利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究

维普资讯 http://www.cqvip.com 第３９卷第３期　东北农业大学学报　３９（３）：６４－６９　２００８年３月　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｍａｒ．２０ｏ８　文章编号１００５—９３６９（２００８）０３—０ｏ６４—０６　利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白　转基因猪胚胎的研究　宋　军　，王振坤　，孔庆然　，赵祥杰　，刘丽清　，田江天　，　郑　重　，孙　爽　，尹　智　，刘忠华　（１．东北农业大学生命科学学院，哈尔滨　１５００３０；２．东北农业大学动物科学学院，哈尔滨　１５００３０）　摘要：试验对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选，以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细　胞作为体细胞核移植的核供体，以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎，并对重构　胚在体外发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究。结果显示，采用４．０　ｇ・ｍＬ　脂质体转染试剂，　１．６　ｇ・ｍＬ一　质粒ＤＮＡ，转染６　ｈ可以获得最佳转染效果，转染效率达４．４８％；ＧＦＰ转基因体细胞重构胚体外囊胚　发育率为１０％，ＧＦＰ阳性胚胎率为４８％。结果表明，脂质体转染试剂－－ｙｅａ高效转染猪胎儿成纤维细胞，获得的阳　性细胞具有支持猪全程发育的潜能。　关键词：转基因；绿色荧光蛋白；核移植；脂质体；猪　中图分类号：Ｑ７８；Ｑ７５３；￥８２８　文献标识码：Ａ　随着体细胞核移植在多种哺乳动物上获得成　磷酸钙法费用低，但是转染效率也相对较低。电穿　功，以体细胞核移植技术路线生产转基因家畜已　孔法需要昂贵的仪器设备。而脂质体转染试剂对哺　经成为目前最高效的方法。国外通过体细胞核移　乳动物体细胞的转染效果良好，并且有商业化产品　植技术路线已经成功获得多种基因的转基因动物，　可供选用，因此是目前应用比较广泛的转染方法。　如牛【ｌ－２Ｊ、绵羊【３　和猪［５４１。国内通过该技术路线获　不同公司生产的脂质体转染试剂以及被转染细胞的　得了转基因山羊１９１和转基因牛【】Ｏｌ。但由于猪的特殊　种类和细胞生长状态都对转染效率具有重要影响。　生殖特点导致利用细胞核移植技术生产转基因猪　针对具体的体细胞系和特定转染试剂应该建立相对　的发展比较滞后。本实验室在克隆猪的生产上进　稳定、高效的转染技术程序，这对于转基因体细胞　行了初步尝试，并于２００６年１０月和１２月分别获　克隆动物研究是非常重要的技术基础。　得国内首例成体体细胞克隆东北民猪和首例绿色　本试验以绿色荧光蛋白基因为目标基因，研究　荧光蛋白转基因克隆猪。　了脂质体转染试剂的浓度梯度、质粒ＤＮＡ的浓度　绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）是一种水母蛋白，由于该　梯度和转染时间对猪胎儿成纤维细胞（Ｐｉｇ　ｆｅｔａｌ　蛋白可以在特定波长紫外光的激发下发出绿色荧　ｉｆｂｒｏｂｌａｅｔ，ＰＦＦ）转染效率的影响，并对转基因阳性　光，因此可以作为标记蛋白。以绿色荧光蛋白为　体细胞核移植胚胎的体外发育情况以及绿色荧光蛋　标记基因进行转基因动物研究可以使基因的检测　白表达情况做了研究。　更为简单，因此该基因成为转基因动物相关研究　领域广泛应用的标记基因。　１　材料与方法　体细胞转染的方法有很多种，目前应用比较　１．