2014届毕业（设计）论文
题 目 专业班级 学 号 学生姓名 学 院 指导教师 指导教师职称
完成日期： 年 月 日
基于壳聚糖/石墨烯复合膜的安培型过氧化氢
生物传感器
Amperometric biosensor based composite matrix
hydrogen peroxide on graphene/chitosan
学生姓名
指导教师
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武汉工程大学本科毕业(设计)论文
摘 要
研制出一种基于壳聚糖/石墨烯有机—无机复合膜作为固定基质的酶生物传感器。将壳聚糖、石墨烯、辣根过氧化物酶混合均匀后，用滴涂法将混合溶液滴到已经打磨光滑且干净的金电极表面晾干后制得复合膜电极.使用循环伏安法(CV）和计时电流法(I—T)，用对苯二酚作为电子传递体实现对过氧化氢的灵敏测定,其响应电流与过氧化氢的浓度在2。50×10－6mol.L-1～2.0×10－3mol。L—1范围内呈线性关系,线性相关系数R＝0。9985，检测限5.88×10－8。研究了各种实验条件对复合膜电极性能的影响。该复合膜电极制作简单,稳定性好、使用寿命长，电极使用半个个月后其响应电流仍能保持初始值的90。34％。
关键词：壳聚糖；辣根过氧化物酶；石墨烯；过氧化氢；对苯二酚
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Abstract
Prepared a simple hydrogen peroxide biosensor based on Chitosan/Graphene Inorganic -Organic composite matrix。 To mix chitosan， graphene， horseradish peroxidase evenly， then drip the mixed solution onto Au electrode surface that has been polished smoothly and cleanly, After drying to prepare the composite film electrode。 Using cyclic voltammetry （CV） and chronoamperometry (I—T)，Made hydroquinone as the electron transfer to measure of hydrogen peroxide more sensitively。 The linear range was 2。50 × 10 - 6 to 2×10
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mol。L-1，the linear correlation coefficient R = 0.9985, the detection limit was 5.88×10-8.
we have studied the effects of various experiental conditions on the performance of composite membrane electrode。 The composite film electrode has the advantages of simple manufacture， good stability, long service life,the response current of the sensor decreased 90。34％ after storing 15 days.
Keyword：Chitosan；horseradish peroxidase;graphite；Hydrogen peroxide；hydroquinone
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目 录
学位论文原创性声明 ......................................................................................................................................... III 学位论文版权使用授权书 ................................................................................................................................. III 摘 要 ................................................................................................................................................................. IV Abstract .............................................................................................................................................................. V 目 录 ................................................................................................................................................................. VI 第一章 前 言 ................................................................................................................................................. 0
1。1电化学酶传感器 .................................................................................................................................. 0
1.1.1过氧化物氢生物传感器的概述 ................................................................................................ 0 1。2化学修饰电极的制备、表征及应用 .................................................................................................. 1
1.2.1电极的预处理 ............................................................................................................................ 1 1。2.2 电化学修饰电极的制备方法 ................................................................................................. 1 1.2。3化学修饰电极在分析化学中的应用 ...................................................................................... 3 1。3石墨烯简介 .......................................................................................................................................... 3 1。4石墨烯的结构和性质 .......................................................................................................................... 4
1。4.1 石墨烯的结构 ......................................................................................................................... 4 1.4.2 石墨烯的性质 ........................................................................................................................... 4 1.4.3石墨烯的电化学基础 ................................................................................................................ 5 1。5 壳聚糖简介 ......................................................................................................................................... 6 1.6 课题来源及研究目的和意义 ................................................................................................................ 7 第二章。实验部分 ............................................................................................................................................... 0
2.1 试剂和仪器 ............................................................................................................................................ 0 2.2 电极的制备 ............................................................................................................................................ 0 2.3测量方法 ................................................................................................................................................. 1 第三章 结果讨论 ................................................................................................................................................. 2
3.1 循环伏安行为 ....................................................................................................................................... 2 3。2 响应曲线 ............................................................................................................................................. 2 3。3对苯二酚( HQ )在HRP酶电极上的电化学行为 .............................................................................. 3 3.4 CTS-HRP—Gr/Au电极的电化学特性 ............................................................................................... 4 3。5酶电极制备条件的优化 ...................................................................................................................... 6
3.5.1 酶浓度的优化 ............................................................................................................................. 6 3.5。2滴涂量的优化 ........................................................................................................................... 7 3。6 体系条件的优化 ................................................................................................................................. 8
3。6.1体系pH值的选择 .................................................................................................................... 8 3。6。2电子媒介的量的影响 ............................................................................................................ 9 3.7修饰电极的工作曲线（i-t) .................................................................................................................. 10 3.8 电极重复性和重现性 .......................................................................................................................... 12 3。9稳定性实验 ........................................................................................................................................ 12 第四章 结论与展望 ........................................................................................................................................... 14
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参考文献 ............................................................................................................................................................. 15 致 谢 ................................................................................................................................................................. 19
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第一章 前 言
1。1电化学酶传感器
按测量信号不同，电化学酶传感器又可分为电流型、电位型和电导型。电流型酶传感器的原理是利用固定在电极表面上的酶对酶底物的催化氧化或还原，产生可在电极上还原或氧化的组分，获得电流信号(有时这一过程需要外加电活性媒介）[1］；电位型传感器是基于离子选择性电极原理而发展起来的，固定到电极表面的酶对底物催化，产生离子型物质，能引起指示电极电位改变,电位变化关系遵循Nernst方程［2]；电导型传感器是利用酶催化底物反应,导致反应体系中离子种类及浓度的变化，从而引起溶液导电性的改变，以溶液电导率为响应信号。
酶传感器的研究经历了三个发展阶段，即以酶的天然介体-氧来沟通酶与电极之间的电子通道，直接检测酶反应底物的减少或产物的生成的第一代传感器；基于人工合成的媒介体来代替氧沟通酶的活性中心与电极之间的电子通道,通过检测媒介体的电流变化来反映底物浓度的变化的第二代酶生物传感器和利用酶自身与电极间的直接电子转移来完成信号转换的无媒介体存在的第三代酶生物传感器1。1.1过氧化物氢生物传感器的概述
H2O2的测定主要有容量分析法、光谱法、电化学法等［4-8］，其中电化学方法因具有快速、直接、可在线分析等优点而得到广泛关注，各种H2O2生物传感器的制备也得到广泛报道，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）对H2O2分解具有高的选择性和催化活性，但由于其分子质量大，难于实现酶活性中心与电极表面间的直接电子传递。因此，HRP传感器的性能决定于酶在电极表面的构筑。已报导的HRP固定方法较多,如戊二醛交联法、共价键合法、溶胶一凝法、聚合物包裹法、吸附法、纳米金溶胶、碳纳米管以及5102纳米粒子固定法等。由于强化学键可能导致酶的失活，而溶胶—凝胶的酸碱度不易调至中性,在凝胶过程中可能导致修饰膜的干裂脱落.此外，由于HRP的氧化还原活性中心深埋在酶分子内部,在通常情况下难以与电极之间进行直接电子转移。这些情况都直接影响酶的固定和酶催化活性的长时间保持.
