用于多孔板细胞分析的自动显微成像系统

第２１卷第１Ｏ期　光学精密工程　Ｏｐｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｖｏ１．２１　ＮＯ．１０　Ｏｃｔ．２Ｏ１３　２０１３年ｌＯ月　文章编号１００４—９２４Ｘ（２０１３）１０—２５４３—０６　用于多孔板细胞分析的自动显微成像系统　韩西达　，王　敏　，黄　强　，何永红　，周超英　（１．清华大学深圳研究生院光学检测与成像实验室，广东深圳５１８０５５；　２．哈尔滨工业大学深圳研究生院机电工程与自动化学院，广东深圳５１８０５５）　摘要：设计了用于多孔板细胞分析的自动显微系统以实现药物筛选的自动检测。研究了系统的机械结构、人机交互软　件、对焦评价函数的选择和多视野图像拼接功能。该系统采用支架式结构，克服了形变带来的精度影响；对比传统机械　传动的优缺点后，采用伺服电机和音圈电机两级调节的方式来提高系统精度和对焦速度。比较了几种对焦评价函数的　性能并提出性能更优的评价方法。考虑到高倍显微镜下视野小对实验统计意义的影响，设计了多视野图像拼接等图像　处理功能。最后，实验验证了系统的设计技术指标。实验结果表明：单次对焦时间为２　Ｓ；对焦精度在微米级；单次４×４　图像阵列拼接时间为１５ｓ，满足系统进行药物筛选对速度、自动化程度和稳定可靠性的要求。　关　键词：显微成像；细胞分析；多孔板；自动对焦；图像拼接　文献标识码：Ａ　ｄｏｉ：１０．３７８８／ＯＰＥ．２０１３２１１０．２５４３　中图分类号：ＴＨ７４２．９；ＴＨ７０３　Ａｕｔｏ。。ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅｓ　ＨＡＮ　Ｘｉ—ｄａ　，ＷＡＮＧ　Ｍｉｎ　，ＨＵＡＮＧ　Ｑｉａｎｇ　，ＨＥ　Ｙｏｎｇ—ｈｏｎｇＨ，ＺＨＯＵ　Ｃｈａｏ—ｙｉｎｇ　（１．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｏｐｔｉｃａｌ　Ｉｍａｇｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｎｓｉｎｇ，Ｇｒａｄｕａｔｅ　Ｓｃｈｏｏｌ　ａｔ　Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｔｓｉｎｇｈｕａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　５１８０５５，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　Ｇｒａｄｕａｔｅ　Ｓｃｈｏｏｌ，　Ｈａｒｂｉｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　５１８０５５，Ｃｈｉｎａ）　＊Ｃ０ｒｒ　ｓ　０　ｇ　ａｕｔｈｏｒ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｅｙｈ＠ＳＺ．ｔｓｉｎｇｈｕａ．ｅｄｕ．ｃｎ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎ　ａｕｔｏ—ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　３Ｄ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ａｎｄ　ａｕｔｏ—ｆｏｃｕｓ　ａｔ　ｅａｃｈ　ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｍｉｃｒｏ—ｉｍａｇｉｎｇ　ｏｆ　ｄｒｕｇ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｍａｎ—　ｍａｃｈｉｎｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅ，ｔｈｅ　ｓｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｍａｇｅ　ｔｉｔｃｈｉｎｇ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉ—ｖｉｅｗ　ｉｍａｇｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗｅｒｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ．