复合RT-PCR检测猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟及猪流感等3种病毒方法的建立

现代农业科技圆园13年第17期动物科学复合RT-PCR检测猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟及猪流感等3种病毒方法的建立夏俊1石进纯1袁2成进1*张美玲1袁2陆桂丽1汪萍1渊1新疆畜牧科学院兽医研究所袁新疆乌鲁木齐830000曰2新疆农业大学冤摘要为了快速准确地对猪繁殖与呼吸综合征病毒渊PRRSV冤尧猪瘟病毒渊CSFV冤和猪流感病毒渊SIV冤进行诊断与鉴别诊断袁特进行试验遥根据GenBank上已发表的PRRSV的ORF7基因序列尧CSFV的C基因序列和SIV的M基因序列袁设计合成了3对特异引物袁开展RT-PCR检测方法的研究遥分别建立了PRRSV尧CSFV和SIV的单项RT-PCR诊断方法袁并最终建立了PRRSV尧CSFV和SIV的复合RT-PCR诊断方法袁可分别及同时扩增PRRSV430bp尧CSFV775bp和SIV225bp的特异性片段遥试验证明该方法适用于PRRSV尧CSFV和SIV的诊断及鉴别诊断遥关键词复合RT-PCR曰检测曰猪繁殖与呼吸综合征病毒曰猪瘟病毒曰猪流感病毒中图分类号S852.65文献标识码A文章编号1007-5739渊2013冤17-0275-03渊1VeterinaryResearchInstitute袁XinjiangAcademyofAnimalSciences袁UrumqiXinjiang830000曰2XinjiangAgricultureUniversity冤AbstractInordertodiagnoseanddifferentialdiagnoseforPRRSV袁CSFVandSIV袁thisexperimentwascarriedout.BasedontheORF7genesequencesofPRRSV袁CgenesequencesofCSFVandMgenesequencesofSIVobtainedfromGenBank袁threepairsofprimersweredesignedandusedforRT-PCR.SingleRT-PCRassaysfordiagnosingPRRSV袁CSFVandSIVwereestablished袁themultiplexRT-PCRwasalsodevelopedintheend袁thefragmentsof430bpforPRRSV袁775bpforCSFVand225bpforSIVcouldbeamplifiedinsingleRT-PCRandamultiplexRT-PCRassay.Accordingtothetest袁theRT-PCRassaywassuittodiagnoseanddifferentialdiagnoseforPRRSV袁CSFVandSIV.KeywordsmultiplexRT-PCR曰detection曰porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus曰classicalswinefevervirus曰swineinfluenzavirusEstablishmentofMultiplexReverseTranscriptionPolymeraseChainReactionfortheDetectionofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusandClassicalSwineFeverVirusandSwineInfluenzaVirusXIAJun1SHIJin-chun1袁2CHENGJin1*ZHANGMei-ling1袁2LUGui-li1WANGPing1在引起猪繁殖和呼吸障碍的诸多病原中袁猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒渊porcinereproductiveandrespiratorysyndrome国昌盛生物技术有限责任公司遥GenBank报道的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒ORF7基因猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒诊断用引物基于virus袁PRRSV冤尧猪瘟病毒渊classicalswinefevervirus袁CSFV冤和.com.cn. All Rights Reserved.