酪胺信号放大-量子点标记银染增强的基因芯片可视化检测方法的建立

生５５８　ＬＥ　ＴＴＥＲ　Ｖ　Ｚ．５　ｌ　ｏ・。．４　‘｜　Ｊｕｌ、．　２，・，２０１２，　０　ＴＴ　Ｓ　ＩＮ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　ＯＩ．技　术　通　讯ｖ…Ｎｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００９—０００２．２０１２．０４．０２１　研究报告　酪胺信号放大一量子点标记银染增强的基因芯片可视化检　测方法的建立　张春　，刘琪琦　，陈苏红　，张宏刚　，王升启　１．安徽医科大学研究生学院，安徽合肥２３００３２；２．军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京１００８５０　［摘要］　目的：建立一种酪胺信号放大一量子点标记银染增强的基因芯片可视化检测方法，提高基因芯片检测的灵　敏度。方法：待测靶基因与固定在玻片上的探针杂交，依次加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶、生物素标记的酪　胺及链霉亲和素标记的量子点，３７℃孵育，然后加入银增强试剂显色，最后用可视化生物芯片扫描仪扫描并记录结　果；以牛布鲁菌２１０１０５株为检测对象，以酪胺信号放大一荧光素Ｃｙ３（ＴＳＡ—Ｃｙ３）检测法为对照方法，测定酪胺信号放　大一量子点标记银染增强（ＴＳＡ—ＱＤＳ）检测法的灵敏度。结果：确定了基因芯片量子点标记银染增强可视化检测方法　的检测流程，优化了检测条件，并考察了检测灵敏度。优化的检测条件为：酪胺一生物素稀释比例为ｌ：４０００，链酶亲　和素标记的量子点稀释比例为ｌ：５０，３７℃孵育时间为２５～３０　ｍｉｎ，银染增强时间为６—７　ｍｉｎ。检测牛布鲁菌的灵敏度　为１０　ＣＦＵ／ｍＬ。结论：该方法实现了基因芯片高灵敏度可视化检测，其灵敏度与荧光法相当，并且有可视化的优势。　［关键词］　量子点；生物素一酪胺；基因芯片；可视化检测；辣根过氧化物酶　［中图分类号］Ｑ７８９　［文献标识码］Ａ　［文章编号］　１００９—０００２（２０１２）０４—０５５８—０５　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｖｉｓｕａｌ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＴＳＡ－Ｑｕａｎｔｕｍ　Ｄｏｔｓ　Ｃｏｕ—　ｐｉｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｓｉｌｖｅｒ　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　ＺＨＡＮＧ　Ｃｈｕｎ　，ＬＩＵ　Ｑｉ—Ｑｉ　，ＣＨＥＮ　Ｓｕ—Ｈｏｎｆ，ＺＨＡＮＧ　Ｈｏｎｇ－Ｇａｎｇ　，ＷＡＮＧ　Ｓｈｅｎｇ－Ｑｉ　１．Ａｎｈｕｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｇｒａｔｕａｔｅ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｈｅｆｅｉ　２３００３２；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００８５０；Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ．Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｑｗａｎｇ＠ｎｉｃ．ｂｍｉ．ａｅ．ｅｎ　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　ｏｆ　ｖｉｓｕａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｙｒａｍｉｎｃ　ｓｉｇｎａｌ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｕｍ　ｄｏｔｓ（ＱＤ）ｃｏｕｐｌｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｉｌｖｅｒ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｅａｃｈ　ｚｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｌｉｄｅ　ｗａｓ　ｈｙｂｒｉｄｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ｌｏａｄｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ—ＨＲＰ，ｂｉｏｔｉｎ—ｔｙｒａｍｉｎｅ，ｓｔｒｅｐｔａｖｉ—　ｄｉｎ—ＱＤｓ　ｉｎ　ｔｕｒｎ．ａｎｄ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｎｅｃｅｓｓａｒｙ　ａｔ　３７℃ａｆｔｅｒ　ｅａｃｈ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｌｏａｄｅｄ．