在生物学背景中意义不大（尽管如果单个细胞可以在其形态学和分子方面进行精确和连续分析，则可以从该单个细胞获得生物学洞察）。为了产生统计上显着的数据，通常需要数百或数千次测量，这是另一个挑战。已经开发了许多能够实现高吞吐量询问许多单细胞的策略。经典的高通量格式是流式细胞术及其修饰，如荧光激活细胞分选（FACS;图2A）。然而，流式细胞术测量通常与代谢物无关，并可用于将细胞培养物分离成随后分析的两个或几个亚群。因此开发了特殊形式的细胞计量学测量 - 例如，流式细胞仪样品递送后的质谱读数（29）。其他高通量格式包括受控数量的细胞（30）和许多不同的芯片实验室设备（31）的微阵列印刷。图2B（24）显示了Di Carlo和Lee开发的一个允许温和诱捕的平台。许多U形流体动力捕集结构允许单个贴壁细胞的排列培养和同时控制流体灌注和单个细胞的均匀环境。电池装载可以在不到30秒内完成。

高密度芯片也可用于通过质谱（MS）进行测量。 如下所述，MS是单细胞代谢组学最成功的方法之一 - 然而，这意味着高通量制备单细胞样品成为瓶颈。 一种可能的解决方案涉及MAMS（质谱芯片）芯片（32），如图2C所示。 MAMS芯片的一个非常有吸引力的特征是，表面上的“全憎”聚硅氮烷涂层包围的亲水孔允许通过简单地将液体拖到芯片表面上而自动分离含有来自细胞悬浮液的单个细胞的小体积。 这种MAMS芯片的当前版本允许填充10,000到50,000个井并随后进行分析; 每孔的细胞数量由泊松分布给出。 准备单细胞样品进行分析 微流控

虽然微流体本身不是一种分析方法，但微流体装置在通过光学光谱，质谱或其他方式显示单细胞样品进行读取时非常有用。微流体装置的工作是运输，固定，培养，注入试剂，保持观察，并以高通量方式检索单细胞。在所有情况下，使用以聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为材料的微型软光刻，格式包括膜片钳阵列（33），动态单细胞培养阵列（24）和集成微流阵列板（iMAP）（34）。动态单细胞培养阵列（图2B）允许许多单个贴壁细胞的排列培养物（在约1mm 2的视野中〜100）。诱捕是被动和自行终止的，一旦一个地方充满细胞，充满地点周围的变化的流体动力学流动阻止其他细胞进入它。该装置至今尚未用于化学测量，但似乎提供了非常温和的生长环境，如在阵列上灌注培养24小时后HeLa细胞的高存活率（95％）所示。 iMAP阵列基于重力驱动流动和沉降捕获细胞，捕获率接近100％。它具有开放的流体交换通道;基因表达，蛋白质免疫测定和细胞毒性数据可以平行进行。

另一种策略是基于流体阻力的动态微流体阵列（25）。流动通道具有类似曲流的形状，并带有一些额外的小型“隔间”（流体动力学陷阱），细胞被动地捕获。为了选择性地从这样的海湾释放珠子或细胞，通过激光加热单个陷阱附近的Al图案来产生微泡。作者写道，加热对所研究珠粒的完整性无关紧要（Al结构达到> 130°C的温度），但人们可能不得不担心暂态温度跳跃作为一种环境影响细胞的代谢组会发生反应。尽管迄今为止这种设备的开发和操作只能使用珠子而不是使用电池，但有100个物体可能被困住并单独处理。对于单细胞分析，这种微流体装置将以介质作为循环液体进行操作，并用于将可寻址的细胞递送至随后的分析（例如通过质谱）。

微室阵列不仅可用于单细胞分离，而且可用于细胞内生物分子的分析。这种设计基于PDMS阀门，封装容积为〜625 pl的圆形储存器中的单个电池。这些微室可以快速和可逆地打开和关闭;这样的设计允许用单细胞进行孵育，洗涤，标记和裂解步骤（35）。裂解物仍保留在小容积的微室中;虽然稀释仍然存在，但是它受到控制和限制，使得可以逐个细胞地直接研