Ａ　ｒａｃｋ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｗａｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｔｏ　ｏｖｅｒｃｏｍｅ　ｔｈｅ　ｌｉｍｉ—　ｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｃｕｒａｃｙ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａ　ｓｅｒｖｏ　ｍｏｔｏｒ　ａｎｄ　ａ　ｖｏｉｃｅ　ｃｏｉｌ　ｍｏｔｏｒ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ａｓ　ａ　ｔｗｏ—ｓｔａｇｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ　ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ａｃｃｕｒａｃｙ　ａｎｄ　ｆｏｃｕｓ　ｓｐｅｅｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅｎ，ａｎ　ａｌｇｏ—　ｒｉｔｈｍ　ｏｆ　ａｕｔｏ—ｆｏｃｕｓ　ｗａｓ　ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｓｅｖｅｒａｌ　ａｕｔｏ—ｆｏｃｕｓ　ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ａｃ—　ｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａ　ｓｍａｌｌ　ｖｉｅｗ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｐｏｗｅｒ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍａｇｅ　ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ　ｗａｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｔｏ　ｆｉｔ　ｔｈｅ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｏｎ　ｔｈｅ　收稿日期：２０１３—０５—２３；修订日期：２０１３—０６—１８．　基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．６１２７５１８８，Ｎｏ．８１１７１３７５）；深圳市杰出青年基金资助项目；国家重点实　验室开放基金资助项目（Ｎｏ．１２Ｋ０５ＥＳＰＣＴ）　光学精密工程　第２ｌ卷　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｔｉｍｅ　ｔＯ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ａｕｔｏ—ｆｏｃｕｓ　ｉｓ　２　Ｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｃｃｕｒａｃｙ　ｏｆ　ａｕｔｏ—ｆｏｃｕｓ　ｃａｎ　ｒｅａｃｈ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒｓ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅ　ｔｉｍｅ　ｔｏ　ｃｏｍｂｉｎｅ　ｔｈｅ　ｍｉｃｒｏ—　ｉｍａｇｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　ａ　４×４　ａｒｒａｙ　ｉｓ　１　５　Ｓ．Ｔｈｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｃａｎ　ｓａｔｉｓｆｙ　ｔｈｅ　ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｓｈｏｒｔ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ．　