16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

1. 适用范围

本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对 扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。

本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导 信息。

2. 方法和原理

16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴 定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、 DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。

细菌rRNA （核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。 16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用 测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

在16S

rRNA分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利 用恒定区序列设计引物，将16S

rDNA片段扩增出来，禾U用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分 类鉴定。

16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信 息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前 500bp序列即可鉴别出 细菌的菌属。针对科学论文发表或是前 500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrD NA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。

由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性， 通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。

16SrDNA

27F

■

519R

357F ------------------------------------------- ・

----------------------------------------- 1115R

926F ----------------------------------- •

斗 1492R

3对引物正反向测通后，拼接成1500bp左右的16SrDNA序列。

3. 设备和材料

3.1

器材

、1001、10uD ；涡旋振荡器；Eppendof

移液器(lOOO^L 200卩 L

MixMate ;离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱； PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler； 凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000;基因分析仪：AB3500、AB3130 3.2

试剂

DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra ;琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10>Taq

2+

Buffer(Mg), dNTPs, ddH2O等； ExoSAP-IT;测序试剂：BigDye Terminator, 5XSequencing Buffer； BigDye XTerminator Purification Kit ； 3.3

耗材

移液器吸头：1000 卩、200 卩、10 卩、离心管：1.5mL、200 ^L； Micro AmpTM Optical 96-Well Reaction Plate； Micro AmpTM Optical Adhesive Film ； 3.4

引物

名称 正向引物27F 反向引物519R 正向引物357F 反向引物1115R 正向引物926F 反向引物1492R 序列 扩增长度 16SrDNA 第1部分 第2部分 第3部分

5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' 5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3' 5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3' 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3' 5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3' 5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3' 500 bp左右 750bp左右 560 bp左右 其中 M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1 4. 操作流程

核酸提取

基因扩增一＞ 产物纯化一浄测序反应一为序列比对

5. 实验方法

5.1

核酸提取：

挑取单菌落，然后置于装有100pLPrepMan

Ultra的离心管中，涡旋震荡混匀30s左右，然后100C水浴10mi n后，以离心机最 大转速离心3min，取10卩上清液与490卩、

ddH2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR的模板DNA。提取的DNA于- 20 T保存。 5.2

基因扩增

5.2.1 PCR反应体系

试剂 模板DNA Taq 酶(5U/u、) 10XTaq Buffer(Mg2+) dNTPs(各 2.5mM) 引物F(1 MM) 0.2 ML 2.5 ML 2 ML 5 ML 使用量（25卩、体系） 2 M ( 10ng~100ng) 2 / 9

引物R(1 pM) ddH20 5 pL 8.3 pL 模

备注：DNA模板量通常在100 ng以下，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的 DNA板使用量。PCR反应体系应在冰中配置，然后置于冰箱中冷却 3~5min，最后放于PCR仪 上进行反应，这种冷启动法可增强

PCR扩增的特异性。

522 PCR反应条件

94 C： 10mi n 94 C： 30s

'

58 C： 30s 卜 30Cyc

72 C： 45s J 72 C： 5min 4C： g 5.2.3电泳

称取1g琼脂糖置于100mL TAE电泳缓冲液中，加热融化，待温度降至 60 C 左 右 时， 均 匀 铺 板， 制 成 1%的琼脂糖凝胶。PCR反应结束后，加样，以100V电压进行琼脂糖凝胶电泳。 电泳结束后，染色，用凝胶成像仪观察，拍照，记录实验结果。 5.3

产物纯化

5.3.1每5卩LPC产物加入2卩L ExoSAPT试剂，混匀。 5.3.2 放入PCR仪中，37C温育 15min, 80C温育 15min。 5.3.3纯化后的PCR产物做为下一步测序反应的模板。 5.4

测序反应

5.4.1测序反应体系

试剂 模板DNA 引物(1 PM) BigDye Term in ator 5XSeque ncing Buffer

使用量（10 pL体系） 1 pL 1.6 pL 1 pL 1 pL 5.4 pL ddH2O 5.4.2测序反应条件

96C： 2min

96C： 30s

1 1

55C： 15s 60C： 4min 4C：g

；30Cyc

r

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543 测序反应纯化(BigDye XTerminator Purification Kit)

543.1 每管加入 27 ^LSAM Solution 和 6 ^LBigDye XTerminator Solution。 543.2放在 Eppendorf MixMate 上 2000rpm 震荡 30min。 5.4.3.3在离心机上以1000X g离心2min。

543.4每管吸取10^L上清液于96孔板中，放入测序仪中测序。 5.5 序列比对

基因测序仪得到的测序结果，在 MicroSEQ微生物鉴定系统中进行比对，得 到菌种的种属信息。

6. 关键说明

6.1提取细菌基因组DNA时，对于细胞壁比较薄的革兰氏阴性细菌，可挑 取一菌

环菌株，置于100 yL ddH2O 中，混匀，沸水热变性10min后，离心3min分离，稀释50咅后做为PC R模板。必要时做梯度PCR确认最佳的模板量。 6.2 PCR及测序反应时，为了保证酶的活性，整个体系应在冰中配置；然

后置于低温冰箱中冷却3~5min,最后放于PCR仪上进行反应，这种冷 启动法可增强PCR扩增的特异性。

6.3 16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特

异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前 500b

p序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前 500bp无法鉴 别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的 16SrDNA的序列信息。具体参照附录。

PCR出现非特异性条带的原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或

引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低， 及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶 易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出 现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引

物。减低酶量或调

数。

换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次

适当提高退火温度或采用二温度点法(93 C变性，65 C左右退火与延 伸)。

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶 量过

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多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度 过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源 的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低 Mg2+浓度。增加模板量， 减少循环次数。 用RT阴性对照检测是否被基因组 DNA污染。 模板浓度过高 10ul 体系 100ngDNA

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附录

（资料性附录）

1.细菌16SrDNA三部分的PCR结果电泳图

M 1 — 2

3

2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp

M: DL2000 ;

1:引物27F和519R的PCR产物（第1部分500bp） 2:引物357F和1115R的PCR产物（第 2部分750bp） 3:引物926F和1492R的PCR产物（第 3部分560bp）

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2.细菌16SrDNA鉴定结果

2.1 16SrDNA前500bp即可反映细菌的种属信息:

菌株TL140924的鉴定结果

Specimen TL140924 Ubrary Library Entry % Match Nam® 100.0 Consensus Length 492 Library Entry Total Length Ml$rTiatGh«$ 491 0 AB BacterhlS Aarofnonas veronN 0QUb_2.2 (ATCC=35624 A6 Bac OOLIb_2.2 TL140924 Atiro2.2 16SrDNA前500bp不足以反映细菌的种属信息:

菌株70528的鉴定结果

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2.3 16SrDNA的全序列信息：

菌株70528的鉴定结果

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测菌株与库中菌株区分时，则需要测其 16SrDNA全长序列以将其区分

Saknonelh mnsen □味hi (ATCC=1M30) Libraiy Ertr* Name 冒| 9 / 9