浓香型白酒窖泥理化性质及高通量法分析窖泥微生物

李俊辉;张志伟;刘英杰;杨平平;王燕

【摘 要】采用华北地区浓香型白酒企业的窖泥为实验材料,对其理化性质及微生物菌群进行了研究.发现:随着窖龄的增长,窖泥中的水分前五年下降较快,随后呈缓慢下降趋势,最终稳定在33％左右,而且窖壁泥的含水量小于窖底泥;窖泥的pH为5.0～7.0,且窖壁泥的pH小于窖底泥pH;窖泥土壤有效磷、速效钾等物质随着窖龄的增长也呈增加趋势.采用高通量分析,研究窖泥样品中微生物的群落结构,解析浓香型白酒不同窖龄窖泥中优势微生物和特征微生物,为人工窖泥的培养、浓香型白酒质量的提高提供理论依据.

【期刊名称】《山东轻工业学院学报（自然科学版）》 【年(卷),期】2018(032)006 【总页数】4页(P25-28)

【关键词】浓香型白酒;理化性质;窖泥微生物;高通量测序 【作 者】李俊辉;张志伟;刘英杰;杨平平;王燕

【作者单位】齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物工程学院,济南250353;齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物工程学院,济南250353;齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物工程学院,济南250353;齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物工程学院,济南250353;齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物工程学院,济南250353 【正文语种】中 文 【中图分类】Q93-3

窖泥是浓香型酒品质的保障。研究窖泥的理化性质,改善微生物的发酵环境,为白酒的酿造提供品质保障。此外,窖泥中微生物的种类、数量、种群间的相互作用及代谢的多样性同样影响着白酒的品质[1]。随着科技的发展,涌现出了许多研究窖池环境微生物的新方法。本文运用高通量测序技术,建立了一套分析窖泥细菌群落的方法,准确、完整解析了浓香型白酒的窖泥中细菌的群落结构,为窖泥中微生物菌群的研究提供了理论依据。 1 材料与仪器 1.1 样品来源

窖泥样品来源于华北地区某酒厂。 1.2 试剂及仪器 1.2.1 试剂

细菌总DNA提取试剂盒购,自北京天根生化科技公司;Taq Master Mix,购自南京诺唯赞生物科技有限公司;San Prep柱式DNA胶回收试剂盒,购自上海生工股份有限公司;DNA Marker 2000,购自南京诺唯赞生物科技有限公司。 1.2.2 仪器

离心机(TGL-16B);电泳仪(BG-Power 600i);PCR仪(MG-96G);紫外凝胶成像系统(BIORAD);Mettler Toledo pH计。 2 实验方法 2.1 窖泥取样方法

分别从0、5、10、15、20、30 年的窖池的壁和底部不同位置采用五点取样法取10 g酒窖用泥。 2.2 理化指标检测方法 2.2.1 pH

将新鲜窖泥与超纯水1∶3(W/V)比例混合均匀,然后用pH计测定其pH。 2.2.2 含水量

新鲜窖泥在105℃ 条件下烘干2 h,根据窖泥样品烘干前后的质量差计算样品含水量[2-3]。

2.2.3 速效钾和有效磷

速效钾检测方法：火焰光度法[4],用 mg/kg表示;有效磷检测方法：0.5 mol/L NaHCO3浸提-钼锑抗比色法。 2.3 高通量测序 2.3.1 供试样品

华北地区北部某酒厂窖龄分别为5年和15年的窖中泥、窖壁泥和窖底泥,每个样品取样采用五点混合并混匀的方式,样品置于4℃的冰箱中储存。6个样品及其编号见表1。

表1 采集的窖泥样品及编号窖龄 窖中泥 窖壁泥 窖底泥5年 JSJA1 JSJA2 JSJA3 15年 JSJB1 JSJB2 JSJB3 2.3.2 土壤细菌总DNA提取

分别取等量(0.3 g)窖泥样品,使用土壤基因组DNA提取试剂盒提取总DNA,每个样品提取3个,保证实验结果的可靠性。总DNA于-20℃下冷冻保存备用。 2.3.3 样品16SrDNA V3可变区的扩增和高通量测序

选用细菌16S rDNA通用引物,对样品进行PCR扩增。反应体系：Taq Master Mix 10μL、模版1μL、正反引物各0.5μL,用DD H2O(双蒸水)补足20μL。反应条件：94℃变性10 min;94℃ 40 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s,30次循环;72℃延伸10 min。扩增产物纯化回收,基因测序由中科院成都生物研究所通过上海派森诺生物科技股份有限公司进行高通量测序完成。 3 结果与讨论

