规模化牛场致病性大肠杆菌的分离与鉴定

第35卷第10期湖北畜牧兽医圆园14第年10期10月HubeiJournalofAnimalandVeterinarySciences灾燥造援October35No援圆园1410规模化牛场致病性大肠杆菌的分离与鉴定杨克礼1渊1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室袁李传友2袁郭锐1袁段正赢1袁田永祥1发公司袁湖北孝昌432900冤袁武汉430064曰2.湖北青禾园生态农业开摘要院湖北省某肉牛场2014年3~4月发生牛腹泻，无菌采集病牛腹泻物进行细菌分离培养，涂片、染色、镜检观察，并对其形态特征、培养特性、生化特性及致病性等生物学特性进行研究。结果表明引起该次疫病的病原是致病性大肠杆菌（）。关键词院牛；致病性大肠杆菌（）；分离；鉴定中图分类号院S852.61文献标识码院A文章编号院1007原273X渊圆园员4冤10-0005-02Escherich大肠埃希氏菌于()通常称为大肠杆菌袁由5调整g蛋白胨pH为尧2.57.2~7.4袁g氯化钠再置蒸汽锅内加热袁放蒸汽锅内加温3030min袁min袁用大肠杆菌中袁1885大多数是不致病的肠道常在菌年首次在动物的肠道内发现[1]袁少数具遥在滤纸过滤遥加入15g的琼脂袁置蒸汽锅内加热至完有致病性遥大肠杆菌病又称大肠杆菌性腹泻袁是由致全溶解遥分装于锥形瓶中袁置高压蒸汽锅内袁121益病性大肠杆菌引起的一种急性传染病遥自从1894年灭菌20min遥待冷却至50益左右时倒入灭菌的培大肠杆菌病首次在瑞典尧荷兰尧法国等养殖业发达国养皿中袁完全冷却后4益保存备用遥家暴发以来袁给世界畜牧业造成了巨大损失[2]1.2.2血液琼脂培养基取上述经灭菌后的普通琼的主要特征为败血症和严重腹泻尧脱水袁引起幼畜大遥该病脂冷至50益左右的普通琼脂100mL袁无菌加入家量死亡或发育不良遥随着我国畜牧业规模化尧集约化兔脱纤维血液15mL袁混匀后倒入灭菌的培养皿中袁饲养模式的发展完全冷却后4益保存备用遥1.2.3伊红美兰琼脂培养基取上述经灭菌后的普了以高热2014袁年食欲废绝3~4袁月间该病的发病率和死亡率逐年增加遥袁排水样袁湖北省某规模化肉牛场发生尧糊状或褐色粪便袁少数通琼脂100mL溶解灭菌袁并冷却至60益左右袁分排血样粪便袁最终消瘦乃至死亡等症状的传染性疾别加入灭菌的病袁全场发病率达30%袁犊牛发病率高达76%袁死亡率达5%遥2皿中mL袁及完全冷却后5%美蓝水溶液20%乳糖溶液4益保存备用1mL袁2mL尧2%遥混匀后倾入灭菌平伊红水溶液为了弄清本次发病的主要病因袁无菌采集病牛1.2.4腹泻物袁从中分离出致病性大肠杆菌袁并对分离获得的菌株进行了生物学特性研究遥g加入SS500琼脂mL蒸馏水中牛肉膏2.5袁加热溶解g尧蛋白胨遥再加入胆盐2.5g尧琼脂49材料与方法g尧酸铁乳糖5g尧枸橼酸钠6g尧硫代硫酸钠6g及枸橼11.17.2遥0.25g袁微热加温使其全部溶解袁调整pH病料备用遥混匀后倾入灭菌平皿中袁完全冷却后4益保存为病牛腹泻物遥无菌采集袁采样人带一次性无菌手1.2.5套直肠采集袁保证一头牛一个手套袁防止交叉污染遥1.2培养基的制备g尧pH乳糖麦康凯培养基1.0g尧胆盐0.5取蛋白胨g和1002.0mLg尧蒸馏水氯化钠0.51.2.1普通琼脂培养基量取牛肉汤500mL袁加入灭菌为157.4袁min袁加入待冷至2.5g50琼脂益左右时袁分装于锥形瓶中袁加入灭菌的袁121袁调整1%中益收稿日期院圆园员4原09原05项目基金院湖北农业科技创新中心项目渊2011-620-001-003冤曰动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室开放课题项目作者简介院杨克礼渊2013ZD156冤渊1976-冤袁男袁安徽怀远人袁助理研究员袁主要从事动物传染病研究曰通讯作者袁田永祥渊1965-冤袁男袁研究员袁主要从事动物传染病研究遥.com.cn. All