细胞穿透肽设计及肿瘤靶向治疗

细胞穿透肽设计及肿瘤靶向治疗黄发军1　张华文2

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湖北民族学院医学院，恩施 445000

恩施市计划生育服务站，恩施 445000

摘要: 细胞穿透肽是近年来发现的具有穿透生物膜功能，并能介导大分子物质跨膜转导的一类小分子短肽。该肽段以其转导效率高，速度快，生物活性好，对细胞损害小等特点，成为药物导向治疗方法研究领域的热点。肿瘤靶向治疗的一个局限性是不能使药物有效地进入肿瘤细胞内，极大地降低了肿瘤靶向药物治疗的疗效。因此，如何使抗癌药物特定输送至肿瘤细胞群是当前亟需研究设计的课题，本文就特异性靶向穿膜肽在肿瘤靶向治疗方面的设计、应用作一综述。关键词： 细胞穿透肽；肿瘤靶向；细胞器靶向中图分类号：R966

细胞穿透肽(cell-penetrating peptide, CPP)是一类能穿透细胞胞膜和/或核膜的短肽，并且能引导与其相连的多肽、蛋白质或其他生物活性分子进入细胞内。CPP膜穿透功能为基础生命科学研究开辟了一个新领域，很快被应用到蛋白质药物的靶向和导入技术研究中，为推动基因工程药物发展，建立高效、安全的蛋白质分子导入技术提供了非常有价值的载体工具。1988年Frankel等[1]首次发现人免疫缺陷病毒(HIV)的转录调节蛋白可以穿透细胞膜、核膜进入细胞核。近年又相继发现了几个膜穿透肽，如ANTP (Antennapedia)、VP22(viral protein 22)及各种合成的短肽，如多聚精氨酸、transportan(序列为gWTLN-SAgYLLgKINLKALAALAKKIL)等。CPP的研究为向细胞内转运生物活性大分子(蛋白质、核酸等)药物提供了一个新的有力工具。1. CPP在肿瘤化疗中的作用用于肿瘤治疗的很多治疗物质必须进入肿瘤细胞内部才能发挥作用，而大部分这些物质其本身很难穿透细胞膜进入肿瘤细胞内部。应用穿膜肽可以从三个方面靶向肿瘤：(1)对于肿瘤特异性激活信号转导途径的关键性转录因子进行失活突变，使其能

收稿日期：2010-09-09

作者信息：黄发军(1975-)，男，讲师，通讯作者，E-mail: hfjzfh@yahoo.com.cn；张华文(1968-)，男，主治医师，E-mail：454424870@qq.com.cn

与该关键性转录因子竞争结合，但不产生转录活性，通过与穿膜肽融合将关键分子携带入胞，从而关闭该信号转导途径[2-5]。(2)用穿膜肽导入肿瘤细胞已失活的转录因子，激活抑制肿瘤的生成[6-8]。(3)利用肿瘤细胞特异性激活的一些蛋白酶，通过其凋亡基因插入该酶的切割位点，因此只要有该酶存在，就可以产生凋亡蛋白，从而特异性杀死肿瘤细胞[9,10]。目前这些方法还处于初步实验阶段，还有很多问题需要解决，如穿膜肽通常局限于内含体，装载功能分子的方法繁琐，细胞器的靶向功能弱，其穿入机制也不明确，诱发针对穿膜肽的免疫反应会干扰它在体内的疗效。

目前国内外对特异性结合CPP携带化疗药物进入肿瘤细胞做了较为深入的研究，将肿瘤细胞特异CPP作为靶向治疗的载体与某些化疗药物进行融合，能直接将药物带入细胞内，发挥其最大的治疗作用，克服了传统方法的不足之处，比鼠源性的单克隆抗体等更适合用于导向药物载体，在肿瘤靶向治疗中已取得了较好的疗效。由于短肽可以特异性的将化疗药物带到肿瘤细胞内，在总用药量较低的情况下仍然能够大大的提高肿瘤细胞内的药物浓度，所以特异性CPP介导的靶向治疗，降低了化疗药物的用药量，提高了肿瘤细胞内的药物浓度，因此也降低了化疗的不良反应。目前这方面的研究主要分为提高现有CPP的靶向性以及寻找具有靶向作用的新的CPP。

