天龙药业有限公司 文件编号 制订人 制订日期 发布日期 颁发部门 SOP ZL0034 文件 名称 审核人 紫外分光光度法检测规程 批准人 批准年 月 日 日期 序页/总页 1/9 审核年 月 日 日期 年 月 日 03 年 月 日 生效日期 分发部门 年 月 日 版本号 质量部 QC室
1. 目的：
建立用紫外分光光度法检测药品质量的标准操作规程，保证标准操作。 2. 依据：
《中华人民共和国药典》（2010年版二部）附录。 3. 范围：
本标准适用于用紫外分光光度法进行的检测。 4. 职责：
QC检验员对本标准的实施负责。 5. 程序：
5.1. 定义：紫外-可见分光光度法是通过被测物质在紫外光区的特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法，本法在药品检验中主要用于药品的鉴别、检查和含量测定。
5.1.1. 定量分析通常选择在物质的最大吸收波长处测出吸收度，然后用对照品或百分吸收系数求算出被测物质的含量，多用于制剂的含量测定。
5.1.2. 对已知物质定性可用吸收峰波长或吸收度比值作为鉴别方法；若化合物本身在紫外光区无吸收，而杂质在紫外光区有相当强度的吸收，或在杂质的吸收峰处化合物无吸收，则可用本法作杂质检查。
5.2. 原理：物质对紫外辐射的吸收，是由于分子中原子的外层电子跃迁所产生的，因此，
文件编号 SOP ZL0034 文件 名称 紫外分光光度法检测规程 序页/总页 2/9
紫外吸收主要决定于分子的电子结构，故紫外光谱又称电子光谱。有机化合物分子结构中如含有共轭体系、芳香环或发色基团，均可在近紫外区（200-400nm）或可见光区（400-850nm）产生吸收。通常使用的紫外分光光度计的工作波长范围为190—900nm，因此又称紫外—可见分光光度计。紫外吸收光谱为物质对紫外区辐射的能量吸收图。朗伯·比耳（lambert—Beer）定律为光的吸收定律，它是紫外分光光度法定量分析的依据，其数学表达式为：
A=lg
1 T
=ECL
式中：A 为吸收度 T 为透光率 E 为吸收系数 C 为溶液浓度 L 为光路长度
若溶液的浓度（C）为1%（g/ml），光路长度（L）为1cm，相应的吸收系数为百分吸收１％表示。若溶液的浓度（C）为摩尔浓度（mol/L）系数，以E１，光路长度为1cm时，则ｃｍ相应吸收系数为摩尔吸收系数，以ε来表示。
5.3. 仪器：
5.3.1. 紫外-可见分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器、记录仪、显示系统和数据处理系统等部分组成。
5.3.2. 为了满足紫外—可见光区全波长范围的测定，仪器备有二种光源，即氘灯和碘钨灯，前者用于紫外区，后者用于可见光区。
5.3.3. 单色器通常由进光狭缝、出光狭缝、平行光装置、色散元件、聚焦透镜或反射镜等组成，色散元件有棱镜和光栅二种，棱镜多用天然石英或熔融硅石制成，对200—400nm波长光的色散能力很强，对600nm以上波长的光色散能力较差，棱镜色散所得的光谱为非匀排光谱。光栅系将反射或透射光经衍射而达到色散作用，故常称为衍射光栅，光栅光谱是按波长作线性排列，故为匀排光谱，双光束仪器多用光栅为色散元件。
5.3.4. 检测器有光电管和光电倍增管二种。
5.3.5. 紫外-可见分光光度计依据其结构和测量操作方式的不同，可分为单光束和双光束
文件编号 SOP ZL0034 文件 名称 紫外分光光度法检测规程 序页/总页 3/9
分光光度计二类。单光束分光光度计有些仍为手工操作，即固定在某一波长，分别测量比较空白、样品或参比的透光率或吸收度，操作比较费时，用于绘制吸收光谱图时很不方便，但适用于单波长的含量测定。双光束分光光度计藉扇形镜交替切换光路，使光分成样品（S）和参比（R）两光束，并先后到达检测器，检测器信号经调制分离成两光路对应信号，信号的比值直接用记录仪记录，双光束分光光度计操作简单，测量快速，自动化程度高，但作含量测定时，为求准确起见，仍宜用固定波长测量方式。
5.4. 紫外-可见分光光度计的检定： 5.4.1. 波长准确度：
5.4.1.1. 波长准确度的允差范围：紫外-可见分光光度计波长准确度允许误差，紫外区为1.0nm，500nm处±2.0nm，700nm处±4.8nm。