3.1 窖泥pH的变化

pH是影响环境微生物生理代谢活动的重要指标,与功能菌的生长有密切关系。随着窖泥窖龄的增长,其pH会出现不同程度的变化。pH太高或者太低都会影响微生物新陈代谢,因此维持适合产香功能菌生长的窖泥pH的稳定显得尤为重要。 按窖泥取样方法,分别从窖池的壁和底部取样,按2.2.1方法测定窖泥的pH,结果见图1。

图1 窖泥的pH变化图

由图1可知,窖壁泥的pH会随着窖龄的增长呈现下降的趋势,由最初的pH 7的中性窖泥慢慢变成酸性,最终会维持在pH 5左右;而窖底泥的pH则会由中性变为偏碱性,从最初的 pH 7变为pH 7.5。窖壁泥和窖底泥的pH变化有差异：窖壁泥pH在下降,这是因为窖壁泥透气性较好,含氧量相对较高,由于某些不当操作,导致常年使用的窖壁泥滋生大量的乳酸菌,产生过多的乳酸,导致pH下降;而窖底泥pH较为稳定,且随着时间的积累表现为中性偏弱碱性。该研究结果与张宿义等[5]、景晓卫等[6]报道的基本一致。土壤细菌数量与pH呈显著正相关,中性pH和较高水平的生物多样性有利于生态功能的正常发挥。因此,窖底泥偏中性pH的环境可能更有利于白酒发酵生产,这在一定程度上可解释为何下层酒糟所产白酒酒质往往优于上层酒糟。

3.2 窖泥含水量的比较

水在白酒酿造过程中具有举足轻重的作用,对窖泥来说尤为重要。窖泥含水量过高会导致窖泥挂壁难甚至垮窖,水分缺失又会导致窖泥板结、盐类析出、窖泥中部分微生物死亡,最终导致窖泥老化[7-9],严重影响生产。

按窖泥取样方法,分别从不同窖龄的窖池的壁和底部取样,按2.2.2方法测定窖泥的含水量,结果见图2。 图2 窖泥含水量变化图

由图2可知,五年窖龄的窖壁泥和窖底泥含水量下降较快,而随着窖龄的增长,含水量呈缓慢下降趋势,最终窖泥的最佳含水量为33%左右。窖壁泥的含水量略低于窖底泥,推测其原因,可能是在生产过程中物料反复出入窖池,导致窖壁泥水分蒸发。此外,窖泥含水量虽是一个重要指标,但其检测结果受较多因素影响,如：不同地区、不同酒厂生产工艺差别较大,黄水的不同提取方式以及提取时间、黄水坑在窖池中的分布位置和窖泥取样的时间等,都会对窖泥含水量测定结果造成影响。 3.3 窖泥土壤中的有效磷和速效钾的含量变化

窖泥的品质与多种无机盐有关。磷、钾是微生物生长繁殖以及生理代谢不可缺少的微量元素,其含量过高或过低对酒质均有影响。窖泥中的有效磷不仅是窖泥微生物繁殖的必需物质,又是合成蛋白质的重要物质[10]。磷是参与乙醇、乙酸合成己酸的重要物质,所以窖泥中速效磷含量不仅影响己酸菌的数量,而且影响浓香型酒主体香味物质己酸乙酯的产率。窖泥中的有效钾主要是指水溶性钾,是微生物必需的无机盐[11-12]。

按窖泥取样方法,分别从不同窖龄的窖池的壁和底部取样,按2.2.3方法测定窖泥中有效磷和速效钾含量,结果见图3。 图3 窖泥中的有效磷、速效钾含量变化图

由图3可知：随窖龄的增长,窖泥中的有效磷和速效钾含量都会上升,而且窖壁泥中的速效钾在15～30年升高较快;同一窖龄窖池的窖底泥中速效钾含量高于窖壁泥,这是因为生产过程中酒醅、酒曲和水的循环使用使得窖泥中有效磷和速效钾含量累积增加。随着窖龄的增加,窖泥组成和微生物菌系不断变化,窖泥生态环境逐渐适合微生物的生长繁殖,窖泥微生物逐步增多,窖泥和微生物互相影响、互相促进,使窖泥中有效磷和速效钾含量不断上升,进一步提高了窖泥质量。 3.4 窖泥微生物种群群落组成分析

