研究生专业实践计划

姓 名 专业领域 实践单位名称 研究方向 实践目的 （简述） 性质（√） 组长 评审组成员 学号 校内导师 学 院 企业导师 酶与应用微生物 为了鉴定与VPS41基因抗饥饿反应相关的功能区域，本实验将通过功能回补和饥饿实验验证的方法来确定cVPS41p预测的WD和CLH结构域的功能，对鉴定cVPS41p的功能区域具有重要作用。 应用性研究（√ ） 开发性研究（ ） 其他（ ） 职 称 工作单位及职务 签字 生物工程学院 轻工技术与工程 姓 名 校内导师意见： 签字： 年 月 日 企业导师意见： 签字： 年 月 日 学院意见： 主管院长签字： 年 月 日 成绩 （ ）票同意 （ ）票不同意 评价 （ ）通过 （ ）不通过 （学院盖章）

报告日期： 年 月 日

填表说明

1． 专业实践是专业型硕士研究生培养过程中的重要环节，是检验和监督培养过程的重要依据，是学校对专业型硕士研究生毕业进行考核的基本依据。

2． 导师按照本专业培养方案的要求，根据因材施教的原则，结合硕士专业学位研究生本人的特点，全面考虑，合理安排，指导其制订个人实践计划，对其实践目标、内容、方法和进度做出计划和安排。

3． 实践计划一旦确定就应认真遵照执行，无特殊原因，原则上不予更改。因特殊情况确需更改者，应提出书面修改计划申请，经导师和学院同意后报研究生处备案。

4． 实践计划一般应在第二学期初，由导师（课题组）与研究生共同制定，并由导师负责，专业实践领导小组审核签字，方可执行。实践时间不少于半年（应届毕业生不少于1年）。

5． 研究生应按个人专业实践计划进行实习，实践结束后，撰写总结报告。专业实践总结报告应为5000字以上。报告内容一般包括实践的目的和意义、实践内容和实践计划执行情况等。专业实践总结报告最晚在第三学期末进行，报告采取全校公开方式进行。