张晓蕾等［9］以纳米金/壳聚糖/碳纳米管修饰HRP构筑了过氧化氢传感器.Zhao Yuandi等[10］将纳米金吸附HRP直接吸附在碳纳米管上，制成碳纳米管修饰电极，并研究HRP在电极上的直接电化学行为。Xiao Yi等[11］将HRP自组装到纳米金/半胱胺修饰的金电极上构
［3］
。
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制了第三代HRP生物传感器.Yu Ruqin等［12］将HRP固定在纳米金修饰的壳聚糖碳糊电极表面构制了HRP生物传感器.Shi Aiwu 等［13]将HRP吸附在纳米金/聚硫堇纳米线修饰的玻碳电极表面制备了新型HRP传感器.
1.2化学修饰电极的制备、表征及应用
化学修饰电极就是用化学或物理的方法将某些特定功能团或化合物修饰在电极表面，从而改变或改善电极原有的性质，实现电极的功能设计[14］.化学修饰电极的制备，其修饰方法是非常关键的,它影响到电极的性能，不仅包括重现性和稳定性，而且影响到它的实际应用。电极表面的修饰方法依其类型、功能和基底材料的性质和要求而不同。目前已经发展了许多不同的方法来制备化学修饰电极,董绍俊等［15]详细介绍了化学修饰电极的制备和类型。
1。2.1电极的预处理
在制备化学修饰电极之前，首先要对基底电极表面进行清洁处理，然后再进行修饰电极的制备。处理的方法包括:
a 物理处理:即是对固体电极首先进行机械研磨及抛光，通常是把基底电极依次在粒度从大到小的抛光剂中进行研磨.每次抛光后先洗去表面污物,再用稀酸、稀碱、乙醇和纯水超声清洗2—3 min,直至清洗干净。如果电极表面存在惰化层和很强的吸附层时,必须用机械或加热的方法处理.加热处理一般在真空中加热到500℃.保持一定时间.
b 化学处理 固体电极经过抛光处理后，接着应进行化学清洗.选择合适的有机溶剂及不同酸度的溶液进行清洗，可消除电极表面吸附性杂质及惰化层。如在清除空气的盐酸溶液中，稍负于SCE电位下处理数秒钟,能清除玻碳电极表面的含氧基团.
c 电化学处理 这是最常用来清洁、活化电极的手段。可直接在试液中进行，选择合适的溶液，可用恒电位、恒电流或循环伏安扫描法极化。根据试验设定合适的处理条件(主要是电位扫描范围、试液组成、pH值等条件)。选择合适的条件，可获得氧化的、还原的或中性的电极表面。
1。2.2 电化学修饰电极的制备方法
化学修饰电极的制备是化学修饰电极得以开展研究的关键性步骤。修饰方法的设计合理性与否、操作步骤及优劣程度对化学修饰电极的活性、稳定性和重现性有直接影响，因此是化学修饰电极研究和应用的基础.
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目前已经发展的制备化学修饰电极的方法主要有滴涂法、共价键合法、电化学法、吸附法和掺杂法等。目前人们研究得比较多的是滴涂法、共价键合法和电化学法这三种方法，而本文中电极的修饰方法就是滴涂法.
1。2.2。1 滴涂法
滴涂法是将溶解在适当溶剂中的聚合物或者纳米材料滴加或涂覆于电极表面,待溶剂蒸发干固后，生成涂膜结合在电极表面从而达到化学修饰的目的.具体方法为:
（A）将电极浸入修饰液中，取出后使附着于电极表面的溶液干固成膜； (B)用微量注射器把一定已知量的修饰液注射到电极表面，然后于固成膜；
（C)电极在修饰液中旋转，使其溶液附着于电极表面,然后干固成膜该方法操作简单且直接。但是,用滴涂法制备的修饰电极会因为溶剂的挥发而导致薄膜的厚度不均匀，并且重现性较差。
1.2。2.2 共价键合法
共价键合法是对电极表面进行预处理,以引入键合基，然后进行表面有机合成,通过化学键 合反应将预定官能团修饰到电极表面.采用这种方法制备的修饰电极具有分子识别功能和选择性响应,并且稳定性很高。
1.2.2.3 电化学法 电化学法包括以下三种：
电化学沉积法是一种将电极置于含有一定修饰材料的电解液中，采用恒电流或恒电位进行沉积而制备出修饰电极的方法。
电化学聚合法则是一种利用电化学氧化还原引发，使电活性的单体就地在电极表面发生聚合，生成聚合物膜而达到修饰目的的方法。这类电活性单体大多含有乙烯基、羟基和氨基的芳香化合物以及杂环、稠环多核碳氢化合物和冠醚类化合物等。这种方法主要被用来制备各种聚合物修饰电极。
电化学氧化法是利用电化学氧化作用使反应物在电极表面生成特定的产物,该产物最终通过吸附、组装或共价键合等作用修饰电极表面，从而制备化学修饰电极的一种方法.用该方法制备修饰电极的报道还不是很多。
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1。2.3化学修饰电极在分析化学中的应用