5.4.1.2. 波长准确度检定方法：用低压汞灯检定，关闭光源，将汞灯（用笔式汞灯最方便）直接对准进光狭缝，如为双光束仪器，用单光束能量测定方式，采用波长扫描方式，扫描速度“慢”（如15nm/min），响应“快”，最小狭缝宽度（如0.1nm）量程0—100%，在200—800nm范围内单方向重复扫描3次，由仪器识别记录各峰值（若仪器无“峰检测”功能，必要时可对指定波长进行“单峰”扫描）。单光束仪器以751G型为例，可将选择开关放在×0.1位置，透光率读数放在100（或选择开关放在×1，透光率放在10），关小狭缝，打开光闸门，缓缓转动波长盘，寻找汞灯546.07nm峰出现的位置，若与波长读数不符，应调节仪器左侧准直镜的波长调整螺丝。如波长向短波长方向移动，应顺时针方向旋转波长调整螺丝，如向长波长方向移动，则应反时针方向旋转波长调整螺丝，调整好后，再按汞灯的下列谱线测试，记录每条谱线与仪器波长读数的误差。用于检定紫外-可见分光光度计的汞灯谱线波长：237.83、253.65、275.28、296.73、313.16、334.15、365.02、404.66 （紫色）、435.83（蓝色）、546.07（绿色）、 576.96（黄色）。用仪器固有的氘灯检定：本法主要用于日常工作中波长准确度的核对，取单光束能量测定方式，测量条件同上述低压汞灯的方法，对486.02及656.10nm二单峰进行单方向重复扫描3次。
5.4.1.2.3. 用钬玻璃检定：将钬玻璃放入样品光路，参比光路为空气，按测定吸收光谱图方法测定。校正自动记录仪器时，应考虑记录仪的时间常数，测定样品与校正时取同一扫描速度。氧化钬玻璃在波长279.4、287.5、333.7、360.9、418.7、460.0、484.5、536.2、
文件编号 SOP ZL0034 文件 名称 紫外分光光度法检测规程 序页/总页 4/9
637.5nm波长处有尖锐的吸收峰，可供波长检定用。钬玻璃因制造的原因，每片氧化钬的吸收峰波长有差异，另外，在放置过程中也会发生波长漂移，因此需定期由计量部门校验。 5.4.1.2.4. 用高氯酸钬溶液检定：本法可供没有单光束测定功能的双光束紫外分光光度计波长准确度检定用。
高氯酸钬溶液的配制方法：取10%高氯酸为溶剂，加入氧化钬（HO2O3），配成4%溶液即得。高氯酸钬溶液较强的吸收峰波长为241.13、278.10、287.18、333.44、345.47、361.31、416.28、451.30、485.29、536.64、640.52nm。
如果是双光束扫描仪器，但不是数据贮存型的，记录的波长可能因记录笔滞后而非真实波长，为了准确测定，建议采用定点检定而不用扫描方式。
5.4.2. 吸收度准确度：精密称取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，置1000ml量瓶中，用硫酸液（0.005mol/L）溶解并稀释至1000ml，用配对的1cm石英池，以硫酸液
１％，
（0.005mol/L）为空白，在235、257、313、350nm分别测定吸光度，然后换算成E１ｃｍ测得值应符合下表中规定的允差范围。
分光光度法允差范围
波长（nm） 235 257 313 350 吸收度强度 最小 最大 最小 最大 １％） 吸收系数（E１ｃｍ124.5 144.0 48.62 106.6 允差范围 123.0—126.0 142.8—146.2 47.0—50.3 105.5—108.5 分辨率、杂散光、基线平直度、稳定度、绝缘电阻等项检定，按国家技术监督局J “双光束紫外-可见分光光度计检定规程”JJG682—90检定，应符合有关项下的规定。日常使用中，对以上两项，即波长和吸光度准确度应根据需要随时检查。
5.5. 样品测定操作方法：
5.5.1. 吸收系数测定（性状项下）：按各该品种项下规定的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测吸光度，并计算吸收系数，应符合规定范围。
5.5.2. 鉴别及检查：按各该品种项下规定的方法，测定供试品溶液在有关波长处的最大
文件编号 SOP ZL0034 文件 名称 紫外分光光度法检测规程 序页/总页 5/9
及最小吸收，有的并须测定其各最大吸收峰值，或最大吸收与最小吸收的比值，均应符合规定。
5.5.3. 含量测定：一般有以下几种方法。
5.5.3.1. 对照品比较法：按各该品种项下规定的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分规定量的100%±10%，所用溶剂也应完全一致，，在规定的波长处测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度。
5.5.3.2. 吸收系数法：按各该品种项下配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时，吸收系数通常应大于100，并注意仪器的校正和检定。
