体外三维培养卵巢癌A2780细胞及其多药耐药机制的实验研究

维普资讯 http://www.cqvip.com 河南职工医学院学报　・２２２・　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｎａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｆｏｒ　Ｓｔａｆｆ　ａｎｄ　Ｗｏｒｋｅｒｓ　Ｖｏ１．２０　Ｎｏ．３　Ｊｕｎ。２００８　体外三维培养卵巢癌Ａ　２　７８０细胞及其　多药耐药机制的实验研究　高爱莲　（尉氏县计划生育指导站，河南尉氏４７５００１　１）　［摘要］　目的法建立卵巢癌Ａ　２　７８０细胞形成的多细胞团簇模型，探讨凋亡在卵巢癌细胞群集耐药中的作用。方　以三维培养方法获得人卵巢癌Ａ　２　７８０多细胞球体（ＭＣＳ）模型，单层细胞（ＭＣ）为对照；ＭＴＴ法和ｌｉｑｕｉｄ　ｏｖｅｒ—　ｌａｙ技术检测细胞的药物敏感性；流式细胞术检测细胞周期和凋亡的变化；ＲＴ．ＰＣＲ分析凋亡相关基因ｃａｓｐａｓｅ一３和　ｂｃ１．２的表达变化。结果　细胞在培养２　ｄ后即可形成由多个细胞组成的细胞团，培养５　ｄ后，形成有多层细胞结构　的细胞球；与Ａ　２　７８０／ＭＣ相比，Ａ　２　７８０／ＭＣＳ细胞药物敏感性及细胞凋亡率均显著下降，差异有显著性；而与　Ａ　２　７８０／ＭＣ相比，凋亡诱导基因ｃａｓｐａｓｅ一３在Ａ　２　７８０／ＭＣＳ细胞中明显下降，凋亡抑制基因ｂｃｌ一２明显增高（Ｐ＜　０．０５）。结论　卵巢癌细胞群集耐药可能与肿瘤细胞凋亡相关基因ｃａｓｐａｓｅ一３和ｂｃｌ一２的表达相关。　［关键词］　多细胞团簇；卵巢肿瘤；ｅａｓｐａｓｅ一３；ｂｃｌ一２　［中图分类号］　Ｒ　９６９．４　［文献标识码］　Ｂ　［文章编号］　１００８—９２７６（２００８）０３—０２２４—０４　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｔｈｒｅｅ・ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ａ２７８０　Ｃｅｌｌ　ｏｆ　Ｏｖａｒｉａｎ　Ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ＧＡ０　Ａｉ—ｌｉａｎ　（Ｆａｍｉｌｙ　Ｐｌａｎｎｉｎｇ　Ｃｅｎｔｒｅ　ｏｆ　Ｗｅｉｓｈｉ　Ｃｏｕｎｔｙ，Ｗｅｉｓｈｉ　Ｈｅｎａｎ　４７５００　１　１，Ｃｈｉｎａ）　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ａｎ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｍｕｈｉｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ　ｏｆ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　Ａ２７８０　ａｎｄ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｏｖａｒｙ　ｃａｎｃｅｒ　ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ　ｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ。Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｒｅｅ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｆｏｒｍ　ＭＣＳ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　Ａ２７８０。Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ　Ａ２７８０　ｃｅｌｌ　ｗａｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ａｓ　ｃｏｎ—　ｔｒｏｌ。Ｄｒｕｇ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒ　ｃｅｌｌｓ（ＭＣ）ａｎｄ　ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ（ＭＣＳ）ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ＭＴＴ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｒａｄｉａｌ　ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ　ａｓｓａｙ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｅｆｉｃｉｆｅｎｃｙ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＣＭ）．