病毒遥目前袁这3种猪病已遍布美洲尧亚洲尧欧洲和非洲等世[1]猪流感病毒渊swineinfluenzavirus袁SIV冤是较为常见的RNA界各地袁已成为规模化猪场的常发传染病遥PRRSV尧CSFV尧测出病原袁采取有针对性的措施袁是控制此类疾病的前提[2]遥CCAGTCAATCA-3忆曰5忆-GCCCCGATTGAATAGGTG-3忆曰猪瘟列袁扩增的片段为775bp袁引物序列为院5忆-TCGTCAGTAGTTC序列袁扩增的片段为430bp袁引物序列为院5忆-CAGTTCCAGSIV3种病毒严重危害养猪业的发展袁而如何能够准确快速检虽先后有学者开展过用于PRRSV尧CSFV尧SIV诊断的病毒分离试验尧琼脂扩散试验尧酶联免疫吸附试验及RT-PCR试验等袁但存在不同程度的不足[2-3]病毒诊断用引物基于GenBank报道的猪瘟病毒C基因序GACG-3忆曰5忆-TGCTCTTTTGGGGCTAT-3忆曰猪流感病毒诊断用引物基于GenBank报道的猪流感病毒M基因序列袁扩增的片段为225bp袁引物序列为院5忆-CTAACCGAGGTCGAAAC-生物工程有限公司合成遥1.2试验方法1.2.13忆曰5忆-GCGTCTACGCTGCAGTCC-3忆遥上述引物均由上海生工病毒RNA的提取遥取病毒液0.5mL袁加入1mLTotal可以经1次RT-PCR诊断就能同时检测鉴别多种病原袁对混合感染病例的诊断优势更为显著CSFV尧SIV为研究对象袁旨在建立快速尧特异和敏感的RT-[3袁5]RT-PCR技术既具有单纯的RT-PCR技术同样的优点袁又遥本研究以PRRSV尧原混合感染时袁更难以用常规方法做出快速确诊遥复合[4]袁特别是当动物存在多种病RNAExtractor渊Trizol冤渊上海生工生物有限公司冤袁根据产品说明书进行RNA的提取袁并将提取的RNA溶于40滋LDEPC1.2.2单个RT-PCR扩增遥根据设计的PRRSV尧CSFV和SIV提供技术支持遥1材料与方法1.1试验材料PCR及复合RT-PCR诊断方法袁同时为PRRS尧CSF尧SI防控水中遥的引物袁分别进行RT-PCR扩增遥反应在3个0.2mL的离心管中进行袁采用25滋L反应体系遥各反应成分分别为院10伊OneStepRNABuffer2.5滋L袁25mmoL/LMgCl25滋L袁10mmoL/LdNTPMixture2.5滋L袁40U/滋LRNaseInhibitor0.5滋L袁5U/滋L猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒渊PRRSV冤尧猪瘟病毒渊CSFV冤和猪流感病毒渊SIV冤均由新疆畜牧科学院兽医研究10伊FormaldehydeGel-loadingBuffer尧OneStepRNAPCRKit基金项目所保存遥TotalRNAExtractor渊Trizol冤尧DNAMarkerDL2000尧均购自生工生物工程渊上海冤有限公司曰DEPC水购自北京鼎新疆科技厅科技攻关项目野新疆养猪业三种主要疫病防控技术研究与应用冶渊201031106冤遥*通讯作者收稿日期2013-07-12AMVRTaseXL0.5滋L袁5U/滋LAMV-OptimizedTaq0.5滋L袁20滋moL/L上下游特异性引物各0.5滋L袁PRRSV尧CSFV尧SIV于PCR仪渊BiometraTgradient96梯度PCR仪冤中扩增遥反应程序为院50益RT反应30min曰94益RTase失活2min曰94益变性30s袁55益复性30s袁72益延伸1min袁共进行30个循275的RNA各0.5滋L袁加RNaseFreedH2O12~25滋L遥混匀后置动物科学1.0%环袁循环结束后1.2.3琼脂糖凝胶电泳72益袁延伸观察扩增结果10min袁最后降温至遥4益结束遥以复合RT-PCR检测方法的建立遥反应在1个0.2mLBuffer的离心管中进行2.5滋L袁25袁mmoL/L在25滋LMgCl反应体系中加入10伊OneStepRNA2.5滋L袁40U/滋LRNaseInhibitor25滋L0.5袁10滋LmmoL/L袁5U/滋LdNTPAMVMixtureXL1滋L袁5U/滋LAMV-OptimizedTaq1滋L袁20滋moL/LRTase游特异性引物渊PRRSV尧CSFV尧SIV冤各0.5滋L袁PRRSV上下CSFV尧应程序为尧SIV院的50RNA益RT各反应1滋L30袁min加RNase曰94益FreeRTasedH2失活O至225min滋L曰94遥反益变性30s袁56.8益复性30s袁72益延伸1min袁共进行30个循环1.0%袁循环结束后琼脂糖凝胶电泳72益延伸袁观察扩增结果10min袁最后降温至遥4益结束遥以1.2.4260nmRT-PCR和RNA280袁并计算其纯度和含量nm敏感性测定条件下测定提取的遥利用紫外分光光度计遥然后将PRRSV3尧CSFV袁分别在的模板种不同的模和SIV板进行分别进行10倍