(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 111474255 A(43)申请公布日 2020.07.31
(21)申请号 202010298150.0(22)申请日 2020.04.16
(71)申请人 上海中科新生命生物科技有限公司
地址 201109 上海市闵行区园美路58号1幢
15楼(72)发明人 郭士博
(74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务
所(普通合伙) 11350
代理人 肖平安(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)G01N 30/06(2006.01)G01N 30/34(2006.01)G01N 30/72(2006.01)
权利要求书2页 说明书5页 附图3页
(54)发明名称
一种基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法
(57)摘要
本发明提供一种基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，其采用干血片样本结合高效液相色谱-质谱联用分析，不仅降低了样本用量，仅需要约相当于12 L全血量的干血片样本，相对于现有技术中的分析方法，本发明提供的分析方法在分析流程、时长和灵敏度方面均具有明显优势，建立了一种样本消耗量低、准确、灵敏和快速的25羟基维生素D分析方法。
CN 111474255 ACN 111474255 A
权 利 要 求 书
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1.一种基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1配制标准工作液和质控工作溶液，分别称量25-羟维生素D2标准品和25-羟维生素D3标准品，使用甲醇溶解成标准品溶液，将两种标准品溶液混合成标准品混合液母液，所述的标准品混合液母液中两种标准品的浓度比是25-羟维生素D2：25-羟维生素D3＝1：4；用甲醇将标准品混合液母液稀释成系列浓度梯度的标准品混合液，为标准工作液；再用甲醇将标准品混合液母液稀释成质控浓度溶液，为质控工作溶液；
步骤S2全血基质准备,取抗凝全血，离心去除上层血浆，使用磷酸缓冲盐溶液对沉淀进行多次复溶清洗，按体积比例血细胞：牛血清白蛋白溶液＝55：45加入7％的牛血清白蛋白溶液，混匀备用；
步骤S3干血片标准曲线及质控样本制备，取若干份步骤S2中处理过的全血基质，分别加入系列浓度的标准工作液，配制成系列标准曲线溶液，混合均匀，再分别从系列标准曲线溶液中取出血液滴于血滤纸片上，晾干待用；
再取若干份步骤S2中处理过的全血基质，分别加入质控工作溶液，配制成质控溶液，混合均匀，再分别从质控溶液中取出血液滴于血滤纸片上，晾干待用；
步骤S4样本前处理，从步骤S3中获得的各血滤纸片中将带有血液样本的部分打出，分别置于含有内标品的甲醇中，涡旋，再使用超声波辅助萃取；干燥萃取液并加入4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮溶液，混匀后反应20-40min，加入乙醇终止反应，干燥，再加入70％甲醇复溶，得待分析样本溶液备用；
步骤S5，将步骤S4获得的各待分析样本溶液分别进行高效液相色谱-质谱分析。2.根据权利要求1所述的基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，其特征在于，所述的标准工作液的各系列浓度和质控工作溶液的浓度如下：
6个浓度的标准工作液组成系列浓度的标准工作液。
3.根据权利要求1所述的基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，其特征在于，所
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权 利 要 求 书
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述的步骤S2中的抗凝全血是EDTA-K2抗凝全血；所述的离心条件是3500r/min离心15min；所述的使用磷酸缓冲盐溶液对沉淀进行多次复溶清洗是加入3倍血细胞体积的1x磷酸缓冲盐溶液，混合均匀，再3500r/min离心15min，重复清洗3-5次；所述的1x磷酸缓冲盐溶液的pH 7.4。
4.根据权利要求1所述的基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，其特征在于，所述的步骤S3中的系列标准曲线溶液中的25-羟维生素D2的浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、25、50ng/mL：25-羟维生素D3的浓度分别为2.0、4.0、10、20、100、200ng/mL；所述的步骤S3中的质控溶液中的25-羟维生素D2的浓度分别为1.5、10、40ng/mL：25-羟维生素D3的浓度分别为6、40、160ng/mL。