目前,对不同窖龄窖泥中活性微生物演替规律研究较多[13],对不同性状窖泥微生物

群落结构差异研究较少。高通量测序技术以其成本低、通量高、信息丰富等特点普遍应用于窖泥微生物群落结构研究[14]。

对5年和15年窖龄的窖壁、窖中和窖底泥,按窖泥取样方法取样,通过高通量测序,从门水平和属水平分析群落组成及丰度,结果如图4、图5所示。 图4 门水平的群落分类学组成和丰度分布图 图5 属水平的群落分类学组成和丰度分布图

高通量测序结果显示：窖泥相关细菌归属于19个门。对门水平上相对丰度前20位的细菌分析,结果如图5所示。两种年限窖泥中优势菌门主要有两个：

Firmicutes(硬壁菌门)和Proteobacteria(变形菌门)。其中Firmicutes为绝对优势菌门(71.8% ～97.6%),样品JSJB2中Proteobacteria比例最高(2.9%)。 在属水平,丰度排名前二十的细菌分布如图6所示。年限不同的窖池中,主要菌属是有所不同的。在5年窖池中优势菌属有：Lysinibacillus(杆菌属)占59.6% ～71.3%,Clostridium_sensu_stricto_1(梭菌属)占12.7% ～

14.9%,Clostridium_sensu_stricto_13占4.3%～5.5%。且各菌属在不同部位比例相差不大。在15年窖池中优势菌属有：Clostridium_sensu_stricto_12占20.6% ～56.5%,Virgibacillus(硫胺素芽孢杆菌属)占21.9% ～38.2%,Clostridium_sensu_stricto_1占1.9% ～9.2%。其中Clostridium_sensu_stricto_12在窖底泥中的比例最

高,Clostridium_sensu_stricto_1在窖底泥中比例最低。可见,15年窖池窖底泥中菌属比例较另外两种样品差异比较大。 4 结论与展望

通过对华北地区浓香型白酒企业窖泥的理化性质和微生物种群进行研究,发现随着窖龄的增长,窖壁泥中的含水量和pH均有不同程度的下降,而有效磷和速效钾的含量均有不同程度的上升。采用高通量测序,从门水平和属水平解析了5和15年窖龄

窖泥的微生物种群,发现同一窖龄的不同位置的窖泥中微生物的差异性不大,但随着窖龄的增长,窖泥中的微生物的丰富度有明显提高。

浓香型白酒的品质与窖泥息息相关。由于窖泥中微生物的复杂性,需要利用现代分子生物学手段对生产过程中的不同窖池窖泥中功能微生物的多样性进行详细研究,以期更好地指导白酒生产,提高浓香型白酒的品质。 参考文献：

【相关文献】

[1] 沈怡方.白酒生产技术全书[M].北京：中国轻工业出版社,2013：8-10.

[2] YAN H,CAI Z C,ZHONG W H.PLFA analysis and its applicationsin the study of soil microbial diversity[J].Acta Pedologica Sinica,2006,43(5)：851-859.

[3] EICKHORST T,TIPPKTTER R.Improved detection of soilmicroorganisms using fluorescence in situ hybridization(FISH)and catalyzed reporter deposition(CARD～FISH)[J].Soil Biology Biochemistry,2008,40(7)：1883-1891.

[4] 王金晶.常规火焰光度法测定复混肥中氧化钾的方法改进[J].磷肥与复肥,2011,26(3)：64-66. [5] 张宿义,许德富.泸型酒技艺大全[M].北京：中国轻工业出版社,2011.

[6] 景晓卫,唐玉明,任道群,等.人工老窖发展及其研究现状[J].酿酒科技,2010(9)：77-80.

[7] 邢德峰,任南琪,宋业颖,等.PCR-DGGE分析产氢发酵系统微生物群落动态及其种群多样性[J].生态学报,2005,25(7)：296-301.

[8] 苏慧玉,钟雨,沈勇.窖泥中的水分、腐殖酸对窖泥质量的影响[J].酿酒,1996(5)：11.

[9] 谢军,朱莉莉,邓波,等.浓香型白酒窖泥水分含量与水分活度的对比研究[M].中国酿造,2018,37(1)：79-82.

[10] 卜宇宏.浓香型有机窖泥的研究[J].酿酒,2011(4)：35-38.

[11] 江源.《泸型酒技艺大全》通过科研立项[J].酿酒科技,2010(8)：39.

[12] 杨剑虹,王成林,代亨林.土壤农化分析与环境监测[M].北京：中国地质大学出版社,2008.

[13] 王明跃,张文学,王海英,等.不同窖龄窖泥细菌的系统发育多样性分析[J].食品科学,2013,34(11)：177-181.

[14] 楼骏,柳勇,李延.高通量测序技术在土壤微生物多样性研究中的研究进展[J].中国农学通报,2014,30(15)：256-260.