系列稀释RT-PCR袁从每个稀释浓度中各取扩增袁找出复合RT-PCR1检测的最滋L模板低浓度cDNA遥2结果与分析2.1PRRSV尧CSFV和SIV单个RT-PCR结果2.1.1DNApGEM-T片段与预期大小相当PRRSVRT-PCR遥电泳结果显示袁RT-PCR产物纯化后RT-PCR扩增出目的袁段大小为载体中测序430bp袁经BLAST袁序列分析表明对比袁证明袁所克隆的目的RT-PCR产物为预期DNA连接到片目的DNA片段渊图1冤遥M122000bp1000750bp500bpbp250bp430bp100bp图1猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR扩增结果注院M为DNAMarkerDL2000曰1为PRRSV曰2为空白对照遥2.1.2DNA片段与预期大小相当CSFVRT-PCR遥电泳结果显示袁RT-PCRRT-PCR产物纯化后扩增出目的pGEM-T载体中测序袁序列分析表明袁所克隆的目的袁DNA连接到段大小为775bp袁经BLAST对比袁证明RT-PCR产物为预期片目的DNA片段渊图2冤遥2.1.3SIVRT-PCR遥电泳结果显示RT-PCR扩增出目的DNAT片段与预期大小相当载体中测序袁序列分析表明袁RT-PCR袁所克隆的目的产物纯化后袁连接到DNA片段大小pGEM-DNA为225bp袁经BLAST对比袁证明RT-PCR产物为预期目的276片段渊图3冤遥现代农业科技圆园13年第17期M1221000000bp750500bpbp775bp250bp100bpbp图2猪瘟病毒RT-PCR扩增结果注院M为DNAMarkerDL2000曰1为CSFV曰2为空白对照遥M122000bp1000750bp500bp250bp100bpbp225bp注院M为DNAMarkerDL2000曰1为SIV曰2为空白对照遥图3猪流感病毒RT-PCR扩增结果2.2复合RT-PCR利用3种病毒的上尧下游引物同时在一个PCR反应体系中成功地扩增出PRRSV基因组中的430bp尧CSFV基因组中的775bp和SIV基因组中的225bp3个片段渊图4冤遥12M34521000000bp750bpbp775bp250500bp430225bp100bpbpbp图4猪繁殖与呼吸综合征病毒尧猪瘟病毒和猪流感病毒的复合RT-PCR注院M2.3复合SIV为曰DNART-PCR3为CSFVMarker曰检测方法的敏感性4DL2000为PRRSV曰1为空白对照曰5为SIV遥曰2为PRRSV+CSFV+合RNA3种质量浓度约为的D206nm/D280nm为11.82滋g/滋L袁纯度达到标准渊20滋L超纯水所溶遥不同的模板冤病毒混.com.cn. All Rights Reserved.夏俊等院复合RT-PCR检测猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟及猪流感等3种病毒方法的建立cDNA进行10倍系列稀释袁从每个稀释浓度中各取1滋L模的最低浓度遥结果表明袁当模板分别稀释10尧100和1000倍的时仍然能够扩增出430bp尧775bp和255bp3条带袁但是当模板稀释10000倍的时候就不能扩增出可以识别的条带袁CSFV及SIV模板cDNA渊图5冤遥M122000bp1000bp750bp500bp250bp100bp775bp430bp依靠病理解剖变化和常规病原分离方法对病原的混合感染或继发感染作出快速尧准确的诊断是不切实际的遥本研究利用扩增PRRSV尧CSFV和SIV特异性片段的3对引物在一次PCR反应中扩增出430bp尧775bp和225bp的特异性片段袁并能在模板稀释1000倍时的中仍能检测出特异性条PRRSV尧CSFV和SIV单独或混合感染病原只需3耀5h遥试验建立的PRRSV尧CSFV和SIV单个及复合RT-PCR诊断方法适用于单独或混合感染的快速检测袁为生产实际和病原学研究等工作调查奠定了基础袁也为临床上一些混合感染的病例或复杂发病情况下迅速准确的诊断尧应急处理提供技术支持袁具有非常重要的意义和广阔的应用前景遥[1]李海燕袁于康震袁辛晓光袁等.部分省市猪群猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定[J].动物医学进展袁2003袁24渊3冤院67-72.[2]刘辉袁熊金凤袁邹浩勇袁等.猪繁殖与呼吸综合征病毒和乙型脑炎病毒多重RT-PCR检测方法的建立[J].华中农业大学学报袁2008袁27渊1冤院12-18.[3]刘建柱袁瞿玉东袁李鹏袁等.多重PCR检测猪瘟病毒尧猪细小病毒尧猪伪狂犬病病毒[J].中国兽医学报袁2003袁23渊6冤院535-537.[4]刘维全袁刘海鹏袁江禹袁等.禽流感病毒尧新城疫病毒尧猪瘟病毒和口蹄疫病毒多联PT-PCR诊断技术的建立[J].