浓香型白酒窖泥梭菌群落多样性及高产丁酸梭菌发酵特性研究

浓香型白酒窖泥梭菌群落多样性及高产丁酸梭菌发酵特性研究

浓香型白酒是中国四大基本香型白酒之一,占整个白酒市场份额的70%以上,深受广大消费者的喜爱。窖泥是生产浓香型白酒的必备材料。

生产实践证明,窖泥微生物的种类和数量在很大程度上影响着白酒的风味和口感。梭菌是窖泥中优势微生物之一,直接合成白酒重要的风味物质(如己酸乙酯)或其前体物质(如丁酸、己酸)。

此外,丁酸是合成香料物质及其他精细化工产品的一种非常重要的原料,已经应用到食品、化学、饲料以及医药等多种行业中,市场需求量巨大。目前,关于浓香型白酒窖泥中梭菌群落对白酒风味物质形成的影响及窖泥中高产丁酸的梭菌鲜有研究报道。

本研究以河南某浓香型酒厂50年窖龄窖池的窖泥为研究对象,采用高通量测序技术和传统可培养技术解析窖泥中的梭菌群落多样性,并采用顶空固相微萃取-气质联用技术(HS-SPME-GC-MS)分析窖泥中可培养梭菌发酵液中的挥发性代谢物成分,明晰窖泥中可培养梭菌挥发性代谢物图谱,并开展高产丁酸梭菌的筛选、鉴定及发酵条件优化研究,为采用梭菌定向生物强化手段提升白酒品质和生物发酵丁酸提供理论和技术支撑。主要研究结果如下:(1)分别采用高通量测序技术和传统分离纯化技术对河南某著名浓香型白酒酒厂50年窖龄窖池窖泥中的免培养和可培养梭菌群落多样性进行解析,结果发现免培养条件下梭菌纲中有Clostridiales、Natranaerobiales 2种优势目,Clostridiaceae、Tissierellaceae、Anaerobrancaceae、Eubacteriaceae、Mogibacteriaceae及Lachnospiraceae 6种优势梭菌科,Caldicoprobacter、Sedimentibacter、Clostridium、

Pseudoramibacter_Eubacterium、Garciella、Caloramator、Oxobacter等7个优势梭菌属。

选取相对含量>1%的14个序列作为主要OTU,它们分别与梭菌纲中的

Caloramator quimbayensis、Christensenella timonensis、C.tagluense、Dethiobacter alkaliphilus、C.cellobioparum、Ihubacter massiliensis、Tissierella creatinini、Tissierella praeacuta、Alkalibaculum bacchi、Sedimentibacter acidaminivorans具有最高相似度。从浓香型白酒窖泥中分离出可培养的88株厌氧或兼性厌氧微生物,16S rRNA基因测序及系统发育分析发现,其中75株纯培养物分属于8个系统发育簇(cluster I-VIII),不同发育簇的最高相似梭菌分别为C.tyrobutyricum、C.butyricum、C.indolis、C.acetobutylicum、C.bifermentans、C.sporogenes、C.cadaveris和C.kluyveri,其中C.bifermentans及C.cadaveris第一次在窖泥中分离得到,在一定程度上丰富了窖泥中梭菌物种多样性。

(2)采用顶空固相微萃取和气质联用(HS-SPME-GC-MS)技术对分离出的8个系统发育簇中代表性梭菌菌株的挥发性代谢产物进行检测,共检测到75种挥发性物质,包括醇类23种、酸类20种、酯类14、醛类2种、酮类2种及其它类14种。主成分分析发现,菌株RL1(C.tyrobutyricum)和EL7(C.butyricum)主要与乙酸和丁酸等化合物的形成有关;EL46(C.kluyveri)、RL20(C.acetobutylicum)及RL10(C.indolis)主要与己酸和己酸乙酯等化合物的形成相关;EL12(C.bifermentans)、RL23(C.sporogenes)主要与硫代醋酸S-甲酯、1-癸醇和正辛醇相关;而EL43(C.cadaveris)主要与多种酯类化合物的合成有关。

该结果可为改善窖泥质量、生物强化白酒风味物质形成、呈香物质溯源及白酒异嗅物质控制等提供理论和技术支撑。(3)采用气相色谱法定量分析上述8个系统发育簇中代表性梭菌菌株的产丁酸能力,发现RL1(C.tyrobutyricum)为最佳产丁酸菌株,进而以它为出发菌株,对其培养条件和培养基成分分别进行优化研究。

培养条件的优化采用单因素和正交试验法。优化后的最佳培养条件为:初始pH值为

6.8、装液量为100%、培养温度为34℃、接种量为3%(v/v)、最佳除氧剂为硫代乙醇酸钠、除氧剂添加量为0.5 g/L。

优化后发酵液中丁酸浓度达到10.66 g/L,较优化前(7.52 g/L)提高了41.76%。培养基成分的优化采用响应面分析法,得到的最佳培养基成分为(g/L):葡萄糖85.29,酵母粉7.5,蛋白胨9.37,氯化钠7.5,乙酸钠4.5,磷酸氢二钾2.5,七水合硫酸镁0.3,硫酸铵1.5,七水合硫酸亚铁0.015,硫代乙醇酸钠0.5,碳酸钙11.6。

采用优化后的培养基,发酵获得的丁酸浓度为22.96 g/L,较优化前(14.23 g/L)提高了61.35%。总之,通过对RL1菌株培养条件和培养基的优化,丁酸产量由最初的7.52 g/L提高至22.96 g/L,优化效果显著。