● 小综述《生命的化学》2011年31卷2期CHEMISTRY OF LIFE 2011，31(2)· 195 ·研究表明，肿瘤组织中的血管及淋巴管内皮细胞表面一些分子的表达有异于正常组织。Myrberg等[11]研究发现归巢肽PEgA(一类能选择性地与肿瘤血管及淋巴管表面分子结合的多肽分子)耦联pVEC(序列为LLIILRRRRIRKQAHAHSK)，在体内及体外试验中，能特异地穿越乳腺癌细胞胞膜而不能穿越正常细胞的胞膜。因此，这些THP(吡柔比星)有可能作为肿瘤特异性细胞穿膜肽，运送各种抗肿瘤物质进入肿瘤组织及细胞内，却不会进入或损伤正常组织及细胞。Miao等[12]将黑色素瘤特异性结合短肽与放疗药物结合并用212Pb进行标记，注入带有黑色素瘤的裸鼠体内后，结果显示，放疗药物较快的在黑色素瘤细胞内聚集到较高的浓度，而在正常组织细胞内只有较低浓度的聚集，在体内的清除时间大大延长，其肾毒性也显著降低，荷瘤裸鼠的生存时间大大延长，其中45%的裸鼠肿瘤完全消失，这种放疗方法克服了肿瘤的放射性抵抗现象及组织含氧量对放射性药物分布的影响。Shadidi等[13]利用噬菌体肽库展示技术，筛选出乳腺癌细胞特异性结合短肽LTVSPW-YC，并将该短肽和抑制ErbB2表达的反义核苷酸结合，结果显示短肽成功地将该核苷酸带入肿瘤细胞内，并且抑制了ErbB2的表达。

2. 细胞及细胞器靶向CPP提高穿膜特异性目前对CPP特异性靶向亚细胞器关注不多，大部分的工作主要集中于如何跨越细胞膜而不是细胞器膜，CPP穿膜后定位于细胞核或细胞浆。若功能分子能在特定位点发挥功能，将有助于靶向胞内细胞器在生物医学领域中的应用。Horton等[14]以引入亲脂性残基和建立阳离子参数与疏水性间平衡原理，设计合成了线粒体穿透肽(mitochondria-penetrating peptide, MPP)，运用MPP已成功输送siRNA和质粒DNA等各种生物活性分子。

真核细胞的核孔只允许小分子通过，大分子物质DNA、蛋白质(大于70 kDa)等则需要相应受体转运分子协助，这类转运分子通常有核定位信号(NLS)结构。如果将这种NLS连接到穿膜肽的Lys侧链上，穿膜肽就能功能分子转运至胞核。Liu等[15]将穿膜肽与来自于NF-κB的核定位信号肽偶联可提高报道基因的表达并且降低细胞毒作用。

虽然细胞器靶向性穿膜肽的设计应用研究逐渐受到重视，通过对肽序列的修改或者引入人工合成

的氨基酸侧链，可以提高其特异性。然而，众所周知，即使是最小的序列改变也可以对肽的穿膜输送活性造成巨大影响，所以必须确定一个精确的尺度来定义具有高药物运输活性的穿膜肽。值得我们更深入探索的是阐明导致膜转位的机制，这需要了解运输肽与膜组分之间的相互作用以及发生作用后的结构变化[16-18]。将来设计的细胞及细胞器靶向性穿膜肽必须满足所确定的标准，这将是下一代穿膜肽设计的起点。

3. 辅助CPP促内含体逃逸的方法大多数CPP经内吞摄取后被内含体捕获。目前一些化学物质如氯喹、钙离子以及蔗糖用于促内含体的逃逸[19-21]，因其不能用于体内而未得到广泛关注。由于内含体捕获限制其携带的功能分子的发挥，一些研究组正致力于如何解决内含体逃逸的挑战，如利用组氨酸咪唑基在酸性内含体中具有质子海绵体效应的原理，将Tat耦联多聚组氨酸成Tat-10H，经内含体捕获后组氨酸残基质子化，导致内含体渗透膨胀，最终致内含体膜破裂、细胞器裂解以及其携带功能分子的释放。Lo等[22]利用Tat-10H携带含荧光素酶报道基因的质粒，转染细胞后经荧光素酶活性分析发现，Tat-10H组较Tat组提高近7000倍，这样高的输送水平可与25 kDa非病毒载体金标准的PEI(聚乙烯亚胺)相媲美。以此原理，它们不仅可用于DNA的输送还可用于输送siRNA。此外，通过质子化形成二级结构α螺旋，也能促使内含体的裂解释放，如CPP经组氨酸残基修饰后，能促进其在内含体形成质子化α螺旋结构产生逃逸[23]。