5.根据权利要求1所述的基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，其特征在于，所述的步骤S4中的甲醇的内标品为25-羟维生素D2-d3和25-羟维生素D3-d3，浓度均为20ng/mL；所述的涡旋时间是5s；所述的超声波辅助处理时间是30min，超声波频率为40kHz；所述的干燥为使用氮气吹干。
6.根据权利要求1所述的基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，其特征在于，所述的步骤S5中的色谱条件是：柱温45℃；相关液相梯度如下：
时间(min)流速(mL/min)流动相A流动相B0.000.630700.600.61991.800.61991.810.630703.000.63070流动相的A相是含0.1％FA的10mM甲酸铵水溶液；B相是含0.1％FA的10mM甲酸铵的甲醇溶液。
7.根据权利要求1所述的基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，其特征在于，所述的步骤S5中的质谱条件是：正离子模式下采用ESI离子源，多反应检测扫描；
离子对分别为：代谢物Q1(m/z)Q3(m/z)25-羟维生素D2570.4298.225-羟维生素D3558.4298.225-羟维生素D2-d3573.4301.225-羟维生素D3-d3561.4301.2源参数，气帘气：25；碰撞气：7；化合物参数：去簇电压是40；碰撞能量是20；入口电压是是10；碰撞室出口电压是15。
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说 明 书
一种基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法
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技术领域
[0001]本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法。
背景技术
[0002]维生素D(VitaminD)为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素，它是一种脂溶性维生素，维生素D缺乏会引起佝偻病、手足抽搐、软骨病等疾病，但是长期摄入过多的维生素D，将引起血管和器官钙化。因此定期检测人体内维生素D的水平，对于衡量人体维生素D补充效果，及维持人体健康具有重要的意义。
[0003]维生素D的主要组成成分是维生素D2和D3两种化合物，两者在肝脏中代谢形成25-OHD，在肾脏中进一步代谢形成1,25(OH)2D。在血液中，维生素D的最主要存在形式为25-OHD，约占维生素D总量的95％，且半衰期最长，性质非常稳定。目前，国际上大多认为25-OHD是衡量体内可利用维生素D水平的最佳指标。[0004]目前，检测维生素D的方法有酶联免疫法、放射免疫法、液相色谱法及液相色谱质谱法等。免疫学方法由于存在抗体交叉反应及25-OHD2和25-OHD3识别不一致的问题，检测准确性备受质疑。LCMS/MS分析技术特异性高，被认为时检测25-OHD的金标准，使用LCMS/MS同时测定25-OHD2和25-OHD3的方法已见报道，但样本用量通常较大，实践过程中常常无法获取足量样品用于检测。
发明内容
[0005]基于现有技术存在上述问题，本发明的目的是提供一种基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，其采用干血片样本结合高效液相色谱-质谱联用分析，不仅降低了样本用量，仅需要约相当于12μL全血量的干血片样本，相对于现有技术中的分析方法，本发明提供的分析方法在分析流程、时长和灵敏度方面均具有明显优势，建立了一种样本消耗量低、准确、灵敏和快速的25羟基维生素D分析方法。[0006]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：[0007]一种基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，包括如下步骤：[0008]步骤S1配制标准工作液和质控工作溶液，分别称量25-羟维生素D2标准品和25-羟维生素D3标准品，使用甲醇溶解成标准品溶液，将两种标准品溶液混合成标准品混合液母液，所述的标准品混合液母液中两种标准品的浓度比是25-羟维生素D2：25-羟维生素D3＝1：4；用甲醇将标准品混合液母液稀释成系列浓度梯度的标准品混合液，为标准工作液；再用甲醇将标准品混合液母液稀释成质控浓度溶液，为质控工作溶液；[0009]步骤S2全血基质准备,取抗凝全血，离心去除上层血浆，使用磷酸缓冲盐溶液(PBS)对沉淀进行多次复溶清洗，按体积比例血细胞：牛血清白蛋白(BSA)溶液＝55：45加入7％的牛血清白蛋白(BSA)溶液，混匀备用；
