分子印迹固相萃取-高效液相色谱-质谱法检测食品样本中痕量四环素和喹诺酮类抗生素

四环素和喹诺酮类抗生素

张莉;周廷廷;罗静;范志勇;江丰;余婷婷;王鹏

【摘 要】目的 将分子印迹聚合物固相萃取(molecularly imprinted solid phase extraction,MISPE)技术与液相色谱-质谱法(high performance liquid

chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS)联用,检测蜂蜜和牛奶样本中痕量四环素(tetracyclines,TCs)和喹诺酮(quinolones,QNs)类抗生素.方法 采用沉淀聚合法,以四环素和诺氟沙星(nor-floxacin,NOR)2种抗生素为模板,甲基丙烯酸(methacrylic acid,MAA)为单体,三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(trimeth-ylolpropane trimethylacrylate,TRIM)为交联剂,制备分子印迹聚合物

(molecularly imprinted polymers,MIPs).以制备的MIPs为固相萃取吸附剂建立蜂蜜和牛奶中4种四环素和4种喹诺酮类抗生素的固相萃取方法,并与HPLC-MS联用检测奶粉和蜂蜜中8种抗生素.结果 制备的双模板分子印迹聚合物对4种四环素和4种喹诺酮类抗生素具有良好的特异性识别能力,且印迹因子均在2.0以上;所建立的检测方法线性范围为1.0～100.0 ng/g,加标回收率为82.12％ ～96.51％,相对标准偏差小于5.0％(n=6),检测限均为0.2 ng/g.结论 建立的MISPE与HPLC-MS联用的方法可用于食品样本中4种四环素和4种喹诺酮类抗生素的同时检测.

【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》 【年(卷),期】2018(047)005 【总页数】7页(P539-545)

【关键词】分子印迹固相萃取;液相色谱-质谱法;四环素;喹诺酮类抗生素;食品 【作 者】张莉;周廷廷;罗静;范志勇;江丰;余婷婷;王鹏

【作者单位】湖北省食品质量安全监督检验研究院 ,武汉 430075;青岛大学附属医院检验科 ,青岛 266000;湖北出入境检验检疫局检验检疫技术中心 ,武汉 430050;湖北省食品质量安全监督检验研究院 ,武汉 430075;湖北省食品质量安全监督检验研究院 ,武汉 430075;湖北省食品质量安全监督检验研究院 ,武汉 430075;湖北出入境检验检疫局检验检疫技术中心 ,武汉 430050 【正文语种】中 文 【中图分类】TS207.3

四环素类抗生素(tetracyclines，TCs)是一类由放线菌发酵或采用半合成方法生产的广谱抑菌剂，不仅可作为兽药起到预防及治疗禽类、鱼类疾病的作用，而且可用作饲料添加剂促进畜禽生长，因而被广泛应用于畜禽、水产养殖业中[1]。喹诺酮类抗生素(quinolones，QNs)能够有效控制革兰阳性、阴性及其他细菌感染，广泛应用于临床和畜禽养殖业[2]。这两类抗生素在畜禽养殖业领域应用普遍，因而在畜禽产品中残留较多，是国家检验部门日常检测的必检项目[3]。目前两类抗生素的检测方法主要为液相色谱法(HPLC)[4]、液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)[5]，检测前多采用固相萃取技术对样品进行前处理，其中四环素和喹诺酮类抗生素的常用萃取柱为商品化固相萃取小柱HLB和C18小柱[6-7]。然而这些固相萃取小柱的填料一般是硅胶和高聚物，对目标物的识别缺乏选择性，不能有效规避复杂样品的基质干扰，因而限制了目标物的痕量检测。因此选择具有特异性识别能力的固相萃取材料是实现这两类抗生素痕量检测的关键。

