(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 111187752 A(43)申请公布日 2020.05.22
(21)申请号 202010090044.3(22)申请日 2020.02.13
(71)申请人 宁夏大学
地址 750021 宁夏回族自治区银川市西夏
区贺兰山西路489号(72)发明人 曾瑾 王玉炯 史客松 马臣杰 (74)专利代理机构 北京久维律师事务所 11582
代理人 邢江峰(51)Int.Cl.
C12N 5/0786(2010.01)
权利要求书1页 说明书4页 附图1页
CN 111187752 A(54)发明名称
小鼠骨髓巨噬细胞的制备方法(57)摘要
本发明提供了一种小鼠骨髓巨噬细胞的制备方法，包括：(1)配制完全培养基(2)颈椎脱位6–9周的小鼠；(3)取小鼠股骨及胫骨，吹出小鼠骨髓细胞，重复多次，直至骨无色，吹散后收集单细胞悬液，离心，弃去上清；(4)在细胞沉淀中加入红细胞裂解液处理；(5)迅速加入完全培养基中和，离心，弃去上清；(6)加入完全培养基到离心细胞沉淀中，使之重悬；(7)将重悬细胞接种至细菌培养皿中培养；(8)4小时后，将悬浮细胞吸出，重新接种在含诱导剂的完全培养基的细胞培养皿中，此为第1天；(9)在第3天的时候，对细胞进行半量换液，此后隔天换液至第7天，进行检测。本发明提供了一种简单、经济、快速的小鼠骨髓巨噬细胞分离方法。
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权 利 要 求 书
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1.一种小鼠骨髓巨噬细胞的制备方法，所述制备方法包括：(1)配制含有10％胎牛血清的DMEM培养基，得到完全培养基，将小鼠成纤维细胞L929细胞培养上清和完全培养基放入水浴锅中温育；
(2)颈椎脱位处死6–9周的小鼠，在75％乙醇中浸泡2-3分钟；(3)无菌手术剪剥除小鼠腿部皮肤及肌肉，剪取小鼠股骨及胫骨，刮除骨上的肌肉及筋膜，用含2％青链霉素的磷酸盐缓冲液漂洗骨表面；
(4)用手术剪剪除股骨及胫骨两端，吸取DMEM培养基，将注射器针头插入股骨及胫骨骨髓腔，吹出骨髓，重复多次，直至股骨及胫骨无色，吹散后收集单细胞悬液，转入离心管，离心，弃去上清；
(5)在离心细胞沉淀中加入3mL红细胞裂解液，迅速吹散细胞沉淀，20s后加入10mL完全培养基中和，离心，弃去上清；
(6)将重悬细胞接种至细菌培养皿中，加入完全培养基，置于37℃5％CO2培养箱中培养；(7)4小时后，轻轻将悬浮细胞吸出，离心，将细胞沉淀重新接种在含有20ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)或20％L929细胞培养上清的完全培养基的细胞培养皿中，将培养皿置于37℃5％CO2培养箱中培养，这一天记为第1天；
(8)在第3天的时候，对细胞进行半量换液，此后隔天换液至第7天，得到小鼠骨髓巨噬细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述完全培养基含有体积含量为10％的胎牛血清。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述水浴锅的温度为37℃。4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(4)、(5)和(7)中的离心的转速为800转/分钟，离心时间为5分钟。
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说 明 书
小鼠骨髓巨噬细胞的制备方法
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技术领域
[0001]本发明涉及细胞培养技术领域，更具体地，涉及小鼠骨髓巨噬细胞的制备方法。背景技术
[0002]巨噬细胞是先天性和适应性免疫反应的关键组成部分，并且由于其强大的吞噬病原微生物活性，它们是抵御外来入侵者的第一道防线。巨噬细胞广泛分布于全身，存在于淋巴器官，肝脏，肺，胃肠道，中枢神经系统，骨骼和皮肤中。由于他们的重新分配，参与了广泛的生理和病理过程。巨噬细胞是高度通用的细胞，能够识别微环境改变并维持组织稳态。许多病原体已经进化出通过巨噬细胞作为特洛伊木马来生存，复制、感染人类和动物并在全身繁殖的机制。最近对进化、遗传、宿主-病原体相互作用的生化方面重新引起了对巨噬细胞的广泛关注。