从本质上看，化学修饰电极用于定量分析是一种把分离、富集和测定三者合而为一的理想体系。董绍俊等总结了化学修饰电极用于定量分析时具有的功能：①被测物能在修饰层中选择性地键合与富集；②催化裸电极上具有缓慢电子转移速率的被测物的氧化还原；③与生物分子特别是生物测定中的酶相结合；④对电活性和表面活性干扰物具有选择性渗透与膜阻效应；⑤非电活性离子被测物的电化学检测；⑥电位响应。基于这些功能，目前化学修饰电极在选择性富集分离、电催化、选择性渗透、传感器等方面以及流动注射、液相色谱检测器、非电活性离子的分析测定等方面有着广泛的应用。
1。3石墨烯简介
2004年，英国曼彻斯特大学(University of Manchester)Andre K。 Geim 等[16]以石墨为原料，通过微机械力剥离法得到一系列叫作二维原子晶体( two-dimensional atomic crystals）的新材料——“石墨烯（graphene )”。与碳纳米管相比，石墨烯有完美的杂化结构，大的共轭体系使其电子传输能力很强，电子穿过石墨烯几乎没有任何阻力，所产生的热量也非常少。另外,石墨烯本身就是一个良好的导热体，可以很快地散发热量。
石墨烯跟钻石一样，都是纯碳，但它比钻石硬很多。石墨烯是由碳原子构成的二维晶体，碳原子排列与石墨的单原子层一样，成蜂窝状(honeycomb)。虽然它很结实，但是柔韧性跟塑料包装一样好，可以随意弯曲、折叠或者像卷轴一样卷起来。
石墨烯结构非常稳定，迄今为止，研究者仍未发现石墨烯中有碳原子缺失的情况。石墨烯中各碳原子之间的连接非常柔韧，当施加外部机械力时，碳原子面就弯曲变形，从而使碳原子不必重新排列来适应外力,也就保持了结构稳定。这种稳定的晶格结构使碳原子具有优秀的导电性。石墨烯中的电子在轨道中移动时，不会因晶格缺陷或引入外来原子而发生散射。由于原子间作用力十分强，在常温下,即使周围碳原子发生挤撞，石墨烯中电子受到的干扰也非常小。
石墨烯最大的特性是其中电子的运动速度达到了光速的1/300，远远超过了电子在一般导体中的运动速度。
“石墨烯”又名“单层石墨片”，是指一层密集的、包裹在蜂巢晶体点阵上的碳原子，碳原子排列成二维结构,与石墨的单原子层类似（图1-3)。Geim等[17］利用纳米尺寸的金制“鹰架”，制造出悬挂于其上的单层石墨烯薄膜，发现悬挂的石墨烯薄膜并非“二维扁平结构”,而是具有“微波状的单层结构”，并将石墨烯单层结构的稳定性归结于其在“纳米尺度上的微观扭曲”。
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图1-3 石墨烯结构示意图
1.4石墨烯的结构和性质
1。4。1 石墨烯的结构
石墨烯(graphene)是碳原子紧密堆积成的单层二维蜂窝状（只包括六角原胞)晶格结构的一种碳质新材料，是构建其他维数碳质材料（如零维富勒烯、一维纳米碳管、三维石墨）的基本单元［18］。
完整的石墨烯具有理想的二维晶体结构,每个C原子通过很强的σ键与其它三个C原子相连接，强的C—C键使石墨烯片层有很强的结构刚性。石墨烯中C原子都贡献的未成键的π电子，与平面成垂直的方向形成π轨道,且π电子可在晶体中自由移动,从而使得石墨烯有良好的导电性。图1-4—1为石墨烯的结构示意图。
1。4。2 石墨烯的性质
主要性质表现在以下几个方面： 1） 载流子迁移和输运特性
石墨烯是零带隙半导体,具有独特的载流子特性。它的电子与蜂窝状晶体结构周期势的相互作用产生了一种准粒子，即零质量的狄拉克-费米子（massless Dirac fermions），这种粒子具有类似于光子的特性。室温下石墨烯具有10倍于商用硅片的高载流子迁移率（~10000cm2V—1s—1)，表现出室温亚微米尺度的弹道传输特性(300K下可达0。3µm)且受温度和掺杂效应的影响很小[16，19］。
2) 量子霍尔效应
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石墨烯特有的能带结构使空穴和电子相互分离，导致不规则量子霍尔效应的产生。通过对石墨烯的电学性能研究人们发现了两种新型的量子霍耳效应.最近，Novoselov等观察到石墨烯具有室温量子霍耳效应，将原来的温度范围扩大了10倍［20］。2009年，美国两个实验小组分别在graphene中观测到了填充数为1/3的分数量子霍尔效应[21,22］。
3） 自旋性质
Tombros等人[23]研究了微米数量级下石墨烯中电子的自旋和拉莫尔旋进,清楚观察到了电子的两级自旋信号，且在4.2K、77K和室温下，自旋信号变化不大。计算得知自旋驰豫长度在1.5微米和2.0微米之间，基本上不依赖于电流密度。这个性质可使石墨烯在高频晶体管方面有其应用。
4） 超导性质
作为sp2杂化材料，石墨烯具有独特的超导性质。Heersche等[24］在石墨烯上连接两个电极，观察到有超电流通过，即使在零电荷密度时，也有超电流。这说明石墨烯确实具有超导性.与碳纳米管和富勒烯相比，超导性能好，超导温度高.