Ｔｈｅ　ｅｘ—　ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｓｐａｓｅ一３　ａｎｄ　ｂｃｌ一２　ｉｎ　Ａ２７８０／ＭＣ　ａｎｄ　Ａ２７８０／ＭＣＳ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＲＴ—ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａ２７８０／ＭＣ　ｗａｓ　ｃｏｍｐａｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｍａｓｓ　ａｆｔｅｒ　２　ｄａｙｓ　ｉｎ　ｔｈｒｅｅ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｏｄｅ１．ａｎｄ　Ｍ　ＣＳ　ｈａｄ　ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　ｔｗｏ　ｌａｙｅｒｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｗｉｔｈｉｎ　５　ｄａｙｓ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　Ａ２７８０／ＭＣ，Ａ２７８０／ＭＣＳ　ｗｅｒｅ　ｍｏｒｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　ｄｒｕｇ，　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｏｆ　Ａ２７８０／ＭＣ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｓｐａｓｅ－３　ｉｎ　Ａ２７８０／　ＭＣＳ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｓｈａｒｐｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　Ａ２７８０／Ｍｃ　ｃｅｌｌｓ，ｂｕｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｂｃｌ一２　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　Ａ２７８０／Ｍｃ　ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ＭＣＳ　ｍａｙ　ｂｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓ—　ｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｃａｓｐａｓｅ一３　ａｎｄ　ｂｃｌ一２．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　ｍｕｈｉｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ；ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ｃａｓｐａｓｅ一３；ｂｃｌ一２　实体瘤对放化疗的敏感性下降是影响肿瘤治疗　效果的主要原因之一。既往在肿瘤体外耐药研究中　通常采用单层培养模型，该模型耐药的基本单位是　单个瘤细胞，明显忽略了肿瘤生长的微环境和瘤细　距…。在三维培养时，肿瘤细胞耐药性比单层细胞　明显增强，而与在体肿瘤相近，即群集耐药（ｍｕｌｔｉ－　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）。诱导凋亡是化疗药物作用　的重要机制，抑制凋亡直接影响到化疗敏感性　，　而ｃａｓｐａｓｅ一３和ｂｃｌ－２是最重要的凋亡相关蛋白。为　此，笔者探讨了在卵巢癌细胞群集耐药与凋亡相关　蛋白ｃａｓｐａｓｅ一３及ｂｃｌ一２改变的可能关系。　、　胞间的相互作用，肿瘤细胞脱落后，长成实体瘤或以　多细胞的形式悬浮于腹水中。研究发现，在体肿瘤　对化疗的敏感性与单层培养的肿瘤细胞常有较大差　收稿日期：２００７—１０—２７　作者简介：高爱莲（１９７０一），女，河南省尉氏县人，硕士在读，主治医师，从事妇产科临床工作。　