[0003]从小鼠组织中分离常驻巨噬细胞产率低且程序复杂，这对于许多功能性巨噬细胞的获得和研究来说困难重重，同时需要大量相对均一的细胞。这些都制约了原代巨噬细胞的相关研究。而一种重要且有效的替代方法就是用适当的生长因子在体外培养骨髓细胞，以此从骨髓前体细胞分化成大量巨噬细胞。但是制备小鼠骨髓来源的巨噬细胞存在操作复杂，制备率低，涉及试剂较多和周期长等制备问题。
[0004]小鼠骨髓来源的巨噬细胞是在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)或L929上清(含巨噬细胞集落刺激因子)等存在下，对未分化的骨髓细胞进行体外分化获得的原代巨噬细胞，特别可以从转基因小鼠品系中获得相应的转基因小鼠原代巨噬细胞。因此，是广泛应用于免疫学和细胞生物学中体外研究中的优秀模型。[0005]由于BMDM可相对高产的获得，可以冷冻储存，特别可以从转基因小鼠品系中获得相应的基因突变的原代巨噬细胞，成为重要且应用广泛的免疫学和细胞生物学原代细胞模型，在基因的功能研究，疾病的发生发展以及寻找治疗靶点方面应用极为广泛。因此制备和鉴定小鼠骨髓巨噬细胞是免疫学和细胞生物学研究中重要的一项实验内容。目前有不少研究人员提出了制备小鼠骨髓巨噬细胞的实验方法。如在2010年，Sunao使用M-CSF诱导骨髓原始细胞，将诱导后的骨髓巨噬细胞和0.2％的乳胶珠温育来进行鉴定。2012年，Manzanero课题组也使用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导骨髓原始细胞，成功的制备了小鼠骨髓巨噬细胞。2008年，Joachim利用L929细胞培养上清诱导骨髓原始细胞，使用Mac-1和F4/80表面抗原表达的荧光激活细胞分选(FACS)分析评估分化的效率。2013年，Trouplin也用L929细胞培养上清诱导小鼠骨髓细胞，7天时间成功的制备了小鼠骨髓巨噬细胞，并使用F4/80和HLA-DR标记物和细胞吞噬实验，证明小鼠骨髓细胞分化成巨噬细胞。2018年，曾立课题组在研究骨髓源巨噬细胞向破骨细胞分化特性的比较中，使用M-CSF诱导骨髓原始细胞，并使用CD11b表面抗体对小鼠骨髓巨噬细胞表面抗原CD11b进行鉴定，也证明证实骨髓原始细胞经M-CSF刺激后所得的细胞是小鼠骨髓巨噬细胞。
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说 明 书
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发明内容
[0006]本发明的目的是提供一种小鼠骨髓巨噬细胞的制备方法，以用于免疫学和细胞生物学研究。
[0007]本发明提供了一种小鼠骨髓巨噬细胞的制备方法，所述制备方法包括：[0008](1)配制含有10％胎牛血清的DMEM培养基，得到完全培养基，将小鼠成纤维细胞L929细胞培养上清和完全培养基放入水浴锅中温育；[0009](2)颈椎脱位处死6–9周的小鼠，在75％乙醇中浸泡2-3分钟；[0010](3)无菌手术剪剥除小鼠腿部皮肤及肌肉，剪取小鼠股骨及胫骨，刮除骨上的肌肉及筋膜，用含2％青链霉素的磷酸盐缓冲液漂洗骨表面；[0011](4)用手术剪剪除股骨及胫骨两端，吸取DMEM培养基，将注射器针头插入股骨及胫骨骨髓腔，吹出骨髓，重复多次，直至股骨及胫骨无色，吹散后收集单细胞悬液，转入离心管，离心，弃去上清；[0012](5)在离心细胞沉淀中加入3mL红细胞裂解液，迅速吹散细胞沉淀，20s后加入10mL完全培养基中和，离心，弃去上清；[0013](6)加入完全培养基，重悬细胞接种至细菌培养皿中，置于37℃5％CO2培养箱中培养；[0014](7)4小时后，轻轻将悬浮细胞吸出，离心，弃去上清，重新接种在含有20ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)或含有20％L929细胞培养上清的完全培养基的细胞培养皿中，将培养皿置于37℃5％CO2培养箱中培养，这一天记为第1天；[0015](8)在第3天的时候，对细胞进行半量换液，此后隔天换液至第7天，得到小鼠骨髓巨噬细胞。
[0016]在上述制备方法中，其中，所述完全培养基含有体积含量为10％的胎牛血清。[0017]在上述制备方法中，其中，所述水浴锅的温度为37℃。[0018]在上述制备方法中，其中，步骤(4)、(5)和(7)中的离心的转速为800转/分钟，离心时间为5分钟。
[0019]本发明提供了一种简单、经济、快速的小鼠骨髓巨噬细胞分离方法，适用于一般实验室的小鼠巨噬细胞分离以及进一步培养，为后续实验提供基础。附图说明
[0020]图1示出了小鼠骨髓巨噬细胞的制备示意图。
[0021]图2为使用本发明制备的小鼠骨髓巨噬细胞体外培养7天的细胞状态图。具体实施方式