另外，石墨烯的理论比表面积高达2600m2/g,具有突出的导热性能（ 3000W·m—1·K
—1
),优异的力学性能，杨氏模量(～1100 GPa)和断裂强度 (125GPa）[25]。
如前所述，石墨烯（graphene, GE）是碳纳米材料家族的新成员，具有二维层状纳米结
构，室温下相当稳定［26］.由于在GE中碳原子呈sp2杂化，贡献剩余一个p轨道上的电子形成了大π键，π电子可以自由移动，使GE具有优良的导电性。石墨烯对一些酶呈现出优异的电子迁移能力；并且对一些小分子（如H2O2,NADH)，具有良好的催化性能，这使得石墨烯适合做基于酶的生物传感器，即葡萄糖传感器和乙醇生物传感器.在电化学中应用的石墨烯大部分都是由还原石墨烯氧化物得到的，也称为功能化石墨烯片或者化学还原石墨烯氧化物，这种物质通常有较多的结构缺陷和官能团，这在电化学应用上具有优势。
碳是电化学分析和电催化领域应用最广的材料。例如，碳纳米管在生物传感器、生物燃料电池和质子交换膜（PEM)燃料电池方面有着良好的性能。基于石墨烯的电极在电催化活性和宏观尺度的导电性上比碳纳米管更有优势。因此,在电化学领域,石墨烯就有了大展身手的机会。
石墨烯在电化学传感器上的应用有以下优点［27,28］:①体积小，表面积大； ②灵敏度高；③响应时间快；④电子传递快；⑤易于固定蛋白质并保持其活性；⑥减少表面污染的影响。 1。4.3石墨烯的电化学基础
有人通过氧化还原电对的循环伏安法研究了石墨烯的电子迁移行为[29]，比如具有良好氧化还原峰的［Fe（CN)6]3-/4— 和 [Ru（NH3)6］3+/2+。在循环伏安法中所有阴阳两极的峰值
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电流都和扫描速率的平方根呈线性关系，这表明石墨烯电极的氧化还原过程主要是由扩散控制的［30]。在CV(循环伏安法）中，石墨烯中一个电子迁移的氧化还原电对的峰值电位差（ΔEp)是非常低的，很接近于59mV的理想值，比玻碳电极的要小很多[31]；另外，［Fe（CN)6]3-/4-为61.5—73mV（10mV/s）,［Ru(NH3)6］3+/2+为60—65mV（100mV/s)。峰值电位差和电子迁移系数相关，一个较低的峰值电位差表明石墨烯上的单电子电化学反应具有较快的电子迁移速率。
为了研究石墨烯对不同氧化还原系统的电化学响应，Tang等人[32］系统研究了三种有代表性的氧化还原电对：［Ru(NH3)6］3+/2+ ，［Fe(CN）6］3—/4— 和Fe3+/2+。众所周知，[Ru
3+/2+（NH3） 几乎是对大多数电极表面缺陷和杂质不敏感的理想球面氧化还原系统,并且6］
能够在对比几种碳电极材料的电子迁移率时作为基准；［Fe(CN)6]3-/4— 对表面敏感，但是对氧不敏感；Fe3+/2+对表面和氧都敏感[31］.从［Ru（NH3）6］3+/2+ 电对循环伏安法计算得来的石墨烯和玻碳电极的表观电子迁移常数分别是0。18cm/s和0.055cm/s。这表明，石墨烯的独特电子结构，尤其是在一个宽的能量范围的高的电子密度使得石墨烯具有较快的电子迁移速率［31]。[Fe(CN）6］3-/4-电对计算得来的石墨烯和玻碳电极的表观电子迁移常数分别为0.49cm/s和0.029cm/s；在石墨烯电极上的Fe3+/2+的电子迁移速率通常比玻碳电极上的电子迁移速率高几个数量级[30]。这些研究结果都表明了石墨烯的电子结构和表面物化性质都是有利于电子迁移的［30—31]。
在本实验中，石墨烯极大的比表面积和优异光学、电学、热稳定性，为HRP固载
提供了大的比表面积，提高了其催化活性，提高传感器的灵敏度和响应电流，提高了对H2O2检测的响应信号，缩短响应时间,提高检出限。
1.5 壳聚糖简介
壳聚糖（Chitosan ，CHIT) 又称脱乙酰几丁质、聚氨基葡萄糖、可溶性甲壳素,
是一种储量极为丰富的天然碱性高分子多糖,多为虾、蟹甲壳提取物,是由甲壳素脱去75 %以上的N2乙酰基的产物,也是由氨基葡萄糖和N2乙酰基葡萄糖单元组成的共聚物。它易溶于有机弱酸， 形成均匀、透明的黏稠状溶液.其结构式为：
由结构式可知：壳聚糖大分子链上分布大量羟基、氨基，同时骨架链间的氢键形成了壳聚糖大分子的二级结构，壳聚糖结构上的这一优点，使得它对许多离子、有机物、生物
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分子具有离子交换、螯合和吸附等特性,由于它具有优良的生物相容性、优异的成膜性和极强的吸附能力，因而近年来成为固定生物分子的优良材料[33-35］。此在生物和医学领域得到了广泛的应用，越来越受到人们的重视。因而被直接作为富集过程的吸附剂并在分析领域中得到广泛应用［36-37］。在固定生物分子方面,尤其是酶的固定，构造安培型传感器引起了广泛的关注。
1.6 课题来源及研究目的和意义
食品级双氧水在食品工业中可用于软包装纸的消毒、罐头厂的消毒剂、奶和奶制品杀菌、面包发酵、食品纤维的脱色等。但是近期有媒体报道,部分不法商家在一些需要增白的食品，如各种海产干品、冻品、水发食品(牛百叶、海蛰、海米粉、鱼皮、水发鱿鱼等）、水果罐头、各种肉制品（白斩鸡、牛筋、牛肚、鸭、鹅掌、花肠、猪皮和猪蹄筋等）、面制品（饺子皮和馄饨皮）、及干果制品(果仁、果脯等)等的生产过程中，将其违禁浸泡工业用双氧水，以此来提高产品的外观.更有甚者将发霉的水产干品用双氧水来浸泡处理漂白，再重新出售；或为消除病死鸡、鸭或猪肉表面的淤血和霉斑，将这些原料浸泡高浓度双氧水漂白加工，再添加人工色素出售。值得注意的是，过氧化氢可通过与食品中的淀粉形成环氧化物，而环氧化物具有致癌性.但是，工业用双氧水的价格较食品级双氧水便宜,因此常在加工过程中违法使用.工业用双氧水中含有铅、砷、镍等重金属离子等多种有毒有害物质，这些有害物质就会残留到食物中,假如消费者食用了这些用工业双氧水加工处理的食品，可能致畸,甚至基因突变,更加严重危害食用者的健康。因此,对双氧水含量的简便快速检测手段的开发迫在眉睫,双氧水的分析检测研究具有非常重要的实际意义。
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第二章。实验部分
2。1 试剂和仪器
CHI660C电化学工作站（上海辰华仪器公司）上进行,实验中采用三电极体系，其中工作电极为壳聚糖/石墨烯/辣根过氧化物酶修饰的复合金电极;参比电极为饱和甘汞电极；对电极为铂丝电极。所有电化学实验都在环境温度下的4ml磷酸盐缓冲溶液（pH7。0）中进行（室温），所有电位相对于饱和甘汞电极.CV实验在静止的电解质溶液中进行;i-t实验在电磁搅拌的PBS溶液中进行.
