免疫共沉淀原理及实验方法

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免疫共沉淀原理及实验方法

2007-03-22 16:07:46

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免疫共沉淀 一 原理：

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A\"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。

每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。欲速则不达，确定好比例很必要。(待续) 二 准备： 器械

#微量高速冷冻离心机 #移液枪 #旋转盘 #电泳设备

#vortex震荡器 #液氮及组织粉碎器

#eppentube 试剂

#细胞或组织 #蛋白定量kit #SDS电泳试剂

#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清) #PBS #NaN3

#proteinA sapharose 试剂配制

抗原蛋白溶解缓冲液

1.RIPA缓冲液 (最终浓度)

1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM)

0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM) 20%TritonX-100 25ml (1%) 10% DOC 50ml (1%) 10%SDS 5ml ( o.1%) TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 395ml toal 500ml

另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，浓度100mM，-20度遮光保存。注意不易溶于水)

2.NP40 lysis 缓冲液

1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM)

0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM) 20%NP40 25ml (1%) TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 450ml toal 500ml

使用前加1mM的PMSF 注意点：

*Tris缓冲剂PH随温度变化，高浓度盐酸滴定时发热，冷却后PH增高。 *反复使用PMSF要注意保管方法。

*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温和，，DOC1 调制protein A sapharose

protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS

离心2000转2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，离心后去上清，重复2次，最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存

用单抗做一抗时，把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每

50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,混匀后，再离心1-2s

去上清后，加PBS，vortex混合，离心去上清，重复二次

加含0.02%NaN3的PBS到原来体积，冷存。避免长期保存。

2．抗原的检出

以下操作全在冰面或4度进行

去除细胞培养液，用冷PBS洗一次。加RIPA，溶解后，转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量：6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎，在缓冲剂中捣匀，蛋白定量。

30m，15000rpm离心，上清转移到新tube 。不用移液枪，直接从tube倒进另一个tube

往上清加抗体，1ml加2-5ul抗体，冷室内旋转混匀1h

加protein A sapharose50ul，再混匀1h

5000rpm离心1s,使sapharose沉淀，去上清。往sapharose加RIPA，vortex 混匀，离心，去上清。重复4次洗净。

加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸，泳动后，固定/干燥胶，现像。

3.注意点

A：不熟练使用移液枪，会混入沉淀的不溶性蛋白，使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速离心机。

B：对电泳的非特异条带，最后可依次用含300mM，1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完)

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免疫共沉淀原理及实验方法

[SPAN class=java id=text9766]免疫共沉淀[BR]一 原理：[BR]IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合

以及细菌蛋白质的“prorein A\"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。[BR][BR]实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。[BR][BR]其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。[BR][BR]再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。[BR][BR]每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。欲速则不达，确定好比例很必要。(待续)[BR]二 准备：[BR]器械[BR]#微量高速冷冻离心机[BR]#移液枪[BR]#旋转盘[BR]#电泳设备[BR]#vortex震荡器[BR]#液氮及组织粉碎器[BR]#eppentube[BR]试剂[BR]#细胞或组织[BR]#蛋白定量kit[BR]#SDS电泳试剂[BR]#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)[BR]#PBS[BR]#NaN3[BR]#proteinA sapharose[BR]试剂配制[BR]抗原蛋白溶解缓冲液[BR]1.RIPA缓冲液 (最终浓度)[BR]1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)[BR]5MNacl 15ml (150mM)[BR]0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)[BR]20%TritonX-100 25ml (1%)[BR]10% DOC 50ml (1%)[BR]10%SDS 5ml ( o.1%)[BR]TLCK 18.5mg (0.1mM)[BR]TPCK 35mg (0.2mM)[BR]DDW 395ml[BR]toal 500ml[BR]另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，浓度100mM，-20度遮光保存。注意不易溶于水)[BR]2.NP40 lysis 缓冲液[BR]1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)[BR]5MNacl 15ml (150mM)[BR]0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)[BR]20%NP40 25ml (1%)[BR]TLCK 18.5mg (0.1mM)[BR]TPCK 35mg (0.2mM)[BR]DDW 450ml[BR]toal 500ml[BR]使用前加1mM的PMSF[BR]注意点：[BR]*Tris缓冲剂PH随温度变化，高浓度盐酸滴定时发热，冷却后PH增高。[BR]*反复使用PMSF要注意保管方法。[BR]*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温和，，DOC＆lt;SDS是离子性的强活性剂。注意忘记加TritonX-100，只加DOC，SDS，可能使抗体完全失去活性。1的蛋白变性效果强，可能损害抗原/抗体结合，2的作用温和，却可能造成抗原溶解不全。[BR]*两方都有EDTA，对抗原而言，二价离子Mg,Ca等是必要的。根据自己需要调节。EDTA用NaOH滴定。[BR]Protocol[BR][BR]1 调制protein A sapharose[BR][BR]protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS[BR][BR]离心2000转2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，离心后去上清，重复2次，最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存[BR][BR]用单抗做一抗时，把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,混匀后，再离心1-2s[BR][BR]去上清后，加PBS，vortex混合，离心去上清，重复二次[BR][BR]加含0.02%NaN3的PBS到原来体积，冷存。避免长期保存。[BR][BR]2．抗原的检出[BR]以下操作全在冰面或4度进行[BR][BR]去除细胞培养液，用冷PBS洗一次。加RIPA，溶解后，转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量：6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎，在缓冲剂中捣匀，蛋白定量。[BR][BR]30m，15000rpm离心，上清转移到新tube 。不用移液枪，直接从tube倒进另一个tube[BR][BR]往上清加抗体，1ml加2-5ul抗体，冷室内旋转混匀1h[BR][BR]加protein A sapharose50ul，再混匀1h[BR][BR]5000rpm离心1s,使sapharose沉淀，去上清。往sapharose加RIPA，vortex 混匀，离心，去上清。重复4次洗净。[BR][BR]加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸，泳动后，固定/干燥胶，现像。[BR][BR]3.注意点[BR]A：不熟练使用移液枪，会混入沉淀的不溶性蛋白，使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速离心机。[BR]B：对电泳的非特异条带，最后可依次用含300mM，1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完) [/SPAN][BR]

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4. 免疫共沉淀技术路线(CoIP) 2007-05-07 09:14

准备工作：

预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶) 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）

4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景

7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl） 10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl“过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG） 13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）

15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制： 基础成分：

Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性） NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）

NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）

去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存） 注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存） EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH 7.4） 亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存） 抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存） 胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）

RIPA磷酸（酯）酶抑制剂

激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protoco）

NaF（200mM的储存液，室温保存）

注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制：

配制100ml的modified RIPA buffe：

1. 称取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4 2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存

5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 µl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 µl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。 各种成分在工作液中的终浓度： • Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 • NP-40: 1%

• 去氧胆酸钠：0.25% • NaCl: 150 mM • EDTA: 1 mM • PMSF: 1 mM

• 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 µg/ml • Na3VO4: 1 mM • NaF: 1 mM

通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1．用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3．收集上清（约30 ml）并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h。 4．加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，4℃摇动免疫沉淀物30 min。

5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次。

6．吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min。

7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8．通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min。

10． 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。

11． 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。