6． 经专业实践领导小组考核。评价记录为“通过”或“不通过”。“通过”后方能获得学分。

7． 此表一律用A4纸正反面打印，一式1份。申请学位论文答辩时，由各相关学院放入学生本人答辩材料里。

1．拟实践内容概述 (1) 该实践要求的基本理论知识 一、新型隐球菌的概述 新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)是一种重要的条件致病真菌，在自然界分布很广，多存在于土壤、鸽粪及其他鸟粪、桉树花、腐烂的水果和蔬菜中，其中鸽粪被认为是人类感染隐球菌最主要的传染源，我国52%~76%的鸽粪中都能分离到新型隐球菌。一般情况下，它主要感染细胞免疫功能受损的人群：如接受抗肿瘤化疗药物及大量皮质激素治疗的病人、长期使用抗排斥药物的器官移植病人以及艾滋病患者，能引起严重的隐球菌病和隐球菌性脑膜炎。然而临床研究发现：新型隐球菌的格特变种同样能够逃离宿主免疫系统的防卫，侵染免疫能力正常的人群，如免疫能力健全的儿童和妊娠期妇女等。近年来，随着广谱抗菌药物、糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛使用，以及免疫缺陷性疾病和器官移植病例的增加，新型隐球菌引发的感染呈明显上升趋势，其发病率在艾滋病患者中高达6.5%。它也是引发全球性脑膜炎和中枢神经系统死亡疾病的首因。有数据显示，在医学发达地区，艾滋病人患有隐球菌病的概率是5%~10%，发展中国家的隐球菌病发病率为13%~45%；在不发达地区发生率相对较高，大约40%的艾滋病人均会患有隐球菌病；接受过器官移植治疗的患者被新型隐球菌感染的几率为2.8%，但死亡率接近42%。因此，新型隐球菌的研究逐渐引起国内外真菌学家的高度重视。 二、新型隐球菌的分类 隐球菌属包括37个种，但具致病性的主要是新型隐球菌。新型隐球菌在分类上属于担子菌，形状为圆形或卵圆形，直径大约4~8μm，四周包绕一层肥厚的多糖荚膜。经过演化，新型隐球菌被分为：新生变种(C. neoformans var neoformans)、grubii变种(C. neoformans var grubii)、格特变种(C. neoformans var gattii)以及新生变种和grubii变种的杂合体。根据荚膜抗原的结构，可将新型隐球菌分为A、B、C、D与AD型5个血清型。其中，血清型A为新型隐球菌grubii变种，血清型D为新型隐球菌新生变种，血清型B、C为新型隐球菌格特变种，血清型AD是新生变种和grubii变种的杂合体。但目前公认的是2个变种，即新生变种A型、D型和AD型，格特变种的B型和C型。血清型A和血清型D的菌株大都感染免疫功能缺陷的人群，而血清型B和血清型C的菌株则能感染免疫功能健全的人群。鸽子作为隐球菌血清型A和血清型D最主要的携带者，使得这两种血清型的细胞呈现世界范围的广泛分布，从而为新型隐球菌的大范围致病创造了条件。世界各地最普遍的临床分离株也多属A、D型，其中血清型A在临床治疗中的出现率占隐球菌病例的95%，北美洲临床分离的大部分隐球菌病的病原体都是血清型为A的菌株，血清型D菌株引发的感染往往集中在丹麦，法国，意大利等一些欧洲国家；相比之下，血清型B、C型较为少见。我国新型隐球菌的血清型分布特点是：以A型为主，D型少见，有少量的AD型，缺乏C型。而澳大利亚分离出的隐球菌以血清型B为主，占67.7%，与该国桉树的种植和分布有密切关系。新型隐球菌的格特变种曾在温哥华岛造成过一次爆发感染，它是一种可以引起健康个体感染的病原菌，主要见于非洲和澳洲热带地区。 （2）该实践要求的基本内容 新型隐球菌能够在细胞免疫功能受损人群的肺泡巨噬细胞中长期潜伏，待条件适宜时重新活化繁殖，最终在细胞内繁殖并扩散到大脑。这也是该菌导致宿主致病并且病后不易治愈的一个关键环节，但有关新型隐球菌如何在营养匮乏的肺泡巨噬细胞中长时间存活的分子机制仍不清楚。前期研究表明，新型隐球菌H99的VPS41基因定向敲除会导致该菌株抗饥饿能力缺失，致病性完全丧失，在巨噬细胞中的存活能力丧失。为了鉴定与VPS41基因抗饥饿反应相关的功能区域，本实验将通过功能回补和饥饿实验验证的方法来确定cVPS41p预测的WD和CLH结构域的功能，对鉴定cVPS41p的功能区域具有重要作用。本论文的主要研究工作将在以下几个方面展开： ① 通过同源重组对VPS41基因的完整阅读框架（ORF）进行定向敲除，获得突变菌株vps41Δ。并对隐球菌vps41Δ菌株进行5-FOA自发诱变筛选vps41Δ ura5突变株。 ② 通过RT-PCR克隆隐球菌VPS41p预测的WD和CLH结构域序列的cDNA，利用Pactin启动子，ura5筛选标记基因构建相应的组成型表达载体pKAU-WD，pKAU-CLH，pKAU-WD-CLH（不包括两个结构域中间的305个氨基酸）。 ③ 以新型隐球菌vps41Δ ura5突变株为出发菌株，构建表达WD结构域的重组菌pKAU-WD，表达CLH结构域的重组菌pKAU-CLH，表达WD+CLH结构域的重组菌pKAU-WD-CLH以及以及VPS41基因的回补菌株vps41Δ∷VPS41。 ④ 对获得的重组菌株进行抗饥饿能力分析。 （3）该实践预期成果 本研究围绕新型隐球菌重要的致病因子之一，参与调控饥饿信号途径的重要功能基因VPS41展开，采用功能回补和饥饿实验验证的方法来确定cVPS41p预测的WD40和Clathrin结构域的功能。得出主要结论如下： (1) 通过同源重组的方法对VPS41基因的完整阅读框架（ORF）进行敲除，构建了新型隐球菌vps41Δ突变株。并将含有VPS41基因ORF的载体引入vps41Δ ura5细胞，获得回补菌株vps41Δ∷VPS41。 (2) 通过5-FOA自发诱变，筛选vps41Δ ura5突变株。以尿嘧啶缺陷型为筛选标记，成功构建组成型表达载体pKAU-WD，pKAU-CLH以及pKAU-WD-CLH，并将其引入vps41Δ ura5细胞，获得相应的重组菌株。 (3) 对重组菌株进行体外氮源饥饿实验显示：单独表达WD或CLH结构域都不能明显增加vps41Δ突变株抗饥饿能力（氮源饥饿36 h存活率约为30%，vps41Δ突变株为20%，野生型为75%），而表达WD+CLH结构域的重组菌株pKAU-WD-CLH能显著回补vps41Δ在氮源饥饿条件下的成活率（氮源饥饿36 h存活率约为50%，vps41Δ突变株为20%，野生型为75%）。以上结果表明在氮源饥饿条件下WD和CLH结构域都是VPS41p的功能区域，且隐球菌VPS41p需要WD和CLH两个结构域行使其抗氮源饥饿功能。 2．实践进度 时间 2013.5~2013.11

内容 分析新型隐球菌VPS41p结构域的功能 地点 要求 备注 掌握相关技术要点