分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)是模板分子、功能单体和交联剂在致孔剂溶液中通过共聚合作用形成的具有一定刚性的高分子聚合物[8]。MIPs对目标物的识别具有选择性、预定性和重复利用性，因此被广泛应用在手性分离和底物选择性分离、抗体仿生、固相萃取、传感器等领域。目前，已有部分文献报道了MIPs用于四环素类和喹诺酮类抗生素选择性固相萃取的研究。Sun等[9]以氧氟沙星为模板，甲基丙烯酸(methacrylic acid，MAA)为功能单体合成了喹诺酮类MIPs，并以制备的MIPs为吸附材料建立了固相萃取联用HPLC检测水中9种喹诺酮抗生素的方法；Jing等[10]以氧四环素和金霉素为模板，MAA为功能单体制备了对4种四环素具有较好吸附性能的MIPs，并将其与固相萃取联用测定了蜂蜜、牛奶和龙虾中的四环素。可见目前关于这2种抗生素MIPs的研究仅能实现一类抗生素的识别和检测，而同时识别这2类抗生素的MIPs还未见报道。 本研究采用诺氟沙星(norfloxacin，NOR)和四环素(tetracycline，TC)为模板合成双模板MIPs，并以该MIPs为固相萃取材料建立分子印迹固相萃取方法(molecularly imprinted polymer solid phase extraction，MISPE)，并与液相色谱-质谱的方法联用，建立了痕量检测蜂蜜和奶粉中8种喹诺酮类和四环素类抗生素的新方法。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(中国，德力祥仪器设备有限公司)；KS1033B型振荡摇床(德国，IKA公司)；Milli-R04超纯水仪(德国，Millipore公司)；Agilent 1200高效液相色谱仪(美国，Agilent公司)。扫描电镜(scan electron microscope，SEM)图像由Sirion 200场发射扫描电子显微镜(FESEM，荷兰FEI公司)所拍摄。

四环素、土霉素(oxytetracycline，OTC)、金霉素(chlorotetracycline，CTC)、

强力霉素(doxycycline，DOX)、诺氟沙星、环丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、氧氟沙星(ofloxacin，OFL)、恩诺沙星(enrofloxacin，ENR)购自Sigma公司(美国)，以甲醇溶解配制成5 mg/mL母液待用。MAA、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(trimethylolpropane trimethylacrylate，TRIM)购自阿拉丁(中国)。甲醇(色谱纯)、乙腈(分析纯)、偶氮二异丁腈(2，2-azobisisobutyronitrile，AIBN)均购自国药试剂有限公司。MAA在氮气保护下避光减压蒸馏以去除其中的阻聚剂；AIBN用甲醇热溶解、过滤、冷却结晶后烘干备用。实验室用水为超纯水，蜂蜜和奶粉购于当地超市。 1.2 MIPs的制备

本研究采用沉淀聚合法制备双模板MIPs。具体操作过程为：在100 mL圆底玻璃瓶中加入60 mL致孔剂甲醇-乙腈(4∶1，V/V)，将模板分子(TC或NOR 1.0 mmol)或混合模板(TC、NOR各0.5 mmol)、功能单体(MAA，4 mmol)溶于致孔剂，40 ℃反应6 h，加入交联剂(TRIM，10 mmol)和引发剂(AIBN，30 mg)，超声脱气5 min，通氮气除氧5 min，封口。将混合溶液置于55 ℃水浴锅中，100～120 r /min反应24 h。反应结束后收集所制得的聚合物颗粒，以甲醇-乙酸(9∶1，V/V)索式提取24 h除去模板分子，再以甲醇索式提取12 h，除去乙酸。将聚合物置于40℃真空干燥箱干燥至恒重，得到MIPs粉末。非印迹聚合物(non-imprinted polymes，NIPs)与MIPs制备过程基本相同，但合成过程中不加入模板分子。

1.3 MIPs吸附性能评价

将8种抗生素母液分别稀释为0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 mg/mL的浓度系列。称取20 mg MIPs(或NIPs)粉末置于2 mL PE管中，将配制的一系列浓度抗生素溶液加入PE管，常温下振荡吸附18 h，离心取上清检测，根据上清剩余浓度推算MIPs(或NIPs)的吸附性能。

1.4 分子印迹固相萃取柱的制备

称取100 mg MIPs(或NIPs)粉末，干法装入规格6 mL的固相萃取空柱中，以3 mL甲醇和3 mL乙腈依次活化固相萃取柱。 1.5 样品提取及分子印迹固相萃取

称取2 g阴性蜂蜜和奶粉样品置于50 mL离心管中，加入标准物质使其浓度为10 ng/g，以10 mL甲醇-水(9∶1，V/V)振荡提取10 min后3500 r/min离心5 min取上清。将提取液以1 mL/min 的速度通过MIPs(或NIPs)固相萃取柱，以3 mL甲醇-水(1∶9，V/V)淋洗除去非特异性结合在聚合物上的杂质，真空抽干后以3 mL甲醇-氨水(95∶5，V/V)混合溶液洗脱吸附在聚合物上的目标物。收集洗脱液，在40℃条件下氮气吹至近干，用流动相定容至1.0 mL，经HPLC-MS分析。 1.6 色谱及质谱条件