维普资讯 http://www.cqvip.com 第３期　高爱莲　体外三维培养卵巢癌Ａ　２　７８０细胞及其多药耐药机制的实验研究　‘２２３・　验组，Ａ　２　７８０／ＭＣ组和Ａ　２　７８０／ＭＣＳ组，加终浓度　１材料与方法　２．０　ｍｍｏｌ・Ｌ　和１０．０　ｍｍｏｌ・Ｌ　紫杉醇作用后继续　１．１　材料　主要试剂：人卵巢癌敏感细胞株　培养２４　ｈ，消化收集２组细胞制备成单细胞悬液，用　Ａ　２　７８０购自武汉大学菌种保藏中心。ＰＩ、四甲基偶　１００　ＩｘＬ　ＰＢＳ重悬细胞，加入ＰＩ染色试剂３００　ＩｘＬ，室温　氮唑盐（ＭＴＴ）、琼脂糖为Ｓｉｇｍａ公司产品；ＲＴ—ＰＣＲ　避光孵育１５　ｍｉｎ，流式细胞仪（ＦＡＣＳ　Ｃａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ　试剂盒购自ＴＯＹＯＢＯ公司，紫杉醇购自北京四环医　—Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ公司）检测，以Ｃｅｌｌ　Ｑｕｅｓｔ分析。　药科技股份有限公司。　１．２．４　紫杉醇作用前后ＲＴ．ＰＣＲ检测细胞内　１．２　方法　ｃａｓｐａｓｅ．３，ｂｃｌ一２的ｍＲＮＡ水平Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取细　１．２．１　多细胞球体模型的建立　本实验采用三维　胞总ＲＮＡ，并逆转录成ｅＤＮＡ，取１　Ｌ行ＰＣＲ反应。　培养方法（ｔｈｒｅｅ．ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ）获得多细胞球　Ｃａｓｐａｓｅ一３引物序列：上游为：５　．ＣＧＴ　ＧＴＡ　ＴＴＧ　体。首先用无血清培养液ＤＭＥＭ将琼脂糖稀释成　ＴＧＴ　ＣＣＡ　ＴＧＣ　ＴＣＡ　Ｃ．３　；下游为５　一ＣＣＡ　ＴＣＡ　ＴＴＧ　１．５％的溶液，高压灭菌后在１２孔板上铺一浅层，冷　ＡＣＡ　ＧＴＴ　ＡＣＴ　ＴＧＣ　ＴＣＣ．３　，扩增片断长度为　却后调整细胞浓度种板，Ａ　２　７８０细胞（６×１０。・　２７ｌ　ｂｐ；Ｂｅｌ一２引物序列：上游为：５　一ＣＧＡ　ＣＧＡ　ＣＴＴ　ｍｌ　）０．５　ｍｌ轻轻振荡，２４　ｈ后部分换液，４８　ｈ后可　ＣＴＣ　ＣＣＧ　ＣＣＧ　ＣＴＡ　ＣＣＧ　Ｃ．３　，下游为：５　．ＣＣＧ　见由多个细胞组成的细胞团，５　ｄ后多细胞球体　ＣＡＴ　ＧＣＴ　ＧＧＧ　ＧＣＣ　ＧＴＡ　ＣＡＧ　ＴＴＣ　Ｃ．３　，扩增片段　形成。　长度为３１８　ｂｐ。Ｂ—ａｃｔｉｎ上游序列为：５　．ＡＡＧ　ＡＧＡ　１．２．２　Ａ　２　７８０／ＭＣ和Ａ　２　７８０／ＭＣＳ药物敏感性的　ＧＧＣ　ＡＴＣ　ＣＴＣ　ＡＣＣ　ＣＴ　３　；下游序列为：５　一ＧＧＡ　测定　Ａ　２　７８０／ＭＣ细胞的药物敏感性测定采用　ＡＧＧ　ＡＡＧ　ＧＣＴ　ＧＧＡ　ＡＧ－３　，扩增片段长度为６１８　ＭＴＴ法　。三维培养的Ａ　２　７８０／ＭＣＳ细胞药敏测　ｂｐ。循环条件为：９４℃变性４　ｒａｉｎ　４５　Ｓ，之后９４℃　定采用ｒａｄｉａｌ　ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ测定法　，主要步骤如下：①　变性４５　Ｓ，５５℃变性１　ｍｉｎ，７２℃变性１　ｍｉｎ，共３０　接种细胞：取直径基本相同的Ａ　２　７８０／ＭＣＳ接种于　个循环，最后７２℃延伸５　ｍｉｎ。取３Ｉｘｌ　ＰＣＲ产物进　已用２％琼脂糖铺底的９６孔培养板中，静置培养过　行１．５　ｇ・Ｌ　琼脂糖凝胶电泳，紫外照相并进行扫　夜；②加药：各孔中加入不同浓度的紫杉醇１００　Ｉｘｌ　描分析，实验重复３次。　（终浓度１００、２００、３００、４００、５００　ｍｇ・Ｌ　），并设不　１．３统计学方法用ＳＰＳＳ　１３统计软件进行处理，　加紫杉醇的对照孔，３孔平行，继续培养２４　ｈ；③转　采用ｔ检验和Ｘ　检验，Ｐ＜０．０５有统计学意义。　孔培养：Ａ　２　７８０／ＭＣＳ转入未用琼脂糖铺底的９６　孔培养板中，洗涤２次，继续培养７２　ｈ，使细胞从球　２　结果　体向外围生长；④固定、染色：小心吸弃培养液，加入　２．１　三维细胞培养模型生长状况　培养２４　ｈ后，　５　ｍｇ・ｍｌ　亚甲基蓝溶液１５０　ｌ／孔，固定并染色细　细胞部分聚集成由数个细胞组成的细胞团；细胞呈　胞；⑤测定：ＰＢＳ洗３次，测定细胞从球体向外围生　球形，透明，折光性好。培养２—５　ｄ后，培养液内可　长的距离并记录。计算抑制率和半数抑制浓度　见大量的由多个细胞组成的细胞团，细胞团大小不　（ＩＣ５０）。　一，所含细胞数由近百个到数十个不等，细胞问的粘　１．２．３　紫杉醇作用后细胞凋亡率的检测　分２个实　附力较弱，轻轻吹打即分离，见图１。　一　一　图１　三维细胞培养模型生长状况（×２００）　Ａ：培养２　ｄ多细胞球体形成情况；Ｂ：培养３　ｄ多细胞球体形成情况；Ｃ：培养５　ｄ多细胞球体形成情况　２．２　药物敏感性的比较　Ａ　２　７８０／ＭＣＳ的药物敏　可见三维培养细胞对紫杉醇的耐药性增加。　感性比Ａ　２　７８０／ＭＣ明显降低。Ａ　２　７８０／ＭＣ和Ａ　２　２．３　紫杉醇作用后细胞凋亡率的改变　紫杉醇２　７８０／ＭＣＳ的紫杉醇ＩＣ５０值分别为（０．４０５±０．０７２）　ｍｍｏｌ・Ｌ　和１０　ｍｍｏｌ・Ｌ　作用后２４　ｈ，Ａ　２　７８０／　和（１．２２６±０．０６４），二者有显著性差异（Ｐ＜０．０１），　ＭＣＳ细胞的凋亡率分别为（２．１８±１．６３）％和（５．２３　维普资讯 http://www.cqvip.com