另外，Abes等[24]将6-氨基己酸(Ahx)结合到CPP上也能够促内含体的释放。利用Ahx修饰多聚精氨酸并连接PMO，测定剪切校正活性明显强于Tat以及R9F2。其机制可能是通过提高CPP的灵活性，以及减少与细胞表面带负电荷的硫酸肝素相互作用，使CPP及携带的功能分子更加有效的从内含体逃逸。

光化学内化(photochemical internalization, PCI)，即利用光化学物质处理诱导内含体逃逸。AIPc2a是一种溶膜合化合物，在光刺激下产生的活性氧自由基能够破坏内含体膜。Berg等[25]应用的PCI法是在CPP-PNA(peptide nucleic acid)孵育细胞的同时加入光敏物质AIPc2a，并用红光激发，从而促进CPP及携带的功能分子内含体的释放。此方法可通过对光线的

· 196 ·《生命的化学》2011年31卷2期CHEMISTRY OF LIFE 2011，31(2)● Mini Review控制，来实现组织的限制性，且对细胞无毒性，因而有望成为相关临床治疗应用的新技术[26-28]。4. CPP与功能分子的非共价组装实现药物合成简单化大多数CPP是通过共价结合方法与功能分子结合，最近研究发现，一些CPP能够通过非共价相互作用与功能分子结合并以较高效率成功输送入胞内。这种非共价相互作用使得加工合成步骤更加简单，不同功能分子可与CPP简单混合而无需单独优化合成方案。同时载体与功能分子间非共价相互作用，可减少CPP对功能分子生物活性的干扰。新近发现的源于禽传染性法氏囊病毒的Rath短肽(序列为TPWWRL-WTKWHHKRRDLPRKPE)能够形成优势β结构，且不同于一般无特定结构或α螺旋结构的CPP[29]。这一序列可通过非共价相互作用，以快速、温度非依赖性和非内吞摄取机制输送蛋白质和核酸，这种穿膜方式可以逃避内含体的捕获及提高生物利用率。更加可喜的是Rath短肽还能将功能大分子输送入比癌细胞株更难进入的原代细胞，上述特征使其较众多CPP具有更好的开发应用前景。

另外一种新CPP的CADY序列(CADY为一基因序列代码，序列为gLWRALWRLLRSLWRLLWRA)有Arg和Tyr且长度达20个氨基酸残基的双亲性短肽，能够折叠成α螺旋。Endoh等用CADY与siRNA以静电相互作用形成稳定复合物，输送带负电功能分子进入包括悬浮和原代细胞在内的各种细胞株，通过非内吞摄入机制减少了被内含体捕获的机会，同时提高了生物利用率。5. 结语利用病毒来源或人工合成并进行修饰的多肽类物质作为输送载体，是解决当前靶向治疗中非病毒类载体转染效果低、病毒类载体免疫源性大的有效手段。因为这些多肽去除了病毒颗粒的遗传物质，故无致癌作用，保留了病毒蛋白中具有穿膜活性、核定位等功能的多肽片段，相对分子质量小，大大降低了免疫原性，但不降低转染活性。利用固相合成技术可将阳离子肽、生物膜活性肽、核定位肽及靶作用肽等各种功能的肽融合在一起，形成多功能的输送载体，从细胞特异结合、生物膜去稳定、细胞核内转运等多靶点来促进功能分子入胞，将会大大提高分子药物药效。寻找具有上述功能的多肽序

[30]

[31]

列是当前该领域研究最为活跃的课题，随着多肽合成技术的进一步提高、生物技术的进一步发展，多肽类物质在输送载体中的应用将会越来越广泛。

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New designs of cell penetrating peptides for targeted cancer therapy

HuANg Fajun1, ZHANg Huawen2

1

Midical Institute of Hubei university for Nationalities, Enshi 445000, China;

2

Enshi County Family Planning Service Station, Enshi 445000, China

Abstract Cell penetrating peptides (CPPs), a class of small molecule peptides discovered in recent years, can penetrate from extracellular to intracellular and can also mediate macromolecules transduction in a class of small molecule peptides with high speed and efficiency, biological activity and low cell damage in drug and therapy research. The limitation of targeted cancer therapy is the low efficiency of drug access to tumor cells that greatly reduces the efficacy of targeted cancer therapy. Therefore, how to make anti-cancer drug delivery to tumor cells in a particular group is the subject of current research, and we reviewed the design and application of specific cell penetrating peptides in tumor-targeting therapy.

Key words cell penetrating peptide; cell targeting; organelle targeting