1.6.1 色谱条件 岛津超高效液相系统(Shimadzu，Japan)用于分离目标化合物，系统配有DGU-20 A5R脱气装置、CBM-20A控制器、Nexera X2 LC-30AD二元泵、Nexera X2 SIL-30AC自动进样器、CTO-20 AC柱温箱。分离条件：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm × 50 mm)；流动相：0.5 mmol/L醋酸铵-乙腈(10∶90，V/V)，流速0.2 mL/min；柱温：室温；进样量：10 μL，梯度洗脱程序见表1。

1.6.2 质谱条件 质谱分析由配有电喷雾离子源

(ESI)的岛津(Shimadzu，Japan)LC/MS-8050超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪完成，采用多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)方式进行分析，且8种待测抗生素均采用正离子模式分析。数据的采集和分析基于

Labsolution 5.75 sp2软件。以各待测物质浓度100 μg/L的甲醇溶液优化质谱条件，结果见表2。

表1 分离8种抗生素的梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program for the

separation of eight antibiotics时间(min)醋酸铵(%)乙腈

(%)0.015956.0059512.00128816.00128818.00257520.00227823.00901023.01901027.00595

表2 测定8种抗生素的最佳质谱条件Table 2 Optimal MS conditions for the detection of eight antibiotics目标物母离子(m/z)子离子a (m/z)驻留时间(ms)Q1(V)碰撞电压(V)Q3(V)TC445.20410.20100-11-22-30445.20427.00100-12-16-23OTC461.20425.95100-11-22-30461.20443.10100-12-16-23CTC479.20444.05100-11-22-30479.20154.05100-12-16-23DOX445.20428.15100-11-22-30445.20154.10100-12-16-23NOR320.20302.10100-11-22-30320.20231.05100-12-16-23CIP332.20314.10100-11-22-30332.20231.00100-12-16-23OFL362.20318.15100-11-22-30362.20261.10100-12-16-23ENR360.25342.15100-11-22-30360.25316.15100-12-16-23 a第1个离子是定量离子，第2个离子是定性离子 2 结果与讨论 2.1 MIPs的制备

本文采用TC和NOR分别为模板合成单模板MIPs，以二者为混合模板制备双模板MIPs。图1为以不同抗生素为模板的MIPs对TC和NOR的静态吸附曲线，其中图1A，1B和1C中模板分子分别为TC、NOR和TC与NOR的混合物。由图1A可知，以TC为模板制备的MIPs对TC的吸附量大于NIPs对TC的吸附量，然而其对NOR的吸附量与NIPs的吸附量相差不大，说明以TC为模板的MIPs对TC的吸附具有选择性，不能用来同时吸附TC和NOR；由图1B可知，以NOR为模板的MIPs对NOR的识别能力明显强于其对TC的识别能力，因此亦不能用于二者同时吸附的研究；图1C显示以TC和NOR为混合模板制备的MIPs

对TC和NOR的吸附量均较大，且对应NIPs对二者的吸附量均较小，说明制备的双模板MIPs能同时实现对二者的选择性吸附，因此可用于二者的同时吸附研究。 A：四环素模板；B：诺氟沙星模板；C：四环素和诺氟沙星混合模板图1 以不同抗生素为模板制备的MIPs及NIPs对TC和NOR的静态吸附曲线Fig.1 The static absorption curves of MIPs and NIPOs towards TC and NOR with different templates

选定模板后，本研究对模板与单体的比例进行了优化，结果见表3，其中印迹因子(imprinting factor，IF)是评价聚合物印迹效果的指标，IF值越大，印迹聚合物的印迹效果越好，选择性越好。其计算公式如下：IF=QMIPs/QNIPs,其中QMIPs和QNIPs分别是印迹和非印迹聚合物对抗生素的吸附容量。由表3可知，当模板和单体比例为1∶4时，MIPs对这8种抗生素的印迹因子均在2以上，且其对TC和NOR的印迹因子可达到或接近5，说明此条件下MIPs对8种抗生素的识别能力均较好，这是因为功能单体MAA用量较少时，聚合物表面产生的印迹位点不充足，印迹效果不佳；而过量的MAA会自身缔合，导致非特异性作用增强，印迹效果降低[11]，因此在制备MIPs时选择模板与单体的比例为1∶4。交联剂使主客体配合物与交联剂通过自由基共聚合在模板分子周围形成高交联的刚性聚合物，因此交联剂的用量对MIPs的吸附能力有较大的影响。基于此，本研究对交联剂TRIM的用量进行了优化，结果如表3所示，当其用量为10 mmol时，合成的MIPs对2种抗生素的印迹效果最好，这是因为当交联剂用量较少时，不能将单体与模板的预聚体充分交联，使分子印迹聚合物印迹位点缺乏，印迹效果降低；而当交联剂过量时，过多的交联剂覆盖了单体与模板的交联位点，降低MIPs对目标物的识别能力[12]，因此选择交联剂TRIM的最佳用量为10 mmol。

