(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 106520589 A (43)申请公布日 2017.03.22
(21)申请号 201510586702.7(22)申请日 2015.09.15
(71)申请人江苏海阔生物医药有限公司
地址224500 江苏省盐城市滨海经济开发区
沿海工业园中山路6号(72)发明人苗玉武 吕祖平 刘永刚 王丹丹
刘言华(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)C12P 21/02(2006.01)
权利要求书1页 说明书3页 附图1页
(54)发明名称
一种万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法(57)摘要
本发明公开一种万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法，将万古霉素生产菌株进行液体发酵培养基培养，所得溶液为含净抗生素活性洗脱液。本发明采用核糖体诱变选育的手段进行万古霉素生产菌株选育，获得一株东方拟无枝酸菌Amycolatopsis orientalis万古霉素生产菌株，该菌株万古霉素的生产能力比出发菌株提高了7.12倍，高达8.9g/L。且经过传代稳定性研究，连续传代5次后万古霉素产量稳定性高达92.7％。
C N 1 0 6 5 2 0 5 8 9 A CN 106520589 A
权 利 要 求 书
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1.一种万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将万古霉素生产菌株进行液体发酵培养基培养，液体发酵种子培养基组成为酵母粉3～6g/L，麦芽提取物3～5g/L，蛋白胨10～15g/L，葡萄糖15～20g/L，pH为6.8；种子培养条件为：28～30℃，装液量40/250mL，摇床转速150～220rpm，培养24～48h；液体发酵培养基组成为糊精100～150g/L，土豆蛋白15～25g/L，黄豆粉15～25g/L，磷酸氢二钾0.1～0.5g/L，消沫剂1～3g/L，氯化钠1.2～1.6g/L，pH 6.8～7.2，培养条件为28～30℃，装液量40/250mL，摇床转速150～220rpm，培养90～130h，所得溶液为含净抗生素活性洗脱液；
b、在沉淀容器中沉淀步骤a中所得的含净抗生素活性洗脱液，得到晶体浆料，并且搅拌该晶体浆料，将PH值连续调节至所需程度，直至完全沉淀，得到晶体沉淀物；
c、将步骤b得到的晶体沉淀物溶解为水溶液，然后通过阴离子交换树脂将其转为万古霉素。
2.根据权利要求1所述的一种万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法，其特征在于，根据步骤b中，通过在含净抗生素活性洗脱液中加入与水互溶的有机溶剂来结晶，结晶前溶液中万古霉素含量为5.0％～30.0％。
3.根据权利要求2所述的一种万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法，其特征在于，所述机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮。
4.根据权利要求3所述的一种万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法，其特征在于，所述机溶剂加入量为：甲醇为2～6倍结晶液体积；乙醇为1.5～5.5倍结晶液体积；异丙醇为1.2～5倍结晶液体积；丙酮为1.0～4.5倍结晶液体积。
5.根据权利要求1所述的一种万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法，其特征在于，根据步骤b中，结晶过程起始温度为25～60℃；结晶过程终点温度为0～30℃；结晶过程降温速度为0.5～5℃/分钟。
6.根据权利要求1所述的一种万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法，其特征在于，根据步骤c中，晶体用水溶解后的万古霉素浓度为1.0％～20.0％。
7.根据权利要求1所述的一种万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法，其特征在于，根据步骤c中，所述阴离子交换树脂为717树脂、D293树脂或D301FD树脂。
8.根据权利要求7所述的一种万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法，其特征在于，所述阴离子交换树脂用量按制备1克万古霉素需要用2～10mL的阴离子交换树脂计。
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说 明 书
一种万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法
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技术领域
本发明涉及产万古霉素的技术领域，尤其涉及一种万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法。