Ｔｈｅ　ｉｍａｇｅｓ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂ—　ｔａｉｎｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｓｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　ａ　ｖｉｓｉｂｌｅ　ｌｉｇｈｔ　ｓｃａｎｎｅｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｗａｓ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ　ｏｐｔｉ・　ｍｉｚｅｄ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＴＳＡ—ＱＤＳ（ＴＳＡ—ｑｕａｎｔｕｍ　ｄｏｔｓ—ｓｉｌｖｅｒ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｗｈｅｎ　ＢｒｕｃｅＵａ　ａｂｏｒｔｕｓ　ｓｔｒａｉｎ　２１０１０５　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔａｒｇｅｔ　ａｎｄ　ＴＳＡ—Ｃｙ３　ａｓ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｗａｓ　ｄｅ—　ｔｅｒｍｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｇｅｎｔｓ，ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ａｎｄ　ｓｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎ　ｔｉｍｅ　ａｓ　ｗｅｌ１．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｂｉｏｔｉｎ—ｔｙｒａｍｉｎｅ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｗａｓ　１：４０００，ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＱＤｓ　１：５０，ｔｈｅ　ｇｌａｓｓ　ｓｌｉｄｅｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎ—　ｃｕｂａｔｅｄ　ａｔ　３７ｏＣ　ｆｏｒ　２０—３０　ｍｉｎ　ａｎｄ　ｓｔａｉｎ　ｔｉｍｅ　６～７　ｍｉｎ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｒｅａｃｈｅｄ　１０　ＣＦＵ／ｍＬ　ｆｏｒ　Ｂ．　ａｂｏｒｔｕｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ａ　ｎｅｗ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　ｏｆ　ｖｉｓｕａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ　ｔｏ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ＴＳＡ—Ｃｙ３．ｍｏｒｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｉＳ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｖｉｓｕａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｒｅａｌｉｚｅｄ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　ｑｕａｎｔｕｍ　ｄｏｔｓ；ｂｉｏｔｉｎ—ｔｙｒａｍｉｎｅ；ＤＮＡ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ；ｖｉｓｕａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　量子点（ｑｕａｎｔｕｍ　ｄｏｔｓ，ＱＤ）或称为半导体纳米　微晶体，是一种由Ⅱ一Ⅵ族元素（如硒化镉、硫化镉）　或Ⅲ一Ｖ族元素（如磷化铟、砷化铟）组成的尺寸小于　１００　ｎｍ的半导体纳米晶体”　。量子点颗粒粒径小，　收稿日期：２０１２—０１—０４　比表面积大，表面活性位点多，具有量子尺寸效应、　表面效应和量子隧穿效应　，存在诸如纳米金的类似　电子传递载体　】，在还原剂（如对苯二酚）存在下，可　催化Ａ　还原成单质原子形成银颗粒并沉积于量子　点表面，这些银颗粒又可以进一步催化还原周围的　基金项目：“艾滋病和病毒性等重大传染病防治”科技重大专项　（２００９ＺＸ１０００４—３ｌ０）　银离子，这种级联瀑布催化作用使得银颗粒越聚越　多，积聚成团状银壳，形成肉眼可见的黑色颗粒。量　作者简介：张春，男，硕士研究生　通信作者：王升启，（Ｅ—ｍａｉｌ）ｓｑｗａｎｇ＠ｎｉｃ．ｂｍｉ．ａｅ．ｅｎ　子点已经在组织检测和蛋白芯片检测中得到了广泛　５６２　１　２　３　４　５　生ＬＥ　ＴＴＥＲ　Ｈ　Ｖ　・　２３～．厶）　Ｎｏ　・４　ｔ一．斗　Ｊｕｌ　ｚｕ　・，２０１２，　ＴＴ　Ｓ　ＩＮ　ＢＩＯＴＥＣ　Ｎ０ＬＯＧＹ　ｏｌＨ．技　术通　讯ｖ　的量子点。