Rights Reserved.6湖北畜性红水溶液0.5mL袁摇匀后倾入培养皿袁完全冷却后4益保存备用遥1.2.6100min袁mL三糖铁培养基蒸馏水取适量三糖铁琼脂粉袁加入斜面待冷至遥50袁益加热溶解左右时分装试管袁115益袁高压蒸汽灭菌使成底层较深的201.3试剂微量生化鉴定管为杭州微生物试剂有限公司产品袁购自武汉市某商业公司遥1.4试验动物中心实验动物中心8~10gSPF昆明鼠遥袁购自湖北省疾病预防控制1.5细菌的分离培养与鉴定采用需氧和厌氧渊缸内燃烛法冤两种方法袁利用普通琼脂培养基从病料中分离细菌遥对不同形态的菌落进行涂片尧染色尧镜检和纯培养遥将纯培养菌接种于5%血液营养琼脂培养基尧SS琼脂培养基尧伊红美蓝培养基尧三糖铁培养基尧麦康凯培养基袁37益培养24h袁观察细菌培养特性遥1.6分离菌生化试验取生长良好的红色菌落接种于营养肉汤袁37益培养24h袁按常规方法进行生化试验袁主要包括葡萄糖尧乳糖尧麦芽糖尧甘露糖尧蔗糖的发酵试验袁硫化氢尧丙二酸盐利用尧枸橼酸盐利用尧鸟氨酸盐脱羧酶尧赖氨酸脱羧酶尧葡萄糖磷酸盐尧卫茅醇试验等遥1.7动物试验将细菌纯培养物接种于普通肉汤中培养24h袁分别以口腔和腹腔途径各接种5只SPF昆明小鼠袁每只接种0.2mL渊约含108只作为对照袁隔离饲养观察遥CFU/mL冤菌液袁另取22结果与分析2.1分离菌的形态自患牛腹泻物中分离获得纯化菌株1株遥该分离菌为兼性厌氧菌袁在普通营养琼脂培养基上就可以生长袁显微镜下可以见到菌体短小袁两端钝圆尧着色较深,无芽孢袁多呈单个排列,个别形成短链状排列袁革兰氏染色阴性渊图1冤遥图1分离菌株革兰氏染色结果(10伊100)牧兽医2014年2.2分离菌培养特性分离菌在普通琼脂培养基上生长良好袁为中等大小尧边缘整齐尧光滑湿润尧有圆形隆起的菌落遥最适生长温度为37益袁最适生长pH为7.2~7.4遥分离菌在麦康凯琼脂培养基上形成光滑的红色菌落曰在伊红美蓝琼脂培养基上产生黑色袁具有金属光泽的小菌落曰在ss琼脂培养基上一般不生长或生长较差袁菌落明显比前两种的小曰在三糖铁琼脂斜面培养基上形成黄色斜面袁黄色底层并有少量气泡产生曰在血液琼脂培养基上37益培养24h后可以形成灰色菌落袁菌落表面光滑尧边缘整齐袁菌落周围有明显的琢尧茁溶血环遥2.3分离菌生化试验结果分离菌株的生理生化特性见表1遥分离菌株分解葡萄糖尧麦芽糖尧乳糖尧甘露糖尧木糖尧阿拉伯糖尧山梨醇袁不发酵蔗糖尧卫茅醇袁液化明胶袁葡萄糖磷酸尧硫化氢尧枸橼酸盐尧丙二酸盐试验阴性曰鸟氨酸盐脱羧酶尧赖氨酸脱羧酶尧精氨酸水解酶尧苯丙氨酸脱氨酶试验阳性遥表1分离菌株生化试验结果统计项目结果项目结果葡萄糖+山梨醇+乳糖+卫茅醇-麦芽糖+硫化氢-甘露糖+枸橼酸盐-蔗糖-丙二酸盐-木糖+鸟氨酸盐脱羧酶+阿拉伯糖+赖氨酸脱羧酶+明胶液化+精氨酸水解酶+葡萄糖磷酸渊VP冤-苯丙氨酸脱氨酶+注院野+冶表示为阳性曰野-冶表示为阴性遥2.4动物试验结果两种途径接种的小鼠在24~48h内均死亡袁而对照组的小鼠则全部健活袁并且从死亡小鼠的肝组织中分离到接种菌遥3小结与讨论根据临床症状结合实验室诊断袁可以确诊该牛厂发生的牛腹泻是由致病性性大肠杆菌引起的遥在大肠杆菌的致病过程中袁纤毛抗原和肠毒素是两种主要的致病因子[3,4]是利用纤毛抗原粘着于小肠黏膜的上皮细胞上遥肠致病性大肠杆菌首先袁然后大量繁殖袁并产生肠毒素遥消化道途径是致病性大肠杆菌侵入机体的主要途径袁它通过菌体表面的一种对宿主特异性的粘附因子粘附到宿主小肠黏膜表面并繁殖袁分泌肠毒素袁引起肠黏膜细胞水与电解.com.cn. All Rights Reserved.