[0001]
背景技术
万古霉素是由McCormick等(McCormick MH，Stark WM，Plttenger GE，
et al.Vancomycin，a new antibiotic[J].Chemical and biological properties，1955-1956，23：601-611)于1956年从印度尼西亚土壤中选育到的一株被称为东方拟无枝酸菌Amycolatopsis orientalis的发酵液中分离得到的具有抗革兰氏阳性菌的一种糖肽类抗生素。万古霉素问世后的20年，由于青霉素和头孢菌素类抗生素的上市使用及其很强的耳肾毒性，它仅作为保留药物，用于治疗由少数耐药性金黄色葡萄球菌引起的严重感染性疾病，临床使用很少。后来随着β-内酰胺类抗生素的大量使用，由甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)所引起的感染逐渐流行。1998～2000年间，MRSA占金黄色葡萄球菌的比例高达30％以上。在这种情况下，万古霉素愈来愈受人们的重视，成为目前临床上用于治疗由MRSA引起的严重感染疾病的首选药物(RimakrishnanI N.Antibacterial activities and modes of action of vancomycin and relatedglycopeptides[J].Antimicrobical agents chem，并被国际抗生素专家誉为“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”和“王牌抗生素”。由于万古霉素作用机制独特，而且在体内易分解，使其不仅在临床上，而且在畜牧等行业上也得到了广泛的应用。
[0003] 目前万古霉素的生产主要采用培养生产万古霉素的东方拟无枝酸菌Amycolatopsisorientalis的方法获得，但菌株生产能力有限。研究人员通过各种手段对菌株进行分离、选育或突变，获得了一些万古霉素生产菌株，但耗时耗力。核糖体突变选育的方法通过引入某些抗生素对菌体核糖体蛋白合成的相关基因进行刺激，使得抗生素基因超量表达，从而提高菌株生产能力，是一种简单有效的菌株诱变选育方法。发现将链霉素抗性引入野生的d蓝色链霉菌，可以使放线菌紫红素产量提高10倍，利用联合诱变先后引入d蓝色链霉菌，使得放线菌红素产量最大提高了48倍。将这一技术应用于Bacillus属和Pseudomonas属，使其抗生素产量提高5～50倍。
[0002]
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法。
[0005] 本发明的技术方案如下：本发明提供一种万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法，包括以下步骤：
[0004]
a、将万古霉素生产菌株进行液体发酵培养基培养，液体发酵种子培养基组成为酵母粉3～6g/L，麦芽提取物3～5g/L，蛋白胨10～15g/L，葡萄糖15～20g/L，pH为6.8；种子培养条件为：28～30℃，装液量40/250mL，摇床转速150～220rpm，培养24～48h；液
[0006]
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说 明 书
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体发酵培养基组成为糊精100～150g/L，土豆蛋白15～25g/L，黄豆粉15～25g/L，磷酸氢二钾0.1～0.5g/L，消沫剂1～3g/L，氯化钠1.2～1.6g/L，pH 6.8～7.2，培养条件为28～30℃，装液量40/250mL，摇床转速150～220rpm，培养90～130h，所得溶液为含净抗生素活性洗脱液；[0007] b、在沉淀容器中沉淀步骤a中所得的含净抗生素活性洗脱液，得到晶体浆料，并且搅拌该晶体浆料，将PH值连续调节至所需程度，直至完全沉淀，得到晶体沉淀物；[0008] c、将步骤b得到的晶体沉淀物溶解为水溶液，然后通过阴离子交换树脂将其转为万古霉素。
[0009] 本发明优选的，根据步骤b中，通过在含净抗生素活性洗脱液中加入与水互溶的有机溶剂来结晶，结晶前溶液中万古霉素含量为5.0％～30.0％。[0010] 本发明优选的，所述机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮。[0011] 本发明优选的，所述机溶剂加入量为：甲醇为2～6倍结晶液体积；乙醇为1.5～5.5倍结晶液体积；异丙醇为1.2～5倍结晶液体积；丙酮为1.0～4.5倍结晶液体积。[0012] 本发明优选的，根据步骤b中，结晶过程起始温度为25～60℃；结晶过程终点温度为0～30℃；结晶过程降温速度为0.5～5℃/分钟。[0013] 本发明优选的，根据步骤c中，晶体用水溶解后的万古霉素浓度为1.0％～20.0％。
[0014] 本发明优选的，根据步骤c中，所述阴离子交换树脂为717树脂、D293树脂或D301FD树脂。
[0015] 本发明优选的，所述阴离子交换树脂用量按制备1克万古霉素需要用2～10mL的阴离子交换树脂计。