维普资讯 http://www.cqvip.com

第３期　高爱莲　体外三维培养卵巢癌Ａ　２　７８０细胞及其多药耐药机制的实验研究　・２２５・　巢癌细胞群集耐药过程中细胞凋亡受抑制的一种潜　ｔｕｍｏｒｓ　ａｎｄ　ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄ￣Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，２００１，６４：２１ｌ一２３３．　在机制。Ｂｃｌ一２通过抑制细胞凋亡，增加不稳定性基　［２］　司徒镇强，吴军正．细胞培养［Ｍ］．修订版，西安：世界图书出　因，干扰ＤＮＡ修复过程，使得肿瘤细胞进一步分化，　版公司西安分公司，２００４．　［３］　Ｗａｌｋｅｒ　Ｊ，Ｍａｒｔｉｎ　Ｃ，Ｃａｌｌａｇｈａｎ　Ｒ１　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＯｇｌｙｃｏｐ　ｒｏｔｅｉｎ　延长其生存时间，从而导致耐药产生。Ａ　２　７８０／　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ＸＲ９５７６　ｉｎ　ａ　ｓｏｌｉｄ　ｔｕｍｏｕｒｍｏｄｅｌ　ｃａｎ　ｒｅｓｔｏｒｅ　ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　ＭＣＳ细胞的药物敏感性显著下降，二者在药物处理　ｄｒｕｇ　ｅｆｉｆｃａｃｙ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２００４，４０（４）：５９４—６０１．　后的生长分数有显著性差异，卵巢癌细胞群集耐药　［４］　Ｄｉｎｇ　Ｚ。Ｙａｎｇ　Ｘ，Ｐａｔｅｒ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｓ　ｃｏｒｒｅｌａ。　可能与肿瘤细胞内ｂｅｌ一２的过度表达和ｃａｓｐａｓｅ一３　ｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｃａｓｐａｓｅ一３　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｍｕｈｉｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｉｔａｎｔ　的表达下降有关。　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ＆Ｂｉｏｐｈｙ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍ，２０００，２７０：４１５—４２０．　另外，Ａ　２　７８０／ＭＣＳ细胞问黏附广泛而紧密。　［５］　Ｋｏｊｉｍａ　Ｈ，Ｅｎｄｏ　Ｋ，Ｍｏｒｉｙａｍａ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ａｂｒｏｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｔｏｃｈｏｎ—　而细胞问黏附对细胞（包括肿瘤细胞）的性质起重　ｄｒｉａｌ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｅ　ｒｅｌｅａｓｅ　ａｎｄ　ｃａｓｐａｓｅ２３　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　要作用，特别是凋亡。介导细胞间黏附的细胞黏附　ｍｕｈｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９９８，２７３：ｌ６　６４７一　分子具有抗凋亡作用，其中可能有ＮＦ—ＫＢ信号转导　ｌ６　６５０．　