5.5.3.3. 计算分光光度法：计算分光光度法有多种，使用时应按各品种项下规定的方法进行。当吸光度处在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定时，波长的微小变化可能对测定结果造成显著影响，故供试品和对照品的测试条件应尽可能一致。计算分光光度法一般不宜用作含量测定。
5.5.3.4. 比色法：供试品本身在紫外—可见区没有强吸收，或在紫外光区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，可加入适当的显色剂，使反应产物的最大吸收移至可见光区，这种测定方法称为比色法。
用比色法测定时，由于显色时影响显色深浅的因素较多，应取对照品或标准品同时操作。除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样方法处理。在规定的波长处测定对照品和供试品溶液的吸光度后，按上述 5.5.3.1.法计算供试品浓度。当吸光度和浓度关系不呈良好线性时，应取数份梯度量的对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后测定各份溶液的吸光度，然后以吸光度与相应的浓度绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度，并求出其含量。
5.6. 注意事项：
5.6.1. 试验中所用的量瓶、移液管均应经检定校正、洗净后使用。
5.6.2. 使用的石英吸收池必须洁净。用于盛装样品、参比及空白溶液的吸收池，当装入同一溶剂时，在规定波长处测定吸收池的透光率，如透光率相差在0.3%以下者可配对使用，
文件编号 SOP ZL0034 文件 名称 紫外分光光度法检测规程 序页/总页 6/9
否则必须加以校正。
5.6.3. 取吸收池时，手指拿毛玻璃面的两侧。装盛样品溶液，以池体积的4/5为度，测定挥发性溶液时应加盖，透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净，检视应无残留溶剂，为防止溶剂挥发后溶质残留在池子的透光面，可先用醮有空白溶剂的擦镜纸擦拭，然后再用干擦镜纸拭净。吸收池放入样品室时应注意每次放入方向相同。使用后用溶剂及水冲洗干净，晾干防尘保存。吸收池如污染不易洗净时，可用硫酸，发烟硝酸（3：1V/V）混合液稍加浸泡后，洗净备用。如用铬酸钾清洁液清洗时，吸收池不宜在清洁液中长时间浸泡，否则清洁液中的铬酸钾结晶会损坏吸收池的光学表面，并应充分用水冲洗，以防铬酸钾吸附于吸收池表面。
5.6.4. 含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末端吸收。因此当作溶剂使用时，他们的使用范围均不能小于截止使用波长。例如甲醇、乙醇的截止使用波长为205nm。另外，当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸收。因此，在测定前应先检查所用的溶剂在测定供试品所用的波长附近是否符合要求，可用1cm石英吸收池盛溶剂，以空气为空白，测定其吸光度，应符合下表规定。
以空气为空白测定溶剂在不同波长处的吸收度的规定
波长范围（nm） 220—240 241—250 251—300 300以上
吸收度 <0.4 <0.2 <0.1 <0.05
每次测定时应采用同一厂牌批号，混合均匀的一批溶剂。称量应按药典规定要求。配制测定溶液时，稀释转移次数应尽可能少；转移稀释时，所取容积一般应不少于5ml。含量测定供试品应取2份，如为对照品比较法， 对照品一般也应称取2份。吸收系数检查也应称取供试品2份，平行操作，每份结果对平均值的偏差应在±0.5%以内。作鉴别或检查可取样品1份。
5.6.5. 供试品测试液的浓度，除各该品种项下已有注明外，供试品溶液的吸收度以在0.3—0.7之间为宜，吸光度在此范围误差较小，并应结合所用仪器吸光度线性范围，配制合适的读数浓度。
5.6.6. 选用仪器的狭缝宽度应小于供试品的吸收带的半宽度的十分之一，否则测得的吸光度会偏低，狭缝宽度的选择应以减小狭缝宽度时供试品的吸光度不再增加为准，对于中国药典紫外测定的大部分品种，可以使用2nm缝宽，但对某些品种如青霉素钾及钠的吸收度
文件编号 SOP ZL0034 文件 名称 紫外分光光度法检测规程 序页/总页 7/9
检查则用1nm缝宽或更窄，否则其264nm的吸收度会偏低。
5.6.7. 测定时除另有规定外，应在规定的吸收峰±2nm处，再测几点的吸光度，以核对供试品的吸收峰位置是否正确，并以吸光度最大的波长作为测定波长。除另有规定外吸光度最大波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内，否则应考虑试样的同一性、纯度以及仪器波长的准确度。由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸光度后应减去空白读数，或由仪器自动扣除空白读数后再计算含量。