CSB6L-180D型超声波清洗器（天津市考徳斯科技技有限公司），ALC-2103型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）,TTL-10B超纯水器（北京同赛联科技有限公司），其他试剂均为分析纯，实验用水均为超纯水。
2.2 电极的制备
将金电极（直径2 mm）在麂皮上用粒径为0.05m -Al2O3粉末和水的混合物抛光，然后依次用无水乙醇、超纯水超声清洗10 min，再用超纯水冲洗，晾干,可得到一个平滑光洁的新鲜电极表面.将已处理好的金电极置于混合液(0。005mol。L-1K3[Fe（CN）6]+0.1 mol。L
-1
KCl）中作循环伏安扫描,扫描范围是-0.2～0。6V.若阴阳极峰对称, 峰电流近似相等（Ipc/Ipa
≈1），两者的电位差一般保持在110mv内，呈现出一对可逆性很好的氧化还原峰，即为达到实验所需要求。电极不用时,4℃冰箱保存.
取100g/L的辣根过氧化物酶（HRP)20L，0.05％的壳聚糖5L，2mg/L刚超声过的石墨烯溶液20L于一次性离心试管中混合均匀．用20ul微量注射器吸取5 µl制膜液涂在预处理过的金电极表面并于4C条件下过夜干燥。所得电极表示为CHIT/HRP/Gr/Au.，最后,将酶电极用pH为 6。9的0.067 mol L—1 的磷酸缓冲溶液中冲洗，以除去未固定在电极表面上的酶。电极不用时，置于冰箱中4C干燥保存。其他的修饰电极分别用相应的符号
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表示，并用来做对比试验。
2。3测量方法
取4ml PBS缓冲溶液（PH=7。0）于烧杯中，连接三电极系统，工作电极为壳聚糖／辣根过氧化物酶/石墨烯电极(CHIT/HRP/Gr/Au),将电化学工作站调到循环伏安法（CV），从0.6到-0.6开始扫描，逐渐加入H2O2，分别测量电极的响应情况.
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第三章 结果讨论
3.1 循环伏安行为
图3-1分别为裸电极、CHIT/HRP/Au电极、CHIT/HRP-Gr/Au电极在含有对苯二酚2.5mmol。L—1和H2O22。5mmol。L—1的PBS中的循环伏安图.
从图中可以看出相对于裸金电极，辣根过氧化物酶(HRP）确实催化了反应，得到了一对对称的氧化还原峰，而石墨烯增大了电极的比表面积。
6050403020100-10-20-30-40-50-60-70I/uAacE/v-80-0.6-0.5-0.4-0.3-0.2-0.10.00.10.20.30.40.50.6
图3—1 不同修饰电极的循环伏安行为:a：裸电极；b：CHIT/HRP/Au电极；c：CHIT/HRP—
Gr/Au电极
3。2 响应曲线
图3—2（A)和图3—2(B)分别为修饰电极的响应曲线和裸电极的响应曲线，图3-5—1中峰电流明显随着过氧化氢浓度的增大而增大（从a到f的浓度依次为0，2.5，5，7.5，10mmol。L-1），图3—5-2中裸电极虽然对过氧化氢也有响应，但是不随过氧化
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氢浓度的改变而改变(从a到c依次为0，2.5,5，7。5mmol.L—1），由此修饰电极可以用来测量过氧化氢的浓度.
图3-2（A）修饰电极的响 图3—2（B）裸电极的响应曲线（a 应曲线 （a到f的浓度依次为 到e的浓度依次为：0,2。5，5， ：0，2.5,5，7。5,10mmol。L-1 ) 7.5mmol.L-1）
100806040200a-20-40-60-80f-100-120-0.6-0.5-0.4-0.3-0.2-0.10.00.10.20.30.40.50.6E/v40302010I/uA I/uA 0-10-20-30ea-40-0.6-0.5-0.4-0.3-0.2-0.10.00.10.20.30.40.50.6E/V
3.3
对苯二酚( HQ )在HRP酶电极上的电化学行为
为了克服过氧化物酶异相电子转移速度较慢的问题，具有较高异相电子转移速率的小分子电活性物质质常用作过氧化物酶电极的电子媒介体，本研究选用对苯二酚作为所构造酶传感器的电子酶介体。图2-1(a)所示为CTS—HRP-Gr/Au电极在PBS=7空白时对苯二酚的循环伏安图，可以看到修饰电极在PBS=7空白时并无响应。从图2-3（b)和2-3(c)比较了CTS-HRP—Gr/Au电极在含2。5mmol L-1对苯二酚的4 ml PBS溶液中加H2O2前后循环伏安图的变化，图2—1(b）中一对准可逆的氧化还原峰代表对苯二酚在电极上的氧化还原过程。但当加入2。5mmol /L H2O2溶液时(图4(c）），对苯二酚在电极上阴极峰电流显著增加，阳极峰电流相应减少,这些现象说明该HRP修饰电极在电子媒介体对苯二酚存在下对H2O2的还原具有优异的电催化活性HRP的催化机理［39-40]如下:
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HRP(Fe3+) + H2O2 Compound（I) +H2O
Compound(I） + QH2 Compound（II) + Q Compound（II） + QH2 HRP（Fe3+） + Q + H2O Q + 2e QH2
Fe3+是HRP的辅助因子,Compound I(氧化态 + 5)、 Compound II（氧化态 +4) 代表反应中介物，QH2、Q 分别代表对苯二酚和其氧化态（苯醌）。Compound I被还原成Compound II，然后Compound II又被QH2还原为HRP(Fe3+)。接着苯醌从电极上得到二个电子被还原成对苯二酚。可以看出还原电流的大小与H2O2的浓度成正比，同时也与HRP酶的活性有关。
20100I/uAa-10c-20-0.6-0.5-0.4-0.3-0.2-0.10.00.10.20.30.40.50.6E/v
图3-2 CTS—HRP-Gr/Au电极在不同底液中的循环伏安图。a:PBS空白;b:2.5mmol.L-1对苯
二酚；c：2.5mmol.L-1H2O2+2。5mmol。L-1对苯二酚
3.4
CTS—HRP—Gr/Au电极的电化学特性
图3-3-5(A）是CTS-HRP—Gr/Au电极在0.1mol L- 1PBS（ pH= 7）中不同扫描速下的循环伏安曲线.从a到c的扫速分别为10，30，50，70,90，110,130，
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150,170,190,210mv/s从图中可以看出， 电极在PBS缓冲液中存在一对准可逆的氧化还原峰，且相应的氧化峰电流( Ipa ）和还原峰电流( Ipc )均随扫速的增大而增大；3—3—5（B)为峰电流与V1/2的关系曲线且峰电流与扫速的关系式为：
ipa（A）=1。2306E-5+4。9488E—5V1/2(v，R=0。9603); Ipc （A）=—7.3102E-6-1。1509E-4V1/2(v,R=0。9985）， 说明整个电极过程受扩撒过程控制.