通路的参与　，而ＮＦ—ＫＢ也可通过上调ｂｅｌ一２而达　［６］　Ｒｅｙｅｓ　Ｒｅｙｅｓ　Ｍ，Ｍｏｒａ　Ｎ，Ｚｅｎｔｅｌｌａ　Ａ，ｅｔ　ａｌ，Ｐｈ０ｓｐｈａ【ｉｄｙｌｉｎ０ｓｉｔ０ｌ　３　ｋｉｎａｓｅｍｅｄｉａｔｅｓ　ｉｎｔｅｇｒｉｎｄｅｐｅｎ—ｄｅｎｔ　ＮＦ・－ｋａｐｐａＢ　ａｎｄ　ＭＡＰＫ　ａｃｔｉ・－　到抗凋亡的目的　，提示ＮＦ—ＫＢ在群集耐药中作用　ｒａｔｉｏｎ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｓｅｐａｒａｔｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ，２００１，　的机制可能是上调Ｂｃｌ一２而抗化疗药物诱导的凋　ｌ１４（Ｐｔ　８）：１　５７９一ｌ　５８９．　亡，有必要在今后进行这方面的深入研究。　［７］　Ｈａｎ　Ｓ，Ｓｉｄｅｌｌ　Ｎ．ＲＵ４８６一ｉｎｄｕｃｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｅｎ—　ｄｏｍｅｔｒｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｓ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ—ｋａｐｐａ　Ｂ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　参考文献：　ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｅｎｄｏｃｒｉ　ｎｏｌ　Ｍｅｔａｂ，２００３，８８（２）：７ｌ３—７１９．　［１］Ｔ　Ｄｕｒａｎｄ　Ｒ　Ｅ，Ｏｌｉｖｅ　Ｐ　Ｌ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｃｈｅｍｏ—ａｎｄ　ｒａ＿　［责任编校：杨红梅］　ｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ　ｍｏｄｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｓｏｌｉｄ　（上接第２ｌ６页）　ｈｅａｒｔ　ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，１９８６，２：５３３—５３７．　相关，提示其对病理状态下的凝血平衡具有重要作　［３］　康文英，王鸿利，熊立凡，等．中国汉族人群凝血因子ＶＩＩ基因　用　。在本实验中，Ｈ７等位基因在对照组中的分　中三个多态位点的研究［Ｊ］．中华血液学杂志，２００２，８（２３）：　４３５—４３７．　布明显高于静脉血栓组（Ｐ＜０．０５，ＯＲ＝０．７ｌ３，９５％　［４］　Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ　Ｇ，Ｇｅｍｍａｔｉ　Ｄ，Ｐａｔｒａｃｃｈｉｎｉ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．ＰＣＲ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＩ：０．５ｌ５～０．９８９），提示Ｈ７等位基因可能是河南　ａ　ｒｅｐｅａｔ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｗｉｔｈｉｎ　ｔｈｅ　Ｆ７　ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　汉族人群深静脉血栓发病的一个遗传保护因子。欧　Ｒｅｓ．１９９１，１９：４　５７０—４　５７４．　洲人群中Ｈ７等位基因的分布频率为３１．４％，而在　［５］Ｊｕｎｋｅｒ　Ｒ，Ｈｅｉｎｒｉｃｈ　Ｊ，Ｓｃｈｕｈｅｒ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒⅦａｎｄ　上海地区人群中Ｈ７的分布频率为４７％　，本实验　ｔｈｅ　ｒｉｓｋ　ｏｆ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ｈｅａｒｔ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｍｅｎ［Ｊ］．Ａｒｔｅｒｉｏｓｅｌｅｒ　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｖａｓｃ　Ｂｉｏｌ，１９９７，１７（８）：１　５３９一ｌ　５４３．　中，河南地区Ｈ７等位基因的分布频率为５１．８％，明　［６］　Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ　Ｍ，Ｄａｗｓｏｎ　Ｇ，Ｓｅｍｂｈｉ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ　ｄｅｐｅｎｄ—　显高于欧洲人群。