第35卷第10期湖北畜牧兽医圆园14第年10期10月HubeiJournalofAnimalandVeterinarySciences灾燥造援October35No援圆园1410糙米替代玉米对蛋鸡产蛋性能和蛋品质的影响黄少文袁皮劲松袁张巍袁魏金涛袁赵娜武汉袁杨雪海袁严念东渊湖北省农业科学院畜牧兽医研究所袁430064冤摘要院试验采用早籼糙米替代饲粮中玉米的比例分别为100%、75%、50%，饲喂产蛋期湖北红鸡。结果表明，蛋鸡的产蛋率、饲料转化率、蛋的品质试验各组和对照组差异不显著（>0.05），用糙米替代玉米饲喂蛋鸡，不同的替代比例均无差异。但蛋黄颜色随糙米用量的增加有变浅的趋势，添加饲用色素可解决此问题。关键词院糙米；玉米；蛋鸡；产蛋率；饲料利用率；蛋品质中图分类号院S831文献标识码院A文章编号院1007原273X渊圆园员4冤10-0007-031材料与方法料一致遥玉米为市场购买袁糙米为市场购买的早籼稻谷自己加工而成遥为保证试验饲料新鲜袁每两周配料1.1试验设计一次遥渊100%冤+试验共设1.4饲养管理渊0%冤+糙米4渊0%冤曰个组院试验对照组袁基础饲料+玉米试鸡采用全阶梯笼养袁自由饮水袁粉料自由采渊25%冤+糙米渊50%冤+糙米渊100%冤曰渊75%冤曰试验1试验2组袁基础饲料+玉米3组组袁袁基础饲料+玉米食遥日常管理与防疫按常规进行遥1.5测定项目1.5.1产蛋率、破蛋率和产蛋量产蛋率达到5%时袁1.2试验蛋鸡的选择与分组糙米渊50%冤遥基础饲料+玉米开始记录遥每天分组记录产蛋数尧破蛋数袁称蛋重遥选择21周龄的健康湖北红鸡母鸡420只袁随机1.5.2饲料消耗量、采食量和饲料利用率饲料消耗分为4组遥每组3个重复袁35只袁预试1周后正式进量采用清箱底办法分组统计袁计算饲料利用率和采行试验遥试验时间为22~33周龄袁共77d遥食量遥1.3试验日粮配制各组日粮配方与营养水平见表1遥各组基础饲收稿日期院圆园员4原08原21基金项目院湖北省农业科技创新中心资助项目渊2011-620-001-003冤曰国家蛋鸡产业技术体系建设专项渊CARS-41-K19冤作者简介院黄少文渊1967-冤袁男袁湖北汉川人袁副研究员袁主要从事动物营养与饲料科学研究遥质的代谢紊乱袁导致腹泻[5]本次分离获得的致病性大肠杆菌是何种血清型本次疫病的发生主要是受外界不良因素的刺遥及其药物敏感性分析袁有待于进一步研究遥激遥由于畜舍内环境卫生条件较差袁导致动物机体参考文献院抵抗力降低袁再加上致病菌的大量繁殖袁造成动物[1]王德志发病遥为降低该病的发生袁在今后的饲养管理过程究[D].黑龙江大庆.中药抑制牛源致病性大肠杆菌对环丙沙星耐药的研院黑龙江八一农垦大学,2009.中袁应注意环境清洁袁保持畜舍清洁干燥袁及时清除[2]徐究粪便和污物[D].兵山东泰安.潍坊地区肉鸡大肠杆菌病的病原分离鉴定与防控研院山东农业大学,2012.袁最好能够每日用菌毒杀对牛栏消毒1次袁同时合理搭配日粮袁尽量减少应激反应袁增强机[3]高致病机理的研究进展研,李卫芬,马国霞[J]..上海畜牧兽医通讯产肠毒素大肠杆菌主要致病因子及其,2006(5)2-5.体的抗病力遥[4]崔玉东对于该病的预防袁可以选择与本场致病菌血清[J].中国兽医杂志,刘桂清,朴范泽.育成牛大肠杆菌肠毒血症病原分离鉴定型一致的大肠杆菌苗或用本场致病菌株制备自家[5]陈明勇菌苗进行免疫某些生物学特性的研究,陈德成,贾君镇袁1994袁20渊1冤院9-10.,等遥发病时袁通过药敏试验筛选有效的[J]..牦牛肠毒素型大肠杆菌的分离鉴定和中国预防兽医学报袁2002,24渊4冤院277-抗菌药物进行治疗遥279..com.cn. All Rights Reserved.