扫速曲线706050403020100-10-20-30-40-50-60-70I/uAac-0.6-0.5-0.4-0.3-0.2-0.10.00.10.20.30.40.50.6E/V
图3—3—5（A） :扫速曲线
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403020100-10-20-30-40-50-600.050.100.15峰电流与扫速的关系0.200.250.300.350.400.450.50
v1/23—3-5(B)：峰电流与V1/2的关系
3.5酶电极制备条件的优化
条件的优化中溶液的浓度都以对苯二酚2.5mmol/L，过氧化氢2.5mmol/L为准
3。5。1 酶浓度的优化
生物传感器的响应与负载的酶量有直接关系，为此考察了固定不同量HRP的生物传感器的响应特性.图3—3-2(A）是在-73 mV电位下，负载了不同浓度HRP的电极校正曲线。HRP为0.1 mg ml—1时,电极的灵敏度和线性范围达到最佳值。所以实验中采用此浓度的酶溶液制备电极.a为0.1mg/ml,b为1mg/ml,c为0。5mg/ml。
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120100a80bcCurrent ( A)6040200-200123C H2O2 ( mmol L-1)456 图3-3-2（A)：不同浓度HRP的电极校正曲线.a为0。1mg/ml，b为1mg/ml,c为0.5mg/ml
3。5。2滴涂量的优化
将酶的浓度定为0.1mg/ml，考察滴涂量对电极的影响,找出最佳滴涂量，由图3-3可以看出，当滴涂量为5ul时，还原电流达到最大,再增加滴涂量,还原电流基本保持不变.是因为电极的表面积是固定的，当达到最大后再增加滴涂量，电极的表面的溶液不会增加。因此在其他的实验中，滴涂量都选择的为5ul。
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474645I/uA434241123456
图3—3-4:滴涂量的优化折线图：（从左到右依次为滴涂量1ul,2ul，3ul，4ul，5ul)
滴涂量/ul3。6 体系条件的优化
3。6。1体系pH值的选择
测量体系的p H值影响电极的性能，主要体现：（1)pH值影响酶的活性;(2)pH值影响酶与底物的结合,因此影响催化功能。在ｐH为4.0～10。0范围内考察了缓冲液的pH值对传感器的响应的影响见图3—1。从图3—1可能看出，当体系pH值为7.0时，电极的响应最大,因此本文其他实验选择在PBS7。0的底液中进行。
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656055-I/uA504540354567pH8910
图3-6—1 体系PH值对电极性能的影响 3.6.2电子媒介的量的影响
图3—3-3为酶电极在不同浓度的对苯二酚存在时的电流响应。从图3—3-3可看出,电流响应随着对苯二酚浓度的增加而增大。这是典型的基于电子媒介的传感器［41]。电子媒介浓度较低时,响应的线性范围会受到酶—媒介动力机制的限制。因此在本实验中我们选择使用2。5mmol L-1 的对苯二酚。
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10080 Current ( A)d6040200bac0123C H2O2 ( mmol L-1) 图3-6-2：修饰电极在不同浓度电子媒介的存在下的电极矫正曲线，a：0.5mmol L—1;b:1mmol
L—1c：2mmol L—1；d：2.5mmol L-1.
；
3.7修饰电极的工作曲线(i-t）
图2-7是在优化的实验条件下往pH=7。0的PBS溶液底液中连续加入等量H2O2
时生物传感器的计时电流曲线。生物传感器对H2O2的浓度变化有快速灵敏的响应,说明酶电极有优良的电催化行为，最大响应时间小于5s。响应电流值随H2O2浓度升高而增大.测定H2O2溶液的浓度线性范围是2.50×10-6mol。L—1～2.0×10－３mol。L-1，回归方程为：I（A)=2.785×10-7+0.0194μ（mol。L—1)，R=0.9978，在3σ处得检测下限为5。88×10—8。
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0-5-10-15I/uA-20-25-30-35-40-45012345678时间/10^2s910111213
图3—7（A）i—t曲线
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图3-3-7：修饰电极的（i—t）曲线
3.8 电极重复性和重现性
表1考察了CTS-HRP—Gr/Au电极对2。5mmol L—1过氧化氢溶液的响应的重现性。在六次的测定中，相对标准偏差为2。87％,表明该电极的重现性良好。表2考察了四支独立制作的CTS-HRP-Gr/Au电极测定2。5mmol L—1过氧化氢溶液的重复性,结果的相对标准偏差为4。99%（n=3)。
表1 电极重现性实验
测量次数 峰电流I/A 相对标准差
表2 电极的重现性实验 电极编号 测量次数 Au1 Au2 Au4 Au5 RSD=4。99%
1 -1。946×10—052 -2.008×10—053 4 5 6 —2。033E-05×10—-05-05-05×10×10×10 —2.069 -2.086 —2。106 05RSD=2.87% 1 2 3 平均值 —3.06×10—05 -3。67×10—05 -3.68×10 —3.64×10—05 —3。43×10—05 —3.26×10 -05-05—3。47333×10—05 -3。48×10-05 —3。25×10-05 —3.07×10—05—3。58×10—05 -3.35×10—05 —3.20×10 -05-3.56733×10-05 -3.34367×10—05 -3。17733×10 -05 3。9稳定性实验
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CTS-HRP-Gr/Au电极不用时放置在4℃的冰箱中，半个月内，通过测量生物传
感器对2。5mmolL-1过氧化氢的响应来考察其稳定性,40天后电极响应仍能保持其最初的90.34％ ％。此结果说明，Gr/CHIT膜能够很好的保持酶的活性。这是由于Gr/CHIT膜具有好的生物相容性及在水溶液中溶胀性较小。
3.10 回收率
以0。1 mol L-1 PBS( pH =7)为测试底液, 将标准H2O2 溶液配制成不同浓度的待测品, 将酶电极置于待测样品溶液中各测定5 次, 测定其电流响应变化值， 结果列于表3。该酶电极的回收率为90。1% ~ 113.06% 。
表3.电极测回收率
加入量 1.5010—6 2。5010—6 5.0010-5 1.0010—4 1.5010—4 2.0010—4
检出量 1.69610—6 2。63110—6 4。60210—5 1.03110—4 1。35210—4 1.81910—4
回收率 （%） 113.06 105.24 92.04 103.10 90.13 90。93