农业生物技术学报袁2005袁13渊1冤院92-95.[5]鲁承袁金鑫袁杨咏洁.多重PCR在猪传染性萎缩性鼻炎诊断中的应用[J].中国兽医杂志袁2003袁39渊12冤院7-9.[6]李兆龙袁黄梅请袁程晓霞袁等.CSFV袁SIV袁PCV2袁PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国农业通报袁2010袁26渊23冤院18-21.[7]王隆柏袁周伦江袁修金生袁等.用RT-PCR方法检测猪瘟与猪蓝耳病混合感染[J].福建畜牧兽医袁2012袁34渊1冤院7-9.[8]ARORADJ袁NDIAYEM袁DEAS袁etal.Genomicstudyofhemagglutininsofswineinfluenza渊H1N1冤virusesassociatedwithacuteandchronicrespirat-orydiseasesinpigs[J].ArchVirol袁1997袁42渊2冤院401-412.[9]吕晓丽袁崔保安袁陈红英袁等.复合RT-PCR检测猪乙脑病毒和猪流感病毒方法的建立[J].华南农业大学学报袁2008袁29渊4冤院79-82.[10]吕晓丽.猪乙脑病毒RT-PCR尧荧光定量PCR及多重RT-PCR诊断方法建立[D].郑州院河南农业大学袁2008.[11]李小康.猪细小病毒PCR诊断方法建立及标准制订[D].郑州院河南农业大学袁2007.板cDNA分别进行RT-PCR扩增袁找出复合RT-PCR检测由此说明复合RT-PCR可以检测到扩增1000pg的PRRSV尧34带遥复合RT-PCR法具有特异尧快速尧简便等优点[9-11]袁检测4参考文献225bp图5猪繁殖与呼吸综合征病毒尧猪瘟病毒和猪流感病毒复合RT-PCR敏感性试验注院M为DNAMarkerDL2000曰1为PRRSV+CSFV+SIV混合模板稀释10倍曰2为PRRSV+CSFV+SIV混合模板稀释100倍曰3为PRRSV+CSFV+SIV混合模板稀释1000倍曰4为PRRSV+CSFV+SIV混合模板稀释10000倍遥.com.cn. All Rights Reserved.3结论与讨论最近几年规模化养猪发展迅速袁密集型饲养方式及猪群的跨区域流通加快了疾病的传播袁因此患病猪群多呈现混合感染现象[6]遥混合感染使得猪群的发病情况更加复杂袁疫病预防和控制更加困难袁发病尧死亡猪群增多袁养殖户的损失更加惨重袁这是目前养猪业遇到的头疼的问题[7]遥此外袁猪流感还可以感染人袁引起发病甚至死亡袁对人类社会公共卫生安全带来极大的威胁[8]遥渊上接第274页冤法对饲养场的金属设施尧设备消毒曰可用2%烧碱等消毒养畜场的圈舍尧场地尧车辆等曰对于饲养场的饲料尧垫料等袁可以进行深埋或是焚烧处理曰病畜的粪便需要进行密封发酵处理遥4.5人员防护密切接触牲畜及其产品的人员袁应做好个人防护遥助产和诊疗时袁戴口罩尧眼镜和手套袁穿防护衣袁皮肤有伤口者应暂时避免接触家畜遥防护设备应常消毒遥饲养人员每年要定期进行健康检查遥发现患有布鲁氏菌病的应调离岗位袁及时治疗遥4.6宣传培训通过电视尧广播尧宣传册等手段广泛地宣传布鲁氏菌病防控知识袁特别是在牛产犊的季节袁要有针对性地加大宣传力度袁让广大人民群众了解布鲁氏菌病的危害性袁提高群众自我保护的意识和能力遥各级业务部门加强对技术人员开展业务技术培训袁加强专业队伍建设袁提高防控能力和业务水平[9-11]遥[1]吴清民.动物布鲁氏菌病防控技术研究对策[J].兽医导刊袁2010袁151渊3冤院21-23.[2]孙承恩袁马恒之.布鲁氏菌病[M].银川院宁夏人民出版社袁1985.[3]KLANSNIELSEN袁JROBERTDUNCAN.AnimalBrucellosis[M].USA院CRCPress袁1990.[4]还锡萍.布鲁氏菌病的流行病学研究进展[J].江苏卫生保健袁2002渊4冤院176-178.[5]吴清民.兽医传染病学[M].北京院中国农业大学出版社袁2002院187-193.[6]陈溥言.家畜传染病学[M].5版.北京院中国农业出版社袁2006院135-141.[7]张士义袁工森林袁聂志文袁等.国内外防治布鲁氏菌病主要技术措施的实施及评价[J].中国地方病防治杂志袁1999袁14渊6冤院347-350.[8]严玉宝袁胡娟袁周岷江.澳大利亚动物疾病现状及防制措施[J].中国动物检疫袁2010袁21渊7冤院41-43.[9]傅义娟.青海省海东地区牛羊布鲁氏菌病流行病学调查及防制效果分析[D].兰州院甘肃农业大学袁2005.[10]李娜.布鲁氏菌外膜蛋白Omp39和Omp14的原核表达及其免疫原性鉴定[D].保定院河北农业大学袁2008.[11]穆淑宝袁张洪安袁张守波.布鲁氏菌病及其防控技术[J].中国畜牧兽医文摘袁2012渊3冤院98-99.5参考文献277