[0016] 本发明的有益效果如下：[0017] 采用上述方案，本发明采用核糖体诱变选育的手段进行万古霉素生产菌株选育，获得一株东方拟无枝酸菌Amycolatopsis orientalis万古霉素生产菌株，该菌株万古霉素的生产能力比出发菌株提高了7.12倍，高达8.9g/L。且经过传代稳定性研究，连续传代5次后万古霉素产量稳定性高达92.7％。附图说明
[0018]
图1为本发明所述一种万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法的流程图。
具体实施方式
[0019] 以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。[0020] 请参阅图1，本发明提供一种万古霉素菌株及其发酵产万古霉素的方法，包括以下步骤：
[0021] a、将万古霉素生产菌株进行液体发酵培养基培养，液体发酵种子培养基组成为酵母粉3～6g/L，麦芽提取物3～5g/L，蛋白胨10～15g/L，葡萄糖15～20g/L，pH为6.8；种子培养条件为：28～30℃，装液量40/250mL，摇床转速150～220rpm，培养24～48h；液体发酵培养基组成为糊精100～150g/L，土豆蛋白15～25g/L，黄豆粉15～25g/L，磷酸氢二钾0.1～0.5g/L，消沫剂1～3g/L，氯化钠1.2～1.6g/L，pH 6.8～7.2，培养条件为
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说 明 书
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28～30℃，装液量40/250mL，摇床转速150～220rpm，培养90～130h，所得溶液为含净抗生素活性洗脱液；[0022] b、在沉淀容器中沉淀步骤a中所得的含净抗生素活性洗脱液，得到晶体浆料，并且搅拌该晶体浆料，将PH值连续调节至所需程度，直至完全沉淀，得到晶体沉淀物；[0023] c、将步骤b得到的晶体沉淀物溶解为水溶液，然后通过阴离子交换树脂将其转为万古霉素。
[0024] 根据步骤b中，通过在含净抗生素活性洗脱液中加入与水互溶的有机溶剂来结晶，结晶前溶液中万古霉素含量为5.0％～30.0％。[0025] 所述机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮。[0026] 所述机溶剂加入量为：甲醇为2～6倍结晶液体积；乙醇为1.5～5.5倍结晶液体积；异丙醇为1.2～5倍结晶液体积；丙酮为1.0～4.5倍结晶液体积。[0027] 根据步骤b中，结晶过程起始温度为25～60℃；结晶过程终点温度为0～30℃；结晶过程降温速度为0.5～5℃/分钟。[0028] 根据步骤c中，晶体用水溶解后的万古霉素浓度为1.0％～20.0％。[0029] 根据步骤c中，所述阴离子交换树脂为717树脂、D293树脂或D301FD树脂。[0030] 所述阴离子交换树脂用量按制备1克万古霉素需要用2～10mL的阴离子交换树脂计。
[0031] 实施例：
[0032] 本发明包括以下步骤：[0033] a、将万古霉素生产菌株进行液体发酵培养基培养，液体发酵种子培养基组成为酵母粉4g/L，麦芽提取物5g/L，蛋白胨12g/L，葡萄糖18g/L，pH为6.8；种子培养条件为：30℃，装液量189mL，摇床转速187rpm，培养48h；液体发酵培养基组成为糊精150g/L，土豆蛋白25g/L，黄豆粉25g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，消沫剂2g/L，氯化钠1.3g/L，pH 7.2，培养条件为28℃，装液量245mL，摇床转速220rpm，培养110h，所得溶液为含净抗生素活性洗脱液；
[0034] b、在沉淀容器中沉淀步骤a中所得的含净抗生素活性洗脱液，得到晶体浆料，并且搅拌该晶体浆料，将PH值连续调节至所需程度，直至完全沉淀，得到晶体沉淀物，通过在含净抗生素活性洗脱液中加入与水互溶的有机溶剂来结晶，结晶前溶液中万古霉素含量为30.0％，所述机溶剂为甲醇，所述机溶剂加入量为：甲醇为5倍结晶液体积，结晶过程起始温度为45℃；结晶过程终点温度为26℃；结晶过程降温速度为4℃/分钟；[0035] c、将步骤b得到的晶体沉淀物溶解为水溶液，然后通过阴离子交换树脂将其转为万古霉素，晶体用水溶解后的万古霉素浓度为20.0％，所述阴离子交换树脂为D293树脂，所述阴离子交换树脂用量按制备1克万古霉素需要用7mL的阴离子交换树脂计。[0036] 综上所述，采用上述方案，本发明采用核糖体诱变选育的手段进行万古霉素生产菌株选育，获得一株东方拟无枝酸菌Amycolatopsis orientalis万古霉素生产菌株，该菌株万古霉素的生产能力比出发菌株提高了7.12倍，高达8.9g/L。且经过传代稳定性研究，连续传代5次后万古霉素产量稳定性高达92.7％。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和
原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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说 明 书 附 图
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图1
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