[0010]步骤S3干血片标准曲线及质控样本制备，取若干份步骤S2中处理过的全血基质，
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说 明 书
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分别加入系列浓度的标准工作液，配制成系列标准曲线溶液，混合均匀，再分别从系列标准曲线溶液中取出血液滴于血滤纸片上，晾干待用；[0011]再取若干份步骤S2中处理过的全血基质，分别加入质控工作溶液，配制成质控溶液，混合均匀，再分别从质控溶液中取出血液滴于血滤纸片上，晾干待用；[0012]步骤S4样本前处理，从步骤S3中获得的各血滤纸片中将带有血液样本的部分打出，分别置于含有内标品的甲醇中，涡旋，再使用超声波辅助萃取；干燥萃取液并加入4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)溶液，混匀后反应20-40min，加入乙醇终止反应，干燥，再加入70％甲醇复溶，得待分析样本溶液备用；[0013]步骤S5，将步骤S4获得的各待分析样本溶液分别进行高效液相色谱-质谱分析。[0014]根据以上方案，所述的标准工作液的各系列浓度和质控工作溶液的浓度如下：
[0015]
6个浓度的标准工作液组成系列浓度的标准工作液。[0017]根据以上方案，所述的步骤S2中的抗凝全血是EDTA-K2抗凝全血；所述的离心条件是3500r/min离心15min；所述的使用磷酸缓冲盐溶液(PBS)对沉淀进行多次复溶清洗是加入3倍血细胞体积的1x磷酸缓冲盐溶液(PBS)，混合均匀，再3500r/min离心15min，重复清洗3-5次；所述的1x磷酸缓冲盐溶液(PBS)的pH 7.4。[0018]根据以上方案，所述的步骤S3中的系列标准曲线溶液中的25-羟维生素D2的浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、25、50ng/mL：25-羟维生素D3的浓度分别为2.0、4.0、10、20、100、200ng/mL；所述的步骤S3中的质控溶液中的25-羟维生素D2的浓度分别为1.5、10、40ng/mL：25-羟维生素D3的浓度分别为6、40、160ng/mL。[0019]根据以上方案，所述的步骤S4中的甲醇的内标品为25-羟维生素D2-d3和25-羟维生素D3-d3，浓度均为20ng/mL；所述的涡旋时间是5s；所述的超声波辅助处理时间是30min，超声波频率为40kHz；所述的干燥为使用氮气吹干。[0020]根据以上方案，所述的步骤S5中的色谱条件是：柱温45℃；相关液相梯度如下：
[0016]
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说 明 书
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时间(min)流速(mL/min)流动相A流动相B0.000.630700.600.61991.800.61991.810.630703.000.63070
[0022]流动相的A相是含0.1％FA的10mM甲酸铵水溶液；B相是含0.1％FA的10mM甲酸铵的甲醇溶液。
[0023]根据以上方案，所述的步骤S5中的质谱条件是：正离子模式下采用ESI离子源，多反应监测扫描(MRM)；
[0024]离子对(m/z)分别为：
代谢物Q1(m/z)Q3(m/z)25-羟维生素D2570.4298.225-羟维生素D3558.4298.225-羟维生素D2-d3573.4301.225-羟维生素D3-d3561.4301.2
[0026]源参数，气帘气(CUR)：25；碰撞气(CAD)：7；[0027]化合物参数：去簇电压(DP)是40；碰撞能量(CE)是20；入口电压是(EP)是10；碰撞室出口电压(CXP)是15。
[0028]本发明的有益效果是：[0029]1)涉及试剂种类少，仅为甲醇、乙醇、乙腈和4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)溶液；极大的缩减了分析时间，即将色谱分析时间缩短至3min，前处理步骤涉及的超声萃取和衍生化时间总计1h。
[0030]2)拓宽了内标的选择范围，采用了双内标，提高了分析结果的准确度，准确度好、灵敏度高和实用性强。
[0031]3)采用干血片(DBS)采样法不受地域和时间限制，且干血片(DBS)样本便于储存，具有很好的生物安全性。
附图说明
[0032]图1是实施例中25-OHD2和25-OHD3的标准曲线图；
[0033]图2是实施例中25-OHD2的LLOQ(0.5ng/mL)色谱图及内标25-OHD2-d3的色谱图。[0034]图3是实施例中25-OHD3的LLOQ(2.0ng/mL)色谱图及内标25-OHD3-d3的色谱图。具体实施方式