究各种目标分析物。该格式已用于分析辅因子NADH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）及其磷酸NADPH，并用于许多细胞内生物分子的定量测定，包括化合物如人胚胎肾（HEK）T细胞中的环AMP（cAMP） Rex细胞的生产受到激素类黄体生成素的刺激（36）。 Attomole量的cAMP（250至1000 amol，随着受到lutropin刺激的水平而增加）被检测到。由于使用竞争性酶联免疫吸附测定法（ELISA）进行检测，这种形式提供了相当于单细胞免疫测定法。

还有许多其他微流体格式可用于单细胞捕获，培养和移植到分析[更多信息，请参阅（31,37-39）]，尽管在许多情况下这些微流体并非专门用于获取代谢物的化学信息。有些形式允许进行非常有趣的显微观察，例如观察芽殖酵母细胞在其整个寿命期间的衰老过程（19），其揭示了显着的与年龄相关的表型变化和细胞衰老和细胞凋亡的显着异质性。然而，这不是代谢组学研究，对于大多数其他微流体平台也是如此：在代谢组学方面，它们的有用性是观察和分类单个细胞，在微流体装置内刺激它们，并且以快速传递它们控制后续分析步骤，以确定代谢物。 纳米器件

纳米级装置可用于操控单细胞或以受控方式将化学物质输送到细胞中。 纳米线波导为基础的方法允许单细胞光学内窥镜（40），一个空心原子力显微镜（AFM）探针可以插入细胞壁，用于提供液体进入细胞质（41），并已使用纳米通道 将精确量的生物分子输送到活细胞中（即一种精确的转染技术）（42）。 正如（43）中总结的那样，纳米级器件也正在开发中用于分析细胞，例如光学上通过近场方法，通过原子力显微镜，或电化学方法通过扫描电导显微镜。 尽管大部分相关文献都提到了高通量操作的潜力，特别是其需求，但大多数这些纳米级方法目前缓慢，连续并且难以控制。 鉴定单细胞代谢物的分析方法 质谱

质谱（MS）正迅速成为超灵敏和同时检测单细胞水平上许多代谢物的最广泛使用的方法之一。无标签，高度敏感和信息丰富，MS早在该领域就有所贡献。 MS可以用作流式细胞仪的检测器（29），具有在几分钟内输注数百个细胞的能力。在大鼠腹膜肥大细胞中检测到组胺（0.75±0.33fmol）和5-羟色胺（0.11±0.06fmol），然而，每种细胞中两种胺的量没有任何明显相关性。 A. californica的巨大神经元（20,44）提供了处理非常大的细胞的容易性。具有超过300个不同细胞相关信号的大数据集的主成分分析揭示了各种海兔神经元的代谢组中的显着差异 - 例如，在B1和B2型神经元中 - 在分离它们之后和过夜培养之后。也有可能确定分离的神经元中几种代谢物的绝对浓度。例如，细胞内谷氨酸浓度在一种神经元中为11mM，在另一种神经元中为4mM。这种特殊的策略涉及到毛细管电泳（CE）和MS，这为鉴定和检测代谢物提供了一种非常有效的方法（44）。

在现代电离方法中，基质辅助激光解吸/电离（MALDI）对于单细胞分析具有足够的灵敏度。然而，在≤500道尔顿范围内存在强烈的基质信号对于代谢组学来说非常重要。因此制定了一些策略来规避这个问题。基于纳米光子效应的基于无基质的电离方法是可用的 - 例如，使用来自多孔硅（DIOS）或硅纳米柱阵列（NAPA）的解吸电离，其在一些实验室的手中具有亚毫微摩尔的灵敏度，或甚至亚阿托摩尔范围（45,46）。 NAPA-MS揭示了应激和对照酵母细胞群体的代谢差异（47）。灵敏度足以以半定量方式确定由1到80个细胞组成的样品中的代谢物，并且可以将100多个峰指定给各种代谢物，代表约1200种已知酵母代谢物的〜9％。在氧化应激之后，观察到谷胱甘肽，半胱氨酰甘氨酸，谷氨酰半胱氨酸和尿酸盐（等等）的上调，而与叶酸生物合成有关的化合物，例如氨基-4-脱氧分叉酸或磷酸二氢喋呤，被下调，表明细胞将资源从增长转向压力。