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第四章 结论与展望
本论文研制出一种基于石墨烯/壳聚糖有机-无机复合膜作为固定基质的过氧化氢生物传感器。该复合膜结合了无机材料石墨烯和有机材料壳聚糖的优点。石墨烯有效地增加了电极的面积,使辣根过氧化物酶HRP高效地固定在电极表面。将传感器用于检测H2O2，结果令人满意。该传感器具有灵敏度高、响应快、重复性好、制作简单等优点。实验结果表明石墨烯/CHIT膜是一种优良的生物分子
固定化基质，可用于各种生物传感器的制备。
化学修饰电极的制备是开展电化学研究的一个重要方面.修饰方法的设计,
操作步骤的合理性及优劣程度，对化学修饰电极的活性、重现性和稳定性有直接影响。电催化是化学修饰电极的一个重要的应用，化学修饰电极电催化的实质就是通过改变电极表面修饰物来大范围地改变反应的电位和反应速率，使电极具有传递电子的功能外，还能对电化学反应进行某种促进与选择。文献已经报道了很多种修饰电极的方法，目的都是要赋予普通的电极表面更优越的性质，并增加电极表面的有效工作面积。HRP 的固定化和共固定化的研究起始至今只有短短20多年， 但却取得了突飞猛进的发展, 尤其是在共固定化领域，共固定体系的种类、共固定化的方法、材料和用途都在研究者们的努力下不断地取得突破和创新。尽管目前的研究主要还停留在试验阶段， 研究重点也比较偏向于传感器领域，但固定化始终是HRP得到高效而稳定应用的最佳途径。今后, 能否找到更为廉价而高效的固定化材料, 探索出提高共固定稳定性的方法, 并且在新的领域探索出共固定化HRP的用途, 将成为HRP 能否应用于实际工业化生产中的重要决定因素
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参考文献
［1] Cass A E G, Davis G， Francis G D， et al。 Ferrocene—mediated enzyme
electrode for amperometric determination of glucose。 Analytical Chemistry, 1984， 56 (4）： 667-671
［2］ Guibault G G, Montalvo J G。 An enzyme electrode for the substrate urea。
Journal of American Chemistry Society， 1970, 92 （8）： 2533-2538 ［3] 池其金, 董绍俊. 酶直接电化学与第三代生物传感器. 分析化学， 1994, 22
（10）： 1065—1072
[4］ RENCB, SONG YH, LIZ， ZHUGY. Hydrogen peroxide sensor based on
horseradish pe rox idase immob ilized on a silver nanoparticles/cysteamine/gold electrode［J].Anal B ioana l Chem, 2005， 381( 6）: 1179— 1185.
［5］ 许淑霞,吴金生,张勇，漆红兰，张成孝.,纳米金固定辣根过氧化物酶的碳纳
米管修饰第3代过氧化氢传感器的研究[J]。 分析测试学报， 2008， 27（ 10）： 1099- 1102.
［6张凌燕， 袁若， 柴雅琴， 曹淑瑞, 黎雪莲, 王娜。 基于辣根过氧化物酶/
纳米金/辣根过氧化物酶/多壁纳米碳管修饰的过氧化氢生物传感器的研究[ J] . 化学学报， 2006， 64（ 16): 1711— 1715.
[7唐明宇, 袁若， 柴雅琴, 张凌燕， 高凤仙. 基于自组装L-半胱氨酸与纳米金
的H2O2 生物传感器[ J]. 分析试验室， 2007， 26( 3）： 18- 20. [8]林丽, 仇佩虹, 杨丽珠, 曹旭妮, 金利通. 纳米银粒子修饰电极法测定血红蛋
白［J]分析化学, 2006， 34（ 1) 31- 34.
[9] 张晓蕾， 吴朝阳， 许银玉, 等. 基于碳纳米管/ 壳聚糖/ 纳米金活性界面辣
根过氧化物酶传感器研制［J］. 化学传感器, 2006, 26(3): 12-17.
[10］ ZHAO Yuandi, ZHANG Weide， CHEN Hong， et al. Direct electrochemistry
of horseradish peroxidase at carbon nanotube powder microelectrode[J]。 Sensors and Actuators B： Chemical， 2002， 87: 168-172.
[11] XIAO Yi, JU Huangxian， CHEN Hongyuan. Direct electrochem istry of
horseradish peroxidase immobilized on a colloid/cysteamine modified gold electrode［J]. Analytical Biochemistry, 2000, 278: 222—281.
[12］ YU Ruqin, LEI Cunxi， HU Shunqin, et al。 Immobilization of horseradish
peroxidase to a nano-Au monolayer modified chitosan—entrapped carbon paste
15
武汉工程大学本科毕业(设计)论文
electrode for the detection of hydrogen peroxide[J］. Talanta，2003， 59： 981-988.
[13］ SHI Aiwu, QU Fengli, YANG Minghui， et al。 Amperometric H2O2 biosensor
based on poly-thionine nanowire/HRP/nano—Au-modified glassy carbon electrode［J]。 Sensors and Actuators B: Chemical， 2008,129: 779-783 ［14］ D Pletcher，V Solis。A further investigation of the catalysis by lead ad-atoms
of formic acid oxidation at a platinum anode[J].Journal of Electroanalytical Chemistry,1982,131：309 -320.
[15] 董绍俊，车广礼，谢远武．化学修饰电极[M]北京：科学出版社，1995
[16］ Novoselov K S，Geim A K,Firsov A A。 Electric field effect in atomically thin
carbon films [J］. Science， 2004， 306:666 -669。
[17］ Meyer J C, Geim A K， Novoselov K S, et al。 The structure of suspended
graphene sheets ［J］。 Nature, 2007， 446:60—63.