当溶液的PH值对测定结果有影响时，应将供试品溶液和对照溶液的PH值调成一致。稀释时，所取容积一般应不少于5ml。含量测定供试品应取2份，如为对照品比较法，对照品一般也应称取2份。吸收系数检查也应称取供试品2份，平行操作，每份结果对平均值的偏差应在±0.5%以内。作鉴别或检查可取样品1份。
5.6.8. 供试品测试液的浓度，除各该品种项下已有注明外，供试品溶液的吸收度以在0.3—0.7之间为宜，吸光度在此范围误差较小，并应结合所用仪器吸光度线性范围，配制合适的读数浓度。选用仪器的狭缝宽度应小于供试品的吸收带的半宽度的十分之一，否则测得的吸光度会偏低，狭缝宽度的选择应以减小狭缝宽度时供试品的吸光度不再增加为准，对于中国药典紫外测定的大部分品种，可以使用2nm缝宽，但对某些品种如青霉素钾及钠的吸收度检查则用1nm缝宽或更窄，否则其264nm的吸收度会偏低。
5.6.9. 测定时除另有规定外，应在规定的吸收峰±2nm处，再测几点的吸光度，以核对供试品的吸收峰位置是否正确，并以吸光度最大的波长作为测定波长。除另有规定外吸光度最大波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内，否则应考虑试样的同一性、纯度以及仪器波长的准确度。
5.6.10. 用于制剂含量测定时，应注意供试液与对照液的pH值是否一致，如pH值对吸收有影响，则应调溶液的pH值一致后再测定吸收度。
5.7. 结果计算：
5.7.1. 对照品比较法：可根据供试品溶液及对照品溶液的吸光度与对照品溶液的浓度以正比法算出供试品溶液的浓度，再计算含量。
A样：A对=C样：C对 C样=A样/A对×C对
文件编号 SOP ZL0034 文件 名称 紫外分光光度法检测规程 序页/总页 8/9
式中：A为吸光度值；C为测试液浓度（以mg/ml计）。
１％，即在指定波长时，光路长
5.7.2. 吸收系数法：中国药典规定的吸收系数，系指E１ｃｍ
１％值比
度为1cm，试样浓度换算为1%（g/ml）时的吸光度值，故应先求出被测样品的E１ｃｍ较，可计算出供试样品的含量。 A
１％
E１ｃｍ（样品）=——— CL
式中：A为供试品溶液测得的吸光度值；
C为供试品溶液的百分浓度，即100ml中所含溶质的克数； L为吸收池的光路长度（cm）；
供试品的含量%=
１％
E１ ｃｍ（样品）１％E１ ｃｍ（标准）
×100%
１％
式中：E１ｃｍ（样品）为根据前式计算出的供试品的百分吸收系数；
１％
E１ｃｍ（标准）为药典或标准中规定的百分吸收系数。 5.8. 吸收系数测定法：本法主要用于新品种的吸收系数测定。
5.8.1. 测定方法：取精制样品，精密称取一定量，使样品溶液配成吸光度读数在0.6—0.8之间，置1cm吸收池中，在规定波长处按5.6.8.项的规定测出读数，然后再用同批溶剂将其稀释1倍，使吸光度在0.3—0.4之间，再按上述方法测定。样品应同时测定2份，同一台仪器测定的2份间相对误差应不超过±0.5%，否则应重测。测定时先按仪器正常灵敏度测试，然后再减小狭缝测定，直到减小狭缝吸光度值不增加为止，取吸光度不改变的数据。再用4台不同型号的仪器复测。
吸收系数可根据比耳—朗伯定律求算，以下例说明：已知某化合物的分子量为287，用乙醇配成浓度为0.0030%的溶液，在波长297nm处，用1cm石英池，测得吸收度为0.6139，
１％值及克分子吸收系数ε值。 求E１ｃｍ
0.6139
１％E１ｃｍ297nm=A/CL=------------=205
0.0030×1
文件编号 SOP ZL0034 文件 名称 紫外分光光度法检测规程 序页/总页 9/9
0.6139
ε297nm=A/CL=---------------------=5873
1000
0.0030×-----
100
-------------------×1
287 5.8.2. 测定注意事项：
5.8.2.1. 样品应为精制品，水分应另取样测定，扣除干燥失重。
5.8.2.2. 所用的容量仪器及分析天平应经过检定，如果有误差应加上校正值。
5.8.2.3. 测定所用的溶剂，其吸光度应符合规定，吸收池应于临用时配对。或作空白配对。 5.8.2.4. 称取样品时，其称量准确度应符合中国药典规定要求。
5.8.2.5. 所用的分光光度计应经过严格检定，特别是波长准确度和吸光度精度要进行校正。要注明测定时的温度。
6. 附：仪器使用记录 ZL0092
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容