表3 模板、单体及交联剂用量对MIPs印迹效果的影响Table 3 Effects of theamount of template，monomer and cross-linker on imprinting序号模板

/单体(mmol/mmol)交联剂(mmol)印迹因子TCOTCCTCDOXNORCIPOFLENR11︰2102.372.232.152.282.372.232.282.1521︰4105.173.293.262.844.973.293.332.8431︰6101.191.261.301.161.882.160.760.641︰8101.351.530.831.601.611.741.591.5751︰10101.271.441.311.702.182.212.061.7161︰47.51.351.530.831.611.351.540.831.6071︰412.51.271.441.311.691.271.441.311.7081︰4150.990.950.9120.931.000.950.910.96 2.2 MIPs的表征

扫描电镜是最直观、最常用的观察聚合物表面微观形态的方法，本文观察了不同模板MIPs和NIPs的表面微观结构，结果见图2。从图中可以看出，以TC为模板的MIPs(图2A)表面形态如菜花状，以NOR为模板的MIPs(图2B)表面形态如球杆状，而以二者为混合模板的MIPs(图2C)既有菜花状形貌，又能看出球杆状的构型；相比之下，NIPs(图2D)的结构则比较相似且均一，这说明模板分子的加入在很大程度上影响了MIPs的表面结构，且表面结构的不同也是造成MIPs吸附能力差别的重要原因[13]。

A：以TC模板的MIPs；B：以NOR为模板的MIPs；C：混合模板的MIPs；D：混合模板的NIPs图2 以不同抗生素为模板的MIPs扫描电镜图Fig.2 Scanning electron microscopy of MIPs with antibiotics as templates 2.3 MISPE条件的优化

2.3.1 提取条件的优化 分别选用10 mL甲醇、甲醇-水(9∶1，V/V)、甲醇-水(8∶2，V/V)、甲醇-水(7∶3，V/V)提取奶粉和蜂蜜中的8种抗生素，结果显示以甲醇提

取时奶粉中的4种四环素提取率较低，均在30%左右；甲醇-水(8∶2，V/V)、甲醇-水(7∶3，V/V)的提取体系中4种喹诺酮抗生素的提取率较低，在35%左右；而在甲醇-水(9∶1，V/V)的提取体系中，8种抗生素的提取率均达到45%左右，因此，本研究选择甲醇-水(9∶1，V/V)为提取液，以提取液为MISPE的上样溶液。 2.3.2 淋洗条件的优化 淋洗可以去除上样过程中非特异性吸附在MIPs上的杂质，在MISPE过程中起重要作用。本研究以纯水、甲醇-水(1∶9，V/V)、甲醇-水(2∶8，V/V)和甲醇-水(3∶7，V/V)作为淋洗液进行研究，结果表明以甲醇-水(1∶9，V/V)为淋洗液时8种抗生素的回收率最好，且色谱基线更平滑。造成这种现象的原因是以纯水淋洗，洗脱力不足，基质干扰作用较大；逐渐增加甲醇比例，洗脱力逐渐增强，但甲醇-水比例超过1∶9，洗脱非特异结合物质的同时会洗脱掉部分目标物，导致样品回收率降低，因此综合考虑回收率和基线干扰问题，选择甲醇-水(1∶9，V/V)作为淋洗液。

2.3.3 洗脱条件的优化 洗脱是将吸附在分子印迹固相萃取填料上的目标物解析下来的过程，因此，洗脱影响整个MIPSE过程的效果。本研究对酸性、碱性和中性洗脱液进行研究，分别以甲醇-乙酸(95∶5，V/V)，甲醇-氨水(95∶5，V/V)和甲醇进行洗脱。结果显示，以甲醇-氨水(95∶5，V/V)为洗脱液进行洗脱时，8种抗生素的萃取回收率最高，均在45%左右；进一步研究洗脱液中甲醇与氨水的比例对8种抗生素萃取回收率的影响，将比例调整为甲醇-氨水(98∶2、95∶5、93∶7、90∶10和85∶15)，结果表明在甲醇-氨水的体积比为95∶5时，样品萃取回收率已达较高水平，这可能是因为当氨水浓度太低时，对8种抗生素与MIPs之间作用力破坏不足，回收率降低；而当氨水浓度达到5%时，已足够破坏目标物与MIPs作用位点之间的作用力，再增大氨水浓度对回收率的提升作用不明显。为安全绿色计，本研究选择甲醇-氨水(95∶5，V/V)为洗脱液进行后续研究。 2.4 质谱分析