ｒｏｂｏｔｉｚａｔｉｏｎ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ａｎａｌｙｚｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅｓ　ｉｎ　ｄｒｕｇ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｍｉｃｒｏ—ｉｍａｇｉｎｇ；ｃｅｌｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ；ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ；ａｕｔｏ—ｆｏｃｕｓｉｎｇ；ｉｍａｇｅ　ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ　引　言　随着电子技术、控制技术与计算机技术的发　展，光学仪器对自动化、智能化的要求越来越高口］，　而应用显微镜进行药物筛选实验时，往往都是以人　工方式进行的，这种方式耗费时间和人力，很难大　规模筛选。因此，发展自动对焦显微镜的需求日益　迫切。现有的自动对焦显微镜已经实现了实验室　显微镜的自动化，即自动调焦迅速找到最清晰的图　像，然后用计算机控制自动切片扫描，进行医疗诊　断、病理分析和实时教学等功能。不过这些都是针　对实验室的切片检测，行程小，智能化程度低，难以　满足现代医学大规模药物筛选的需求。　近年来，药物研发的过程中越来越重视筛选　研究，利用细胞内荧光的聚集度来进行药物筛选　的方法正在迅猛发展。有文献报道［２］ＤＮＡ损伤　（电离辐射或紫外线照射等）后，组蛋白被迅速地　磷酸化募集其他蛋白到损伤部位形成荧光“焦点”　结构，焦点的数量与电离辐射引起的双链断裂数　量存在一一对应关系，表明这一指标极有可能成　为检测细胞ＤＮＡ损伤的新的特异性指标　］。　因此测量每个细胞荧光“焦点”结构总面积这种量　化的方法适用于大规模药物筛选＿６］。在获取细胞　图像时，由于被测样品量大，而以往的显微镜检测　视野小、操作繁琐，检测一张９６孔板需要几个小　时的时间，难以满足实验需求。因此研制能实现　大规模药物筛选，适应能力强，速度快，可靠性能　好，操作简单，用于多孔板药物分析的自动显微成　像系统是十分必要的。　本文针对以往对药物检测方法存在的不足，　设计了用于多孔板药物分析的自动显微成像系　统。针对该系统设计了大行程二维平移台，可以　同时检测４个９６孔板；开发了集孔位扫描、自动　对焦、图像拼接、图像信息输出等功能于一体的软　件，满足用户实验需求。在显微镜自动对焦关键　技术上讨论了几种对焦评价函数，并提出了新的　评价方法。对比传统机械传动的优缺点，采用伺　服电机和音圈电机（直线电机）两级调节的方式，　提高了显微镜的绝对精度。实验证明本系统在完　成筛选工作要求的同时，具有很好的稳定性和可　靠性，且检测速度快、精度高、自动化程度高。　２　用于多孔板细胞分析的自动控制　显微系统的工作原理及构成　２．１显微系统的工作原理　图１所示为多孔板细胞分析的自动显微成像　系统成像原理图。如图所示，多孔板细胞分析的自　动显微成像系统用ＣＣＤ通过单筒显微镜拍摄检测　药品，通过机械机构上下移动ＣＣＤ，代替了粗调或　者微调的功能，改变显微镜成像系统的物距，获取　图像传人计算机。然后对获取的图像通过自行开　发的软件进行处理，获得实验结果。图中９６孔板　板孔中的细胞在底部的位置分布高低不同，其对焦　位置各不相同，手动对焦必然耗费大量时间。本系　统的设计大大减轻了操作者的劳动强度，减少或避　免操作者因反复调焦造成的主观误差，也省去了复　杂的调焦步骤，大大的方便了操作者　］。　白光源　图１系统成像原理图　Ｆｉｇ．１　Ｉｍａｇｉｎｇ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ｏｆ　ｓｙｓｔｅｍ　图２所示为多孑Ｌ板细胞分析的自动显微成像　系统工作原理图，主要由电机控制部分、机械传动　部分、显微成像系统和ＰＣ机控制台组成。电机　第１０期　韩西达，等：用于多孔板细胞分析的自动显微成像系统　控制部分由运动控制卡、电机驱动器和交流伺服　电机组成。机械传动部分由Ｘｙ载物台和Ｚ轴运　动部件。显微成像子系统由科学级ＣＣＤ和单筒　显微镜头组成。系统工作时，ＰＣ控制台发出指　令，由显微成像系统获得图像信息，电机控制部分　和机械传动部分保障运动精度，由软件输出最后　图像信息。　图２系统工作原理图　Ｆｉｇ．２　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　２．