另一种策略是使用仅生成少量明确信号的MALDI矩阵。一个优秀的化合物是9-氨基吖啶（9-AA），它具有促进负离子形成的附加好处（48）。这对于检测其去质子化形式的代谢产物很有用，如小型有机酸或磷酸化化合物。已经使用9-AA（49）显示了酵母中代谢物的单细胞检测灵敏度，并且在随后的单细胞研究中使用了相同的基质（4,50,51）。负离子模式MALDI和9-AA允许在单一酵母细胞中检测26种不同的代谢物（23）。在这项研究中用MAMS芯片测量了数百个细胞，测量了2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）对代谢组化学干扰的影响（图3A）。单细胞测量显示代谢物浓度相对于群体测量显示更大的分布的事实被用于确定许多代谢物 - 代谢物相关性，在2DG处理的酵母细胞相对于对照的情况下，相关性被改变。 或者，可以使用基于电喷雾电离（ESI）的方法。开发了一种称为激光消融电喷雾电离（LAESI;图3B）的方法，用于在大气压力下对单个细胞进行原位质谱分析（52）。通过将基于GeO2的玻璃纤维的蚀刻尖端递送中红外（IR）激光脉冲（被样品中的水吸收）实现单细胞探测，并且将激光消融产物后离子化为纯溶剂ESI羽流。代谢分析是从单细胞和小细胞种群葱属和水仙pseudonarcissus灯泡表皮，以及单个鸡蛋Lytechinus pictus实现的。在检测到的A. cepa的332个峰中，有35个被指定为代谢物，借助于精确的质量和MS-MS测量。不同色素沉着的相邻细胞的代谢物分布差异可以用于假鼻疽假单胞菌的鉴别; A. cepa显示代谢差异是细胞年龄的函数。然而，这些植物物种的细胞相当大，大约70×400μm。一种完全不同的基于ESI的方法被称为活单细胞视频质谱法（53,54），包括在视频显微镜观察下将电喷雾针插入细胞，去除一些细胞质，然后通过相同的针直接电喷雾液体到环境入口质谱仪（图3C）。该方法甚至能够区分细胞质特异性和颗粒特异性信号，例如显示大鼠白血病肥大细胞系（RBL 2H3）模型的亚细胞代谢物分布的差异。在植物组织（来自Pelargonium zonale，天竺葵）中鉴定出约1000个属于代谢物的峰，并且高分辨率MS，串联质谱法和数据库搜索的组合对于超过20个信号产生初步分配（55）。然而，这种方法很难称为高吞吐量。取样细胞的内容仍然是手动完成的，并且很困难，质谱分析是在第二步中离线进行的。充其量，每小时可以分析几个单元。 质谱成像

质谱成像（MSI）在这里单独处理，因为样品制备和分析的方式完全不同（56）。使用MALDI和二次离子质谱（SIMS）成像。在研究级MALDI-MS仪器上，MSI现在可以在环境压力下以<1μm（57,58）的空间分辨率完成，并具有非常高的质量准确度和质量分辨率（59）。这对应于多种细胞的亚细胞分辨率。为了产生足够的每个点的信号，空间分辨率通常选择较低，范围在5到30μm，这也是具有成像能力的商用MALDI仪器获得的空间分辨率（60）。 MSI能够检测和鉴定各种代谢产物，并且常用于组织切片，其中逐个细胞的区别是可行的。 MALDI-MSI的主要应用之一是药物及其代谢物在组织切片或甚至整个动物薄切片中的可视化。尽管单细胞分辨率原则上是可用的，但为了提高数据采集的速度或者因为它不是必需的，它通常不用于这种研究。例如，在肺结核感染的兔肺组织切片中，二线结核药物莫西沙星在给药后几个时间点的分布成像（61）。观察到该药物在肉芽肿病灶中累积的数量高于周围肺组织中的数量，在肉芽肿内分布不均匀;在相对于细胞肉芽肿区域的情况下观察到非常低的量。

