miRNA简介

1.关于microRNA

microRNAs （简称miRNA）是一类进化上高度守的小分子非编码RNA，长度大约22nt左右，具有转录后调控基因表达的功能。第一个microRNA 于1993 年被发现。2000年之后，关于miRNA的研究取得了很大进展，目前已经有1000多个人类被发现，这些miRNA调控至少 30% 以上的基因表达，参与多种生理病理过程。

编码miRNA的基因可能位于功能基因编码区、非编码区，可能成簇表达或独立表达。在细胞核内，基因组DNA 转录生成较长的pri-pre-microRNA，之后被Drosha酶切割pri-pre-miRNA成形成长度大约70-100 碱基的、具发夹结构的pre- microRNA。这些发夹结构的RNA 被核输出蛋白exportin5转运到细胞质，在呗胞浆中的Dicer 酶切割形成19-23nt 大小的成熟的miRNAs 产物。成熟的单链miRNAs 与一系列蛋白形成miRNA诱导的沉默复合物(miRISC)，结合于靶mRNA的3ˊ-UTR区，阻止所结合的mRNA 的翻译或直接降解靶miRNA。每个miRNA可以调控多个（甚至上百个）靶基因，而特定靶miRNA也可以同时被多个miRNAs调节。 成熟的miRNA具有如下特点：（1）通常的长度为20～24 nt , 但在3′端可以有1～2 个碱基的长度变化;（2）5′端有一磷酸基团, 3′端为羟基, 这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA 的降解片段区别开来；（3）具有高度保守性、时序性和组织特异性。

序列（特别是种子序列）高度同源的miRNA被归为一个miRNA家族，但这些miRNA并不一定是成簇表达的。例如miR-34 家族3个成员miR-34a、b、c，其中，miR-34a位于1号染色体1p36基因座位，单独表达；而miR-34b和-34c位于11号染色体11q23基因座位，成簇表达（图1），但它们都具有相同的种子序列（图1），并且都受到转录因子TP53的调控。同一miRNA家族成员功能近似（但靶基因并非完全相同）。

图1 miRNA-34 family成员

（from Hermeking H Cell Death Differ. 2010，17(2) 193-9）

miRNA的表达为转录因子调控，其表达具有时空特异性和组织特异性。调控特定的生理过程。例如，肿瘤相关基因TP53和Myc分别调控促进凋亡的miRNA（例如miR34a，最近报道该miRNA亦靶向调控肿瘤干细胞biomarker CD44表达，）或抑制凋亡的miRNA（例如miR-21，该miRNA在多种肿瘤细胞中高表达），后者通过调控相应的靶mRNA，最终促进或抑制细胞凋亡（图2）。

和编码蛋白的mRNA相同，miRNA基因上游同样有启动子，启动子区的CpG导发生甲基化，也会影响下游基因表达。在一些肿瘤细胞（例如淋巴瘤）中，miR-34a上游CpG岛发生甲基化导致miR-34a表达水平降低；而在另一些肿瘤细胞（如胰腺癌）中，TP53突变产生同样结果，显示了miRNA表达调控的多层次。另外，基因缺失，重排等，以及环境因素，例如缺氧等，都会影响miRNA的表达。

图2 转录因子调节凋亡相关miRNA表达

（from Cortez MA t al Advances In Cancer Research, Vol 108）

目前，关于miRNA研究方法已经比较成熟，通过深度测序，可以发现未知的miRNA，miRNA芯片则可以很好鉴定研究组和对照组的差异miRNA，进而通过实时荧光定量PCR（q-PCR）加以验证。运用生物信息学分析以及数据挖掘，寻找miRNA可能的靶点以及靶序列，可能涉及的作用通路，之后进一步通过基因转染、过表达或抑制目标miRNA观察一些表型或基因表达变化，

以探讨发现miRNA的作用机制。或研究miRNA与疾病的相关性，发展基于miRNA的诊断、疾病分型、预后判断、药效检测和治疗，都是目前miRNA研究的重要内容。从2000年至今，关于miRNA的文献已经超过10000篇，并且随着miRNA研究的不断深入，这个数字还在加速递增。

2.miRNA研究方法

尽管早在1993年，科学家就发现了第一个microRNA，但直到2003年以后，这种小RNA分子的大作用才不断被发现。研究显示：miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达，影响了30%的基因。miRNA在多个组织中，例如正常和肿瘤组织中差异表达。因此，通过表达谱分析寻找疾病相关miRNA并进行发病机理研究，最终应用于肿瘤诊断和治疗，已经成为目前miRNA研究的重要方向。在研究中，从深度测序、miRNA芯片到通过导入化学合成的mimics/antagomirs等实现miRNA过表达和抑制，都是研究中常用的方法。同时，在miRNA研究中，生物信息学分析扮演着越来越重要的角色。