因此，本检测方法还有进一步提高检测　灵敏度的空间。本方法与ＴＳＡ—Ｃｙ３检测法相比，检　ｏｎ　ｔｙｒａｍｉｎｅ　ｓｉｇｎａｌ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｗｉｔｈ　ｇｏｌｄ　ｌａｂｅｌ　ｓｉｌ—　ｖｅｒ　ｓｔａｉｎ［Ｊ］．Ａｎａｌ　Ｂｉｏａｎａｌ　Ｃｈｅｍ，２０１０，３９８（１８）：２７４５—２７５０．　【７］　Ｍａｊｔａｎ　Ｔ，Ｂｕｋｏｖｓｋａ　Ｇ，Ｔｉｍｋｏ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．ＤＮＡ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ—　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］．Ｆｏｌｉａ　Ｍｉ－　测过程相对繁琐，需要２步反应才能实现量子点的　引入，如果能实现ＨＲＰ直接催化量子点沉积，可减　少检测步骤。　ｃｒｏｂｉｏｌ，２００４，４９（６）：６３５－６６４．　［８］Ｋａｒａｋａｃｈ　Ｔ　Ｋ，Ｆｌｉｇｈｔ　Ｒ　Ｍ，Ｄｏｕｇｌａｓ　Ｓ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ａｎ　ｉｎｔｒｏｄｕｃ—　ｔｉｏｎ　ｔｏ　ＤＮＡ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｈｅ—　参考文献　李志刚，杨凯．量子点在生物大分子检测中的研究进展叫．医　学综述，２０１　１，１７（７）：９６３—９６５．　Ｙａｄａｖ　Ｓ　Ｃ，Ｋｕｍａｒｉ　Ａ，Ｙａｄａｖ　Ｒ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ　ｂｙ　ｎａｎｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｎａｎｏｂｉｏｃｏｎ—　ｍｏｍｅｔｒｉｅｓ　Ｉｎｔｅｌｌ　Ｌａｂ　Ｓｙｓｔ，２０１０，１０４（１）：２８－５２．　［９］Ｈｏｐｍａｎ　Ａ　Ｈ　Ｎ，Ｒａｍａｅｋｅｒｓ　Ｆ　Ｃ　Ｓ，Ｓｐｅｅｌ　Ｅ　Ｊ　Ｍ．Ｒａｐｉｄ　ｓｙｎ－　ｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｂｉｏｔｉｎ一，ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－，ｔｒｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－，ａｎｄ　ｆｌｕｏｒｏ—　ｃｈｒｏｍｅ－ｌａｂｅｌｅｄ　ｔｙｒａｍｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙ—　ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ＣＡＲＤ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ　Ｃｙｔｏ－　ｃｈｅｍ，１９９８，４６（６）：７７１－７７７．　［１Ｏ］金大智．重要病原菌检测基因芯片的研制【Ｄ】．北京：军事医学　ｊｕｇａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２０１　１，３２（１）：１７３—１８７．　许国峰，李慧，张翠，等．量子点银增强可视化检测方法的研　究与应用『Ｊ］．分析化学，２０１０，３８（１０）：１３８３—１３８７．　Ｃｈｏｕ　Ｌ　Ｙ　Ｔ，Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｈ　Ｃ，Ｐｅｒｒａｕｈ　Ｓ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ　科学院放射与辐射医学研究所，２００７．　［１Ｉ］宋国利，杨幼桐，孙凯霞，等．量子点的电子结构及量子效应　［ＪＪ．黑龙江大学自然科学学报，２００２，１９（１）：８０—８３．　［１２］Ｓｈｉｎｇｙｏｊ　Ｍ，Ｇｅｆｉｏｎ　Ｄ，Ｐｉｎｋｅｌ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｑｕａｎｔｕｍ　ｄｏｔｓ—ｂａｓｅｄ　ｑｕａｎｔｕｍ　ｄｏｔｓ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｓｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎｉｎｇ［Ｊ］．　Ａｎａｌ　Ｃｈｅｍ，２００９，８１（１　１）：４５６０－４５６５．　Ｂｏｂｏｒｏｗ　Ｍ　Ｎ，Ｈａｒｒｉｓ　Ｔ　Ｄ，Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ　Ｋ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ，ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｓｉｇｎａｌ　ａｍｐｌｉｉｃａｔｆｉｏｎ　ｔｏ　ｉｍｍｕｎｏａｓ一　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｈａｓｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ［Ｊ］．