纳米结构 - 引发剂质谱（NIMS）成像已被用于跟踪个体癌细胞和癌症异种移植物对化疗的反应（22）。在用雷帕霉素或FLT处理样品后，在淋巴瘤细胞和实体瘤中进行3'-脱氧-3'-氟胸苷（FLT，胸苷类似物）的磷酸化作用至FLT单磷酸（FLT-MP）。虽然FLT易于从细胞中转运出来，但FLT-MP并非如此，它的积累可作为治疗细胞药物诱导代谢变化的间接指标。还对许多细胞提取物进行了互补液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）测量，结果一致。

二次离子质谱成像能够以亚细胞分辨率[低至<100nm（62-64）]产生复杂表面的化学图谱，例如组织切片或细胞培养物。在SIMS中，通常必须在非常高的空间分辨率和检测完整分子种类的能力之间找到折衷：具有能够小于100nm分辨率的高度聚焦的初级离子束的SIMS通常以“动态SIMS”模式操作（即，a高的一次离子剂量对于产生足够的信号是必需的）。但是，这对于较大的有机分子的完整性是不利的。有报道称MALDI成像与SIMS相结合，如果需要，后者提供更高的空间分辨率（65）。两者都允许无标记和同时测定异生素及其代谢物的身份和分布以及组织中的内源性物质。这是全身微量放射自显影的一个有趣的扩展，消除了对放射化学的需求并提供了分子特异性信息。

质谱分析的共同之处在于，在所有提供的分析方法中，它们产生关于所检测化合物的最详细信息。一个好的策略是使用精确的质量测量（59），它经常将信号的可能元素组成限制为仅有的或理想的唯一总和公式（参见方框1）。有时串联MS（MS / MS）甚至可以对来自单个单元（55）的信号执行，但通常这是不可能的，因为信噪比不足。或者，假设在单细胞数据中出现相同的化合物，则可以对来自较大样品的相同的，精确测量的质荷比（m / z）信号进行MS / MS分析。 MS / MS可能并不总是提供所寻求的信息。例如，不同的磷酸化碳水化合物表现出非常相似的MS / MS谱，因此可能不能通过质谱法区分。最后，越来越多的数据库列出了各种物种的代谢物（方框1）。在数据库中查找假定的代谢物肯定有其优点，特别是对于自动化数据解释，尽管它对探索识别新代谢物很少帮助。 基于荧光的检测，荧光生物传感器和FRET生物传感器

荧光显微镜原则上是优良的，敏感的，无损的且广泛可用的方法来对单个细胞成像，并且与荧光标签组合，还可以提供化学特异性。使用现代图像处理技术，以高吞吐量的方式获取信息非常简单。然而，很少代谢物是自发荧光的;例子包括检测红酵母中的类胡萝卜素（66），通过自发荧光光谱和衰变动力学（67）区分组织中的肿瘤细胞，或与光合反应中心II和光系统II的内部触角有关的叶绿素色素的定位在藻细胞中（68）。将荧光标记附着到低分子量代谢物上证明是非常有创意的：荧光标签本身会干扰代谢物的生物化学功能。因此，需要根据代谢物的存在或浓度提供间接荧光读数的方法。荧光蛋白（FPs）的“智能”设计可以多种方式用作生物传感器（69）：通过小分子配体与FP结合激活荧光，通过诱导FP的构象变化代谢物，通过多于一个FP部分的寡聚化依赖性荧光，或通过两种不同FP的福斯特共振能量转移（FRET），由代谢物的结合激活。通常这种格式被称为“纳米传感器探针”。

存在许多基于荧光的方法来检测AMP，ADP或ATP-例如，其中在ATP存在下二聚甲基胺配体，萘二甲酰亚胺发色团和Zn（II）中心形成荧光复合物的测定法（70）。高斯托克斯位移（> 70 nm），高荧光量子产率，对其他有机和无机磷酸盐的良好选择性以及低至1μMATP的灵敏度是一些关键特性。荧光检测的一个问题是荧光信号容易受到环境变化（例如，通过改变pH，温度或溶剂极性）而受到干扰。涉及同时测定不同波长的两种荧光信号的比率测量可避开这些问题，并为定量测定提供更高的精度。 FRET的结合诱导调制是比率测量的可能实施例。这种FRET生物传感器可用于检测核苷多磷酸盐（71）。它表现出良好的灵敏度（ATP为“1μM）和优异的线性度;作者能够在用20mM 2-脱氧葡萄糖和1mM KCN处理后，遵循人类癌症（HeLa）细胞系中细胞的能量电荷。然而，问题是选择性有限：报道了一系列核苷多磷酸与FRET传感器分子的结合。