Ｈｅｒｒｍａｎｎ　ＦＨ等研究发现了Ｈ４　ｅｎｅｅ　ｏｆ　ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＩ　ｃｏａｇｕｌａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｄｅｅｐ　ｖｅｎｏｕｓ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　和Ｈ９等位基因，本实验中，检测到了比较少见的　［Ｊ］．Ｔｈｒｏｍｂ　Ｈａｅｍｏｓｔ，１９９６，７６（４）：５００—５０１．　Ｈ５等位基因¨　，并在国内首次发现了Ｈ４等位基　［７］　徐丹梅．凝血因子ＶＩＩ基因多态性及其临床意义［Ｊ］．血栓与　因，没有发现罕见的Ｈ９等位基因。进一步说明了　止血学，２００２，２（８）：８７—８９．　［８］ｌａｃｏｖｉｅｌｌｏ　Ｌ，Ｄｉ　Ｃａｓｔｅｌｎｕｏｖｏ　Ａ，Ｄｅ　Ｋｎｉｊｆｆ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｎ　ＩＶＳ７多态性等位基因分布的复杂性，可能存在种族　ｔｈｅ　ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　Ｖｌｌ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｉｓｋ　ｏｆ　ｍｙｏｃａｒｄｉｃａｌ　ｉｎｆａｒｃ—　或地域的差异，仍需要扩大样本量进行更深入的　ｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ，１９９８，３３８：７９—８５．　研究。　［９］　Ｋａｎｇ　Ｗｅｎ—ｙｉｎｇ，Ｗａｎｇ　Ｈｏｎｇ—ｌｉ，Ｘｉｏｎｇ　Ｌｉ—ｆａｎ，ｅｔ　ａ１．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　致谢：本实验在河南省医学分子重点实验室　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｆａｃｏｒ　Ｖｌｌ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｌａｓｍａ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ｔｏ　ａｃｕｔｅ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ａｌｌｅｌｉｃ￣ｅｑｕｅｎｃｉｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　完成。　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ａｎｄ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ，　参考文献：　２００４，ｌ１７（１）７ｌ一７４．　［１０］Ｈｅｒｒｍａｎｎ　ＦＨ，Ｓａｌａｚａｒ—Ｓａｎｃｈｅｚ　Ｌ，Ｓｃｈｕｓｔｅｒ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ　［１］Ｈａｇｅｎ　ＦＳ，Ｇｒａｙ　ＣＬ，Ｈａｒａ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　ｅｉｇｈｔ　ｍｏｌｅｃｕｌｒａ　ｍａｒｋｅｒｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ　ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｉｎ　ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＩ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，１９８６，　ｓｉｘ　Ａｍｅｒｉｎｄｉａｎ　ｔｒｉｂｅｓ　ａｎｄ　ｔｗｏ　Ａｆｉｒｃａｎ　ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　Ｃｏｓｔａ　Ｒｉｃａ［Ｊ］．　８３：２　４ｌ２—２　４１６．　Ａｍ　Ｊ　Ｈｕｍ　Ｂｉｏｌ，２００４，ｌ６（１）：８２—８６．　［２］　Ｍｅａｄｅ　ＴＷ，Ｍｅｌｌｏｗ　Ｓ，Ｂｒｏｚｏｖｉｃ　Ｍ，　ｅｔ　ａ１．Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　［责任编校：杨红梅］　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｈｅａｒｔ　ｄｉｓｅａｓｅ：ｐｒｉｎｃｉｐａｌ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｏｒｔｈｗｉｅｋ　ｐａｒｋ