下表介绍了miRNA研究和应用中科学家关注的主要科学问题以及目前常用的研究方法。 问题 目的 研究方法 深度测序&生物信息学分析 应用 miRNA表有哪些miRNA表达？ 发现新的候选miRNA 达情况 生物信息学分析预测可能的miRNA，进一步验证 miRNA芯片，磁珠流式细胞miRNAmiRNA何时表达？在发现差异miRNA，为进一步功表达谱 miRNA表哪里表达？表达差能研究、诊断，预后判断，疗达特征 qPCR对hit miRNA进行验证，异？ 效检测等奠定基础 Northern Blot，原位杂交等 生物信息学分析 qPCR对hit mRNA进行验证，Western Blot等方法检测蛋白表达水平 miRNA控制哪些基因？这些基因功能？所在信号通路？ miRNA功转入miRNA mimics观察相应mRNA&机理研究，功能研究 （miRNA能分析 蛋白水平变化以及相关现象低表达情况） 转入miRNA antagomirs观察相应mRNA&蛋白水平变化以及相关现象（miRNA低表达情况） 生物信息学分析miRNA结合靶mRNA 3ˊUTR的可能序列 miRNA如何控制靶miRNA 确定结机理研究 （3ˊUTR）合位点 构建包含miRNA结合位点以及位点突变的萤光素酶报告载体进行验证 细胞水平：过表达及抑制实验（见miRNA功能（与特定miRNA功前），观察表型及现象变化以及上功能研究 疾病、表型的关系） 能分析 下游通路变化 动物模型：过表达及抑制实验（见前），观察表型及现象变化以及上下游通路变化 临床组织样本，检测miRNA表达情况与疾病相关性 选择疾病相关的一个或一组miRNA，或结合其它基因水平变化，进行诊断，预后判断，疗效检测 q-RCR等检测 转入合成的小分子miRNA模拟物（miRNA低表达情况）或拮抗剂治疗 （miRNAG高表达情况） miRNA应用于诊断 诊断 miRNA应用于治疗 治疗

miRNA主要研究技术

深度测序 抽提分离小分子（例如18-30nt）RNA，通过RT-PCR扩增之后，利用solexa深度测序，并进行生物信息学分析，获得miRNA表达谱。深度测序结合生物信息学分析手段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的miRNA（miRNA-known）、新的miRNA（miRNA-new）以及可能的新miRNA（miRNA-cadidate new），并对新发现的miRNA进行靶基因分析，功能预测等。通过深度测序的方法，可以发现新的miRNA，为进一步的深入研究奠定基础。 miRNA芯片 利用miRNA芯片（例如Agilent miRNA芯片），可以高通量分析miRNA表达的时空特异性、不同样本（例如癌组织和癌旁组织）中miRNA的差异表达，进而进行把基因分析，功能注释、通路分析，网络分析等，以了解miRNA在疾病发生中的作用。与深度测序不同，miRNA芯片针对已知miRNA进行研究。筛选到的差异miRNA可以利用q-pCR进行验证。 q-PCR q-PCR技术可以用来检测miRNA以及其靶mRNA和相关mRNA等的检测，主要方法有茎环法和加尾法等。前者针对特定miRNA设计引物，特异性好，然而成本较高，周期长；后者采用通用引物，时间短，通量较大。

Mimics以及Antogomirs 通常基因功能研究常常采用过表达或干涉（抑制、敲除）等方法，miRNA研究也不例外。通过导入化学合成的小分子miRNA mimics或拮抗miRNA 的antagomir，观察靶mRNA及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表型变化，进行信号通路研究，是目前miRNA功能研究的常用方法。

萤光素酶报告系统 在确定了靶mRNA之后，找到位于3ˊ-UTR区的miRNA结合位点是研究者下一步关心的内容。通过生物信息学分析获得候选的miRNA结合区域，将野生型和结合位点突变的3ˊ-UTR序列克隆入商品化的萤光素酶报告载体（例如pMIR-REPORT? miRNA Expression Reporter Vector系统），通过观察miRNA对发光强度的影响对结合位点加以验证。

miRNA的研究方法还有很多，例如磁珠流式细胞仪分析miRNA表达谱，Northern Blot或核酸原位杂交检测miRNA的表达，miRNA克隆、测序等等。另外，在miRNA研究中，随着高通量测序、芯片的技术不断发展，另一个重要的工具--生物信息学分析发挥着越来越重要的作用。

3.miRNA研究技术---MicroRNA实时定量PCR

实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。 技术原理

技术特点

加尾法 1µg total RNA 通用反转录引物 Sybrgreen法 可同时检测数十个miRNA • RNA加尾和引物延伸法，样本用量少（1µg）且不需分离miRNA • 采用通用反转录引物，一次反转录产物可用于上百个miRNA检测 • 检测通量高，可同时检测数十个miRNAs • 不同末端成熟miRNA都能被加尾和反转录，保证定量准确性 • 配合QIAGEN试剂盒，保证实验可靠性 扩增产物特异性高，通过产物热解离曲线（融解曲线）判断 茎环法 1µg total RNA 特异反转录引物(茎环) Sybrgreen法 客户需要的microRNA • 高特异性——只对成熟MicroRNAs进行定量，而不受其前体干扰 样品量 反转录 qPCR 通量 特点 样品量 反转录 qPCR 通量 特点 • 快速，简单——整个操作只需两步，不到3个小时，即可获得高质量的数据 • 灵敏——样品消耗少，仅需1-10ng的total RNA或同等物 • 超宽的线性范围——可跨越7个数量级 样品量 反转录 qPCR 通量 特点 Taqman探针法 1µg total RNA 特异反转录引物(茎环) Taqman 探针法 客户需要的microRNA • 准确性高 • 特异性强：只检测成熟的microRNA，而不检测其前体及基因组DNA • 快速简单：容易操作,3h内就能得出高质量的结果 • 灵敏度好：对常规样品的检测只需要1~10ng的总RNA • 重现性佳：具有很高的准确性和重现性 • 宽广的动力学范围：即可检测几拷贝到几百万拷贝的人工合成miRNA或几匹克到几十纳克的总RNA。