有很多困难使得荧光显微镜更不适合真正的代谢组学：遗传编码的纳米传感器探针仅存在于少数特定的小分子中[72]，表达间接荧光检测的生化机制相对复杂。通常需要繁琐的优化，

特异性和光学对比有时不令人满意，并且遗传修饰可能影响这些细胞的天然生理学。另外，可以同时成像的不同荧光报道标签的数量是有限的（约10）。事实上，文献似乎没有包括同时检测多种目标代谢物的报道;然而，真正的代谢组学需要数十到数百个。另一方面，荧光对超灵敏检测非常有用，降至单分子水平。已经显示了通过微流体处理的个体细胞中的蛋白质（1,73），并且是检测单个细胞中小拷贝数蛋白质表达随机性的关键方法。在CE分离细胞化学成分后，超灵敏检测也非常有效（21,74,75）。 振动光谱学

在某些情况下，振动光谱可用于区分单个细胞中的某些代谢物（76）。与通过荧光标签进行检测相反，振动光谱学是无标记的，因此适用于光谱活性化合物（例如颜料），只要它们以足够高的浓度存在即可。一个例子是β-胡萝卜素通过其1150和1515 cm-1拉曼带在细胞分裂藻细胞中的亚细胞分辨率（〜550 nm /像素）的定位（68）。在这种情况下也记录了互补的单细胞MS数据。显示了β-胡萝卜素和含有光系统II的内部触角的质体的共定位。基于同步加速器的红外光谱仪具有多个低发射率光束和一个大焦平面阵列探测器，用于在中红外区实现540 nm的像素尺寸，比传统热或同步加速器的可能尺寸小约两个数量级IR来源（77）。例如，从具有单细胞分辨率的CH3拉伸（2950cm-1）和酰胺I（1654cm-1）模式的图像可获得详细的光谱信息，所述图像在具有慢性炎症的癌性前列腺组织的薄切片上。已通过FACS从活组织的活检组织中分离出角膜上皮细胞;将这些细胞分成假定的干细胞（SC），转运放大（TA）细胞和终末分化（TD）细胞（78）。光谱（1080和1225 cm-1）和一些蛋白质区域（1443 cm-1）的DNA区域主要区分TA细胞和TD细胞的SC，而酰胺区和脂质（1550,1650和1740 cm-1）用于区分TA细胞和TD细胞。受激拉曼散射显微镜技术（79）可以通过它们在2845 cm-1处的饱和CH振动，蛋白质在1655 cm-1处它们的酰胺I带或由它们的785和1090核酸显现各种生物分子（例如脂质） cm-1带。采用这种技术可以实现200nm左右的像素尺寸;即亚细胞空间分辨率是可能的。振动光谱学的显着特点是绝对不需要对细胞进行染色或标记。另一方面，光谱对于代谢物并不是特异性的，而是揭示了所有高度集中且具有光谱学活性的化合物。这经常导致IR和拉曼光谱的光谱拥塞，这使得它们不适合用作代谢组学的工具。