[18] Geim A K，Novoselov K S. The rise of graphene [ J ］. Nature Materials, 2007,
6： 183—191.
[19] Williams J R，Dicarlo L C，Marcus C M. Quantum Hall effect in a gate—
controlled p—n junction of grapheme ［J］. Science， 2007， 317:638-641。 [20］ Novoselov K S，Jiang Z，Zhang Y，et al. Room—temperature quantum hall
effect in graphene [J]. Science， 2007， 315：1379-1379。
[21］ Du X， Skachko I， Duerr F, et al. Fractional quantum Hall effect and insulating
phase of Dirac electrons in grapheme [J]。 Nature， 2009, 462:192-195. [22］ Bolotin K I， Ghahari F， Shuiman M D， et al。 Observation of the fractional
quantum Hall effect in grapheme [J］。 Nature, 2009， 462： 196—199。 ［23] Tombros N， Jozsa C, Popinciuc M, et al。 Electronic spin transport and spin
precession in single graphene layers at room temperature [J]. Nature， 2007, 448: 571-574.
［22］J Sagiv。Organized monolayers by adsorption.Formation and structure of
oleophobic mixed monolayers on solid surfaces［J］。Journal of the American Chemical Society,1980,102(1）：922 – 988.
[23］ Berger C, Song Z M ， Li T B,et al。 Ultrathin epitaxial graphite: 2D electron
gas properties and a route toward graphene—based nanoelectronics [J］。 Journal Physical Chemistry B， 2010, 108:19912—19916。
［24］ Heersche H B， Jarilloherrero P, Oostinga J B, et al。 Bipolar supercurrent in
16
武汉工程大学本科毕业(设计)论文
graphene ［J］。 Nature， 2009, 446: 56-59.
[25］ Park S, Ruoff R S。 Chemical methods for the production of graphenes [J］.
Nature Nanotechnology, 2009， 4： 217-224.
［26］ Roddaro S，Pingue P，Piazza V，et al。 The optical visibility of
graphene—interference colors of ultrathin graphite on SiO2 ［J]. Nano Letters， 2011,7（9): 2707-2710.
［27] 张文毓，全识俊. 石墨烯应用研究进展[J].传感器世界,2011，05. ［28］ 赵承强。 石墨烯的应用研究及进展[J]。广东化工, 2011,12：61—62。 ［29］ Tang L H， Wang Y， Li Y M， et al。 Preparation， structure and
electrochemical properties of graphene modified electrode [J]. Advanced Functional Materials, 2010, 19, 2782—2789.
［30］ Mccreey R L。 A Advanced carbon electrode materials for molecular
electrochemistry [J］。 Chemical Reviews, 2008， 108， 2646–2687。 ［31］ Zhou M， Zhai Y M, Dong S J。 Electrochemical sensing and biosensing
platform based on chemically reduced graphene oxide ［J］。 Analytical Chemistry, 20011， 81, 5603-5103。
［32] 朱宏伟，徐志平，谢丹.石墨烯—结构、制备方法与性能表征［M]。北京：清华大学出版社，2011：1-48。
[33］ 陈刚, 张剑霞， 陆巍， 等微型一氧化氮电流传感器的研制和应用［J］ 。上海医科大学学报, 1 9 9 8 , 25 :4 5 2 ~ 4 8 8
.[34 ］ 李佳， 徐金瑞, 孙向英.壳聚糖共价键合化学修饰电极测定亚硝酸根［J] 。分析化学,2002 , 3 0： 206 ~ 20 9。
［35 ］ 邻建敏, 陈正贤， 阮东梁。以硅胶为载体的交联壳聚糖作为亲和层析填料基质的研究［J］.分析化学,2 002 ， 3 0 :1 063 一106 6
[36］ GUIBAL E , SWEENEY V N , VINCENT T ， et al。React Funct Polym[J ] ,
2002 ，50 （2） :1492163.
[37] BABA Y， NOMA H ， NA KA YAMA R , et al. AnalSci[J ］ ， 2002 ,18 (3） ：3592361。.
[38] 刘慧宏， 陈显堂， 李俊等。 辣根过氧化物酶在表面活性剂膜中的直接电
化学。分析化学研究报告, 2001， 29 （5）： 511—515 ［39] 袁耀锋， 叶素明， 张蕴文等. 具有生物（理）活性的二茂铁衍生物。化
学通报， 1995，58 （5): 24-31
[40］ Lei C X, Hu Sh Q, Shen G L， et al。 Immobilization of horseradish peroxidase
17
武汉工程大学本科毕业(设计)论文
to a nano—Au monolayer modified chitosan-entrapped carbon paste electrode for the detection of hydrogen peroxide。 Talanta， 2003， 59 （5): 981-988 [41] Oungpipat W， Alexander P W， Southwell-Keely P. A reagentless amperometric
biosensor for hydrogen peroxide determination based on asparagus and ferrocene mediation。 Analytical Chimica Acta， 1995, 309（1—3）: 35—45
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致 谢
本论文是在王志杰老师和李贝贝师姐悉心指导和严格要求下完成的.在论文的选题、实验方案的设计及论文撰写的全过程中，都凝结了她们的心血。他们诲人不倦的敬业精神，严谨求实、锐意创新的学术作风，热忱的鼓励和无微不至的关怀，引导着我不断地克服困难，超越自我。王志杰老师高尚的人格、渊博的学识更给我以深深的震撼。在武汉工程大学学习的四年是我人生最宝贵的经历，能成为王老师学生是我一生的荣幸和财富，在此学到的知识和为人之道将使我终生受益。在此向王志杰老师致以最真诚的谢意！
本论文的研究工作还得到了万其进教授、邱志鹏、汪召豪、罗茜、等师兄和师姐及化工院所有老师的悉心指导和大力支持;感谢万其进教授在工作上提出的宝贵意见；同时还要感谢实验室的其他师兄、师姐对我实验热心的帮助和支持，并为我们的友谊喝彩。
感谢室友对我的帮助和支持，不是她们无私的帮助,我也不可能这么顺利的完成我的本科论文,四年来朝夕相伴的日子，她们早已成了我最亲的人，成为了我生活中的一部分。衷心感谢所有人对我的帮助和鼓励！
最后，感谢家人对我时刻的关心和理解以及对我生活中的引导！
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