本研究利用ESI正离子化模式对4种四环素和4种喹诺酮类抗生素进行二级质谱分析。通过全离子扫描，找出准确的[Mr+H]+峰，并且分别以此为母离子再进行轰击，找出2个信号较强的碎片离子；以母离子和子离子组成监测离子对，在MRM模式下对待测物进行定性和定量分析。质谱条件如表2所示，分别选择m/z 410.20/445.20、425.95/461.20、444.05/479.20、428.15/445.20、302.10/320.20、314.10/332.20、318.15/362.20和342.15/360.25用于四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星的定量；选择m/z 427.00/445.20、443.10/461.20、154.05/479.20、154.10/445.20、231.05/320.20、231.00/332.20、261.10/362.20和316.15/360.25用于四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星的定性。从加标样品的色谱图(图3)可知，土霉素、四环素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、金霉素、强力霉素的出峰时间分别为10.37、11.06、11.81、11.86、12.36、13.89、16.13和17.05 min。

图3 添加抗生素标准品样品的提取离子色谱图Fig.3 MRM chromatography of real sample spiked with 8 antibiotics 2.5 标准曲线和检测限

本文采用外标曲线法进行定量，在加标水平1.0～100.0 ng/mL范围内，以选定的定量离子峰面积Y对含量X(ng/g)作标准曲线，8种抗生素的标准曲线方程及相关系数如表4所示。以3倍信噪比计算检出限，8种抗生素的检测限均达到0.2 ng/g。

表4 MISPE-HPLC/MS检测8种抗生素的方法学评价Table 4 Methodological assessment of the MISPE-HPLC/MS for detection of eight antibiotics目标物线性范围(ng/g)标准曲线相关系数(R2)TC1.0～100.0Y=35229X-200000.999OTC5.0～100.0Y=40345X-300000.982CTC1.0～100.0Y=13203X-

100000.999DOX1.0～100.0Y=32804X-100000.998NOR1.0～

100.0Y=25875X-200000.988CIP5.0～100.0Y=21143X-200000.998OFL5.0～100.0Y=60792X-300000.986ENR1.0～100.0Y=41832X-200000.997 2.6 加标回收率

对实际样品进行检测，未检出TCs和QNs抗生素。以阴性样品为测试样品，加标1.0、2.0、5.0 ng/g，每个加标浓度做6个平行样，所得加标回收率及相对标准偏差见表5，从表中可知方法的加标回收率在90.9%～106.5%之间，重复6次实验的标准偏差<5.0%，说明检测方法具有较好的准确性和稳定性。

表5 奶粉和蜂蜜样品中8种抗生素的加标回收率Table 5 Spike recoveries of eight antibiotics in milk powder and honey 样本加标(ng/g)TCOTCCTCDOXNORCIPOFLENR奶粉

1.0103.0±3.593.6±3.1101.4±4.098.3±3.293.9±2.493.3±3.3104.2±2.798.3±2.72.095.1±1.194.7±2.394.3±3.396.0±2.994.6±1.695.8±1.897.7±2.893.7±4.25.099.0±2.591.6±1.299.0±2.595.2±3.592.4±1.7102.7±1.496.2±2.196.6±3.6蜂蜜

1.098.3±4.095.7±3.692.9±3.094.1±3.8102.4±3.197.9±1.7105.0±3.297.4±3.82.092.7±2.092.6±1.295.4±3.8106.5±3.792.0±4.091.6±3.996.0±2.498.6±1.45.094.6±3.993.8±2.4104.1±2.791.1±1.592.0±2.290.9±1.696.8±2.395.0±1.3 3 结论

本研究以TC和NOR为双模板，采用沉淀聚合的方法制备了对4种四环素类和4种喹诺酮类抗生素具有良好吸附性能的MIPs。静态吸附实验结果表明MIPs对TC和NOR的选择性吸附性能优于单模板MIPs。以制备的MIPs为固相萃取吸附剂建立了奶粉和蜂蜜中8种抗生素的MIPSE方法，并通过与HPLC/MS方法联用，建立了检测奶粉和蜂蜜样品中痕量的8种抗生素的方法，此方法线性范围较宽，

检测限较低，且准确性和稳定性较高，为实现实际奶粉和蜂蜜样本中这8种抗生素的检测提供了新方法。 参 考 文 献

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