基于分离的化学分析

毛细管电泳和毛细管液相色谱一直用于包括柱分离的单细胞研究，显然它们可以处理的体积很小。在毛细管分离和伏安以及荧光检测（80）后，可以检测大型蜗牛神经元中数十个飞摩尔量的代谢物，包括氨基酸和神经递质，甚至可以检测血清素与安培计的亚甲基偶极子检测极限报道（81）。这种方法目前最成功地用于单细胞蛋白质组学（82,83），尽管一些代谢物的应用已经出现在文献中（84-86）。具体而言，已经报道了单神经元中具有一（74），二（21）和三色（75）荧光检测（图4）的糖鞘脂的定量研究。总体策略是用荧光团标记一种或多种糖脂[例如哺乳动物神经节苷脂GM1和（21）中的乳糖苷神经酰胺]，用这些缀合物孵育细胞，并通过荧光产物的出现遵循糖脂分解代谢和合成代谢。通过将单个细胞抽吸到毛细管中，将它们溶解在其中并通过CE分离代谢产物来鉴定这些。考虑到标记的鞘糖脂的迁移时间略微不同，可以通过与标准化合物比较来鉴定。大约有十几种代谢产物被鉴定出来，并且单个细胞显示出标记的鞘糖脂的摄取大不相同。达到六个数量级的动态范围和约106个理论塔板的分离能力。对于用硼二吡咯甲烷（BODIPY）荧光团标记的糖鞘脂，根据标签的确切性质，可以获得34±1至67±7个分子的极端灵敏度。显然，引入的不同荧光团的数量越多，可同时进行的代谢途径越多。然而，这些限制与许多不同荧光通道的同时检测以及由相当庞大的荧光团的存在引起的代谢本身的干扰相同。

将CE分离与MS检测相结合也是一项非常强大的技术（20,44,48）。 例如，无鞘CE-ESI-MS界面允许检测大肠杆菌提取物中接近20种代谢物，对ADP-核糖的灵敏度范围从20 nM（〜

0.8 fmol）到α-酮戊二酸的2.5μM（48）。 CE-ESI-MS对单个神经元的定性和定量代谢组学研究也有报道（20,44,87）。 讨论和展望

细胞群体中表型异质性的化学特征是只能通过单细胞测量评估的性质。它似乎是一个可演化的特征，代谢组是细胞培养的单个成员如何对刺激或环境压力作出反应的最直接指标。通过精确分析细胞条件（外部和内部，例如通过光学显微镜）并将这些数据与代谢组学数据进行比较，可以获得生物洞察力。然而，表型异质性的根本原因几乎不是代谢，而是遗传，表观遗传或基于随机过程。现在已经确定，表型异质性提高了罕见细胞的存活率（88,89）;换句话说，“极端”表型可能拯救遭受重大化学或环境挑战的整个人群（如药物剂量）。代谢组学有望成为鉴定这些细胞的好方法，但理想情况下来自同一细胞的基因组和蛋白质组学数据也应有所贡献。然而，为了从同一个细胞中提取基因组，蛋白质组和代谢组，目前存在很大的实验困难;迄今为止，还没有实验协议可以实现这一点。一个近似值可能是从一个或几个细胞中生长出微生物，这些细胞已经在一定的微扰下存活下来，并且在这个微培养物的等分试样上与基因组学，转录组学和蛋白质组学一起进行代谢组学。那么问题在于微生物的异质性是否也会在这种微观文化中发展，并且速度如何。这个问题可以用高通量单细胞分析来解答（图5）。

MS和分离显然是最成功的单细胞代谢组学方法，无论是在代谢组学和速度方面。已经发现了数百种代谢物信号，尽管通常来自相当大的细胞，例如蜗牛神经元或植物细胞。从较小的细胞（酵母，细菌）鉴定更困难。鉴定相对繁琐：需要比较电泳测量中代谢物和标准化合物的洗脱时间，以及从大量细胞中获得的信号（包括与MS / MS中的标准品进行比较）。不幸的是，MS和CE都具有破坏性;荧光和光谱方法检测代谢物非破坏性只涵盖单一或极少数代谢物。此外，除一些高分辨率成像方法外，目前的单细胞分析无法区分亚细胞区（如膜，细胞质或细胞核）中化合物的分子位置。这导致对单个单元格进行平均，并且从这个意义上来说，限制了当前的方法。