２显微系统的机械构成　为增大测量范围并提高绝对对焦精度，系统采　取两级调节方式，由伺服电机带动精密丝杆模组进　行粗调，音圈电机直驱进行微调。其中，粗调采取　研磨级滚珠丝杠，丝杆运动３００　ｍｍ导程误差在８　ｍ；微调采用音圈电机，理论定位精度达到１　ｔｉｍ。　系统整体结构充分考虑到机械变形、ｚ轴自重对系　统精度的影响。采取如图３所示的支架式结构，添　加加强筋，克服形变带来的精度影响。　支架　强筋　图３系统机械结构示意图　Ｆｉｇ．３　Ｓｙｓｔｅｍ　ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｄｉａｇｒａｍ　图３中的机械传动装置包括ｘｙ载物台和ｚ　轴调焦装置，可以在软件的控制下按用户要求运　动。系统中加入大行程Ｘｙ载物台，可以同时安　放４张９６孔板并快速精确地进行孔板扫描，完全　可以适应大通量样品检测。Ｘｙ载物台使用研磨　级滚珠丝杠作为传动装置，定位精度在８肚ｍ，小　于９６孔板孔中心问隔的１／１　０００，满足孔位扫描　精度需求。系统通过软件控制大规模药物自动检　测，取代目视观察，数字成像效率高速度快，消除　了由于观察者不同带来的主观差异性，大大提高　了实验效率和测量精度。　３　显微系统的软件设计　３．１软件模块设计　该软件在ＶＣ＋＋编译环境下，使用多轴控制　卡提供的动态数据链接库，可分别或同时控制Ｘ、　ｙ、Ｚ轴的运动，可以设置各轴的起始速度、最大速　度、加速时间、运动方式选择等。同时也可实时监　测各轴运动状态是否出现异常情况，若出现异常则　立即停机，直至解除异常。软件设计了循环运动功　能模块，实现了周期性快速精确地移动９６孔板。　设置好运动参数后点击循环运动即开始一个周期　的孔板检测，包括孔板的周期性移动、不同阵列的　周期移动和对焦运动。完成一个周期检测后回到　初始位置，换样后即可进行下一周期的检测。　同时设计了自动对焦模块，系统在工作时，通　过Ｚ轴方向上的运动系统实现调焦，带动光学成　像系统沿Ｚ轴方向上下移动＿１　。利用对焦评价　函数计算图像清晰度值即对焦函数评价值，通过　对焦评价函数判断实现正确对焦　］。具体步骤如　图４所示。　图４系统流程图　Ｆｉｇ．４　Ａｕｔｏ—ｆｏｃｕｓｉｎｇ　ｆｌｏｗ　ｃｈａｒｔ　光学精密工程　第２１卷　一ＳＤ一　（ｇ（．ｒ，　）一／１）　］，　一　一　∑∑ｇ（厶厶　Ｉｔ，，’）・Ｙ）．　（２）　Ｖ　２ｇ　‘　一　＋　．㈣　一∑∑ｌ　Ｌ＊ｇ（．ｒ，３，）１．　（８）　为评价最佳对焦位置的评价函数。在开始对焦　时，必须先决定搜索方向，拉普拉斯法在远离最佳　对焦位置时评价值变化过小，若以此做评估，可能　会因为噪声干扰造成远离对焦位置的方向误判。　而方差评价函数在较大的离焦范围内有很好的评　价性能，尽管方差函数的曲线平滑，但计算速度　快，因此选取方差函数来进行粗调焦。　３．３图像拼接功能　考虑到本系统在显微镜下拍摄视野小和小视　野下拍摄的图像显示信息少，不具备统计意义等　问题，本文设计了多视野图像拼接模块以满足实　验需求。　图像拼接技术是将一组相互间重叠部分的图　像序列进行空间匹配对准，经重采样合成后形成　一幅包含各图像序列信息完整的新图像的技术。　同时在消除图像接缝的同时，也要保证拼接图像　的质量不受损失。图像重叠区域的设置采取实验　的方法得出，根据拼接效果试出最优重叠区域，当　电机输入１　４００脉冲信号时，拼接效果最好，此时　平台移动０．５６　ｍｍ，即重叠区域大约是图像的一　半。当继续增大重叠区域时，图像效果变化不明　显，即此时为最优重叠区域。　其图像拼接的基本流程如图５所示。　图５　图像拼接流程图　Ｆｉｇ．５　Ｆｌｏｗｃｈａｒｔ　ｏｆ　ｉｍａｇｅ　ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ　本软件图像拼接功能是基于ＯｐｅｎＣＶ２．４．０　和ＶＣ＋＋平台的图像拼接，利用ＯｐｅｎＣＶ２．４．０　里的Ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ模块，实现图像拼接功能。根据使　用者对图像的要求，可以设置图像阵列，从而改变　图像大小。使用者设置好阵列数值，待获取图像　后点击Ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ便可自动进行图像拼接。　４实验及结果　４．１评价函数比较实验　使用２５倍物镜，光学分辨率为０．８４　ｍ、单　次成像视野面积１．１　ｍｍ、图像像素为１　９２０×　２　５６０。设计实验对几种常用的对焦评价函数进　行比较，使用对焦系统采集了３００幅大小为１　９２０