[0035]下面结合附图与实施例对本发明的技术方案进行说明。[0036]一种基于干血片样本检测25羟基维生素D的方法，包括如下步骤：[0037]步骤S1配制标准工作液和质控工作溶液，分别称量25-羟维生素D2标准品和25-羟维生素D3标准品，使用甲醇分别溶解并配制成50μg/mL的25-羟维生素D2标准品和100μg/mL的25-羟维生素D3标准品，再将两种标准品溶液按1：2的体积混合成标准品混合液母液，即
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[0025]
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标准品混合液母液中两种标准品的浓度比是25-羟维生素D2：25-羟维生素D3＝1：4；用甲醇将标准品混合液母液稀释成系列浓度梯度的标准品混合液，为标准工作液；再用甲醇将标准品混合液母液稀释成质控浓度溶液，为质控工作溶液；
[0038]所述的标准工作液的各系列浓度和质控工作溶液的浓度如下：
[0039]
[0040]
6个浓度的标准工作液组成系列浓度的标准工作液。
[0042]步骤S2全血基质准备,取EDTA-K2抗凝全血，3500r/min离心15min，去除上层血浆，再加入3倍血细胞体积的1x磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4)，混合均匀，再3500r/min离心15min，重复加入磷酸缓冲盐溶液离心清洗5次，再按体积比例血细胞：牛血清白蛋白溶液＝55：45加入7％的牛血清白蛋白溶液，混匀，得全血基质备用。[0043]步骤S3干血片标准曲线及质控样本制备，取六份步骤S2中处理过的全血基质，每份76μL，分别每份加入4μL不同浓度的标准工作液，即一份全血基质加入一个浓度的标准工作液，配制成六个浓度的系列标准曲线溶液，系列标准曲线溶液中的25-羟维生素D2的浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、25、50ng/mL：25-羟维生素D3的浓度分别为2.0、4.0、10、20、100、200ng/mL，混合均匀，再分别从系列标准曲线溶液中取出75μL血液滴于血滤纸片上，晾干待用；
[0044]再取三份步骤S2中处理过的全血基质，每份76μL，分别每份加入4μL不同浓度的质控工作溶液，即一份全血基质加入一个浓度的质控工作溶液，配制成三个浓度的质控溶液，质控溶液中的25-羟维生素D2的浓度分别为1.5、10、40ng/mL：25-羟维生素D3的浓度分别为6、40、160ng/mL，混合均匀，再分别从质控溶液中取出75μL血液滴于血滤纸片上，晾干待用。[0045]步骤S4样本前处理，用直径为6mm的打孔器从步骤S3中获得的各血滤纸片中将带有血液样本的部分打出，分别置于2mL离心管中，再加入500μL含有内标品的甲醇中，内标品为25-羟维生素D2-d3和25-羟维生素D3-d3，浓度均为20ng/mL，涡旋5s，再使用40kHz的超声波处理30min辅助萃取；转移萃取液450μL到新的1.5mL离心管中,使用氮气吹干，再加入100
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[0041]
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μL的4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮溶液，混匀后反应30min，加入20μL乙醇终止反应，使用氮气吹干，再加入60μL的70％甲醇复溶，得待分析样本溶液，待分析样本溶液转移至96孔板中等待上机。[0046]步骤S5，将步骤S4获得的各待分析样本溶液分别进行高效液相色谱-质谱分析，所述的步骤S5中的色谱条件是：柱温45℃；相关液相梯度如下：
[0047]
[0048]
流动相的A相是含0.1％FA的10mM甲酸铵水溶液；B相是含0.1％FA的10mM甲酸铵的甲醇溶液，色谱分析结果如图2和图3。[0050]质谱条件是：正离子模式下采用ESI离子源，多反应检测扫描；[0051]离子对分别为：
[0052]
[0049]
[0053][0054]
代谢物Q1(m/z)Q3(m/z)25-羟维生素D2570.4298.225-羟维生素D3558.4298.225-羟维生素D2-d3573.4301.225-羟维生素D3-d3561.4301.2源参数，气帘气：25；碰撞气：7；化合物参数：去簇电压是40；碰撞能量是20；入口电压是是10；碰撞室出口电压是
15。
[0055]
采用内标法建立标准曲线，如图1结果表明，25-OHD2在0.5-50ng/mL范围内线性关
系良好；25-OHD3在2.0-200ng/mL范围内线性关系良好。
[0056]以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
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