单细胞代谢组学对于系统生物学和医学诊断有着更多的进一步要求：（i）代谢组学更广泛的覆盖范围。即使对于酵母等模式生物[酵母代谢组的大小是1168种化合物（90,91）;在酵母代谢组数据库中，www.ymdb.ca，列出了2027个小分子]，目前可用的最佳方法的覆盖率<10％的完整代谢组。 （ii）更快地识别单细胞数据中的代谢物，以及高吞吐量的一般测量。最近引入的大规模细胞计数方法（92），其中使用标记有不寻常元素（镧，铈，铒，镱等）的抗体来编码细胞的特定抗原，如果合适的抗体或适体可以是找到。 （iii）发现新的或未知的代谢物的方案。 （iv）无损代谢物测量。针对最后挑战的一种可能的策略是两步法，其中首先使用具有大化学范围的代谢组学方法来确定指示例如疾病状态的关键化合物，然后开发和实施非破坏性荧光纳米传感器专门针对这些关键化合物。 图。1

细胞培养中不同表型的发展。

（A）表型变异的原因可以从遗传差异到随机过程。 （B）仅在单细胞测定的情况下显示双相性的相同参数（例如，代谢物浓度）的群体平均值（灰色条）和单细胞测量值（白色和黑色条）的假想直方图。 （C）代谢物的一些例子，说明了由代谢组学涵盖的化合物的大的结构多样性。 图2

高通量制备单细胞进行化学分析的方法。

（A）使用与细胞表面抗原结合的荧光抗体（这里是CD45RA与CD4）对人骨髓细胞进行流式细胞术。图中的每个点都来自单个单元格。 （转载自（92）]（B）微流体单细胞捕获阵

列。左上角：越来越高的放大率描绘了细胞捕获装置整体（比例尺，500μm;细胞和介质流从左边进入）。左下：具有陷阱细胞的捕获阵列的高分辨率明场显微照片。右下：放大显示一个被困细胞的细节。诱捕是一个温和的过程，在常规施加的压力下没有观察到细胞变形。右上图：捕捉设备和机制的示意图（未按比例绘制）。 [转载，来自（24）]许可，（C）用于质谱（MAMS）芯片的微阵列。比例尺，1440μm;单个孔的直径为300μm。在MAMS阵列上放置一个1“x 3”显微镜载玻片，可以放置2860个孔。莱茵衣藻藻细胞;用LS 400扫描仪（Tecan，Männedorf/瑞士）测量叶绿素荧光读数。 [图片由苏黎世ETH苏黎世的Jasmin Krismer和苏黎世功能基因组学中心的Jens Sobek提供] 图3

通过质谱法分析单细胞水平的代谢物，显示了该方法的能力。

（A）用2DG处理的单个YSBN.6（酿酒酵母）细胞（m / z = 70至900）的全扫描负离子模式MALDI质谱;测量发生在2DG进入生长培养基的峰值后1分钟。插图显示两个光谱：（i）m / z = 100至180; （ii）m / z = 330至350. [许可转载自（23）]（B）来自NAPA的单一酵母细胞在代谢物质量范围内的LDI质谱。 ~24个推定代谢物中的四个被标记。插图：在LDI-MS分析之前沉积在NAPA底物上的单个酵母细胞的AFM图像。 （C）全谱图（m / z范围100至1000）的实例和从叶细胞的纳米电喷雾尖端提取的天竺葵单细胞内容物的照片。 （D）MALDI飞行时间（MALDI-TOF）成像从培养的蹬踏神经元的细胞培养样品中以MS和MS / MS模式检测强的神经肽信号。自动产生的m / z 1540的MS / MS峰值分配产生对应于海兔蹬踏肽PLDSVYGTHGMSGFA的已知氨基酸序列的序列。 [经许可从（60）转载] 图4

基于分离的神经元细胞代谢物检测。

（A和B）通过毛细管电泳分离和荧光检测来自用BODIPY染料标记的糖鞘脂LacCer的代谢产物，以全标度（A）和扩大标尺（B）示出。 未知组件标有“？”。 对于不同的细胞可以发现很大程度不同的代谢物。 [经许可从（21）转载] 图5

高通量筛选展示三种不同表型（白色，灰色，黑色）的许多单个细胞的示意图。

施加压力（例如营养限制或药物治疗）后，只有黑细胞存活。 来自这些幸存细胞的新的微培养物可以发育成具有统一表型（所有黑色子代细胞）的群体，或者更可能发育成具有不同表型的群体。