[0022]下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买所得。[0023]本发明提供了一种小鼠骨髓巨噬细胞的制备方法，包括以下步骤：[0024](1)配制含有10％胎牛血清的DMEM培养基，得到完全培养基，将小鼠成纤维细胞L929细胞培养上清和完全培养基放入水浴锅中温育；
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说 明 书
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(2)颈椎脱位处死6–9周的小鼠；在75％乙醇中浸泡2-3分钟；
[0026](3)无菌手术剪剥除小鼠腿部皮肤及肌肉，剪取小鼠股骨及胫骨，尽可能地刮除骨上的肌肉及筋膜，用含2％青链霉素的磷酸盐缓冲液漂洗骨表面；[0027](4)手术剪剪除股骨及胫骨两端；5mL一次性注射器吸取DMEM培养基，将注射器针头准确插入股骨及胫骨骨髓腔，吹出骨髓，重复多次，直至股骨及胫骨无色，吹散后收集单细胞悬液，转入离心管，离心，弃去上清；[0028](5)在离心细胞沉淀中加入3mL红细胞裂解液，迅速吹散细胞沉淀，20s后加入10mL完全培养基中和，离心，弃去上清；[0029](6)将完全培养基加入到离心细胞沉淀中，使之重悬；[0030](7)将重悬细胞接种至细菌培养皿中，置于37℃5％CO2培养箱中培养；(备注：此过程用于去除易于贴壁的少量成纤维细胞)[0031](8)4小时后，轻轻将悬浮细胞吸出，离心，重悬细胞重新接种在含有20ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)或20％L929细胞培养上清的完全培养基的细胞培养皿中，将培养皿置于37℃5％CO2培养箱中培养，这一天为第1天；[0032](9)在第3天的时候，对细胞进行半量换液，此后隔天换液至第7天，进行检测后用于相关实验。图1示出了部分步骤的示意图。[0033]下面结合附图，对发明作进一步说明。[0034]实施例[0035](1)配制含有10％胎牛血清的DMEM培养基，得到完全培养基，将小鼠成纤维细胞L929细胞培养上清和完全培养基放入水浴锅中温育；[0036](2)颈椎脱位处死6–9周的小鼠；在75％乙醇中浸泡2-3分钟；[0037](3)无菌手术剪剥除小鼠腿部皮肤及肌肉，剪取小鼠股骨及胫骨，尽可能地刮除骨上的肌肉及筋膜，用含2％青链霉素的磷酸盐缓冲液漂洗骨表面；[0038](4)手术剪剪除股骨及胫骨两端；5mL一次性注射器吸取DMEM培养基，将注射器针头准确插入股骨及胫骨骨髓腔，吹出骨髓，重复多次，直至股骨及胫骨无色，吹散后收集单细胞悬液，转入离心管，离心，弃去上清；[0039](5)在离心细胞沉淀中加入3mL红细胞裂解液，迅速吹散细胞沉淀，20s后加入10mL完全培养基中和，离心，弃去上清；[0040](6)将重悬细胞接种至细菌培养皿中，置于37℃5％CO2培养箱中培养；(备注：此过程用于去除易于贴壁的少量成纤维细胞)[0041](7)4小时后，轻轻将悬浮细胞吸出，离心，重悬细胞重新接种在含有20ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)或20％L929细胞培养上清的完全培养基的细胞培养皿中，将培养皿置于37℃5％CO2培养箱中培养，这一天为第1天；[0042](8)在第3天的时候，对细胞进行半量换液，此后隔天换液至第7天，进行检测后用于相关实验。
[0043]在一些实施例中，完全培养基含有体积含量为10％的胎牛血清。[0044]在一些实施例中，水浴锅的温度为37℃。[0045]在一些实施例中，离心的转速为800转/分钟，离心时间为5分钟。[0046]在一些实施例中，在第7天的时候，用显微镜观察(200x)细胞，如图2所示，明显可
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说 明 书
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见细胞贴壁，且细胞形态一致。这表明细胞在细胞形态上和巨噬细胞一致，且制备纯度高。[0047]以本发明所获得的小鼠骨髓巨噬细胞进行进一步培养，建立体外细胞模型，为验证小鼠骨髓巨噬细胞在机体免疫中起到的作用提供了基础条件。[0048]本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。
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