Ｔａｌａｎｔａ，２００５，６７（３）：４７２—　４７８．　［１３］Ｒｏｕｓｓｅｒｉｅ　Ｇ，Ｓｕｋｈａｎｏｖａ　Ａ，Ｅｖｅｎ—Ｄｅｓｒｕｍｅａｕｘ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｓｅｍｉ—　ｃｏｎｄｕｃｔｏｒ　ｑｕａｎｔｕｍ　ｄｏｔｓ　ｆｏｒ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ　ｂｉｏ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｎ　ｓｏｌ－　１９８９，１２５（１）：２７９—２８５．　ｓａｙｓ［Ｊ］．Ｊ　ｌｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　Ｍ　Ｌ．ｅｔ　ａ１．ＤＮＡ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ　ｆｏｒ　【６］Ｑｉ　Ｈ　Ｊ，Ｃｈｅｎ　Ｓ　Ｈ，Ｚｈａｎｇ　ｖｉｓｕａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｂａｓｅｄ　ｉｄ—ｓｔａｔｅ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ［Ｊ］．Ｃｒｉｔ　Ｒｅｖ　Ｏｎｃｏｌ　Ｈｅｍａｔｏｌ，２０１０，７４（１）：　１一】５．　（上接第５２２页）　ｔｙ　ａｃｉｄ—ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃａｒｏｔｉｄ　ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｖａｓｃ　Ｂｉｏｌ，　［７］　Ｍａｅｄａ　Ｋ，Ｃａｎ　Ｈ，Ｋｏｎｏ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　２００７，２７：１７９６—１８０２．　［１　１］Ｂａａｒ　Ｒ　Ａ，Ｄｉｎｇｆｅｌｄｅｒ　Ｃ　Ｓ，Ｓｍｉｔｈ　Ｌ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｉｎ　ＡＦＡＢＰ／ａｐ２（一，一）ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　Ｍｅｔａｂ．２００５。２８８：Ｅ１８７一Ｅ１９３．　ｉｎ　ｏｂｅｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｄｉａｂｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｍｅｔａｂ，２００５，１：１０７—１　１９．　［８】张家庆．新的ＨＯＭＡ—ＩＲ——从空腹血糖、空腹胰岛素测胰岛素　抵抗［Ｊ】．中华糖尿病杂志，２００５，１３（４）：２４５－２４６．　［９】Ｂｏｏｒｄ　Ｊ　Ｂ，Ｍａｅｄａ　Ｋ，Ｍａｋｏｗｓｋｉ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ａｄｉｐｏｃｙｔｅ—　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ—－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｉｍｐｒｏｖｅｓ　ｍｅ－　ｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ａｎｄ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｉｎ　ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅ－ｄｅｆｉ—　【１２】Ｍｏｎｏｋｏｓｈｉ　Ｙ，Ｋｉｍ　Ｙ　Ｂ，Ｐｅｒｏｎｉ　０　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｌｅｐｔｉｎ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ　ｆａｔｔｙ——ａｃｉｄ　ｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｂｙ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ＡＭＰ—－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ｆＪ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１５：３３９—３４３．　［１　３】Ｂｅｒｇ　Ａ　Ｈ，Ｓｃｈｅｒｅｒ　Ｐ　Ｅ．Ａｄｉｐｏｓｅ　ｔｉｓｓｕｅ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｃｉｒｃ　Ｒｅｓ，２００５，９６：９３９－９４９．　ｃｉｅｎｔ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００４，１　１０：１４９２－１４９８．　【１０】Ｙｅｕｎｇ　Ｄ　Ｃ，Ｘｕ　Ａ，Ｃｈｅｕｎｇ　Ｃ　Ｗ，ｅｔ　ａ１．Ｓｅｒｕｍ　ａｄｉｐｏｅｙｔｅ　ｆａｔ—