１材料　广泛的主要有磷酸钙法、电穿孔法和脂质体法。　ｐＥＧＦＰ—Ｃ１质粒由本校细胞生物学实验室李树　收稿日期：２００７—０６—０５　峰博士馈赠，质粒提取试剂盒和脂质体购自北京天　基金项目：东北农业大学“２１　１人才专项”基金　根生化科技有限公司，其他试剂均购自Ｓｉｇｍａ公司。　作者简介：宋军（１９８１一），男，黑龙江省人，硕士研究生，研究　方向为动物胚胎工程。Ｅ－ｍａｉｌ：Ｊｓｏｎｇ５１９＠１６３．ｅｏｍ　１．２体细胞采集和培养　通讯作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕＯ８６＠ｙａｈｏｏ．ｅｏｍ　通过无菌操作获得妊娠３５　ｄ的胎儿，采用常　维普资讯 http://www.cqvip.com

第３期　宋军等：利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究　・６５・　规０．２５％胰蛋白酶消化法进行组织细胞的消化分离　统计卵裂胚胎数（含两个及两个以上卵裂球的胚胎）　和囊胚数目，荧光镜下计数具有绿色荧光的囊胚数。　１．７数据处理　培养和传代。　１－３体细胞转染方法　将原代冻存细胞复苏后接种到２４孔细胞培养　板，生长至８０％汇合期时，将培养液更换为无血　清的ＤＭＥＭ培养基，根据试验设计分别加入不同　量的脂质体和质粒ＤＮＡ，转染后将转染试剂更换　为ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ，培养２４　ｈ后加入５００　Ｉｘｇ・ｍＬ。　所得实验数据采用ＳＡＳ进行统计学处理。　２结果与分析　２．１不同ＤＮＡ浓度对转染效率的影响　分别取重组质粒０．８、１．２、１．６、２．０、２．４　ｇ・ｍＬ－‘　Ｇ４１８筛选培养液，在筛选培养到第７～８　ｄ时降低　Ｇ４１８的浓度至２００　Ｉｘｇ・ｍＬ～，阳性细胞经扩增培　养后常规冷冻保存。２４　ｈ后在荧光显微镜下计数　阳性转染细胞和总细胞，每孔随机选取５个视野，　每组试验条件重复３～５次。阳性细胞占总细胞的　百分数为转染效率。　１．４卯母细胞的成熟培养　由屠宰场收集卵巢并在３７℃生理盐水中运送　回实验室，抽取３～５　ｍｍ直径的有腔卵泡收集卵母　细胞卵丘复合体，实体显微镜下挑选具有完整的三　层以上卵丘细胞的卵母细胞用于成熟培养；成熟培　养液为改进的ＴＣＭ１９９加１０％￣Ｊ泡液，培养条件为　３８．５℃，５％二氧化碳、９５％空气的气体环境，饱　和湿度；成熟培养４２　ｈ采用０．５％透明质酸酶去除　卵丘细胞，以第一极体排放作为卵母细胞成熟的判　定标准，挑选成熟卵母细胞用于核移植试验。　１．５转基因体细胞核移植　采用融合法进行体细胞核移植，过程如下：先　去除ＭⅡ卵的纺锤体及第一极体，选取一个转基因　体细胞注射到透明带下，并使之与卵母细胞质膜紧　密接触，直流电击（１．２　ｋＶ・ｃｍ～、３０　ｔｘｓ、２次脉冲）　诱导体细胞与去核卵母细胞融合形成重构胚并使之　激活；所用］二具、液体、仪器如下：固定管内径为　３０　ｍ，注射管内径２５　ｔｘｍ；卵母细胞普通操作液　为含５　ｍｇ・ｍＵ　的改进型ＴＣＭ１９９，卵母细胞显微操　作液为添加７．５　ｔｚｇ・ｍＬ　细胞松弛素Ｂ（ＣＢ）的卵母　细胞普通操作液，融合液为含１．０　ｍｍｏｌ・Ｌ　钙离子　和０．１　ｍｍｏｌ・Ｌ－　镁离子的３％甘露醇溶液；显微操作　系统为日本Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ公司ＮＴ一８８ＮＥ系统；融合仪　为美国ＢＴＸ公司的ＢＴＸ２００１型电细胞融合仪。　１．６胚胎体外培养和绿色荧光蛋白表达检测　融合的重构胚培养于ＰＺＭ一３培养液中，培养条　件为３８．５℃，５％二氧化碳、９５％空气的气体环境，　饱和湿度；胚胎构建当天为第０天，培养至第６天　与４　ｇ・ｍＬ　脂质体转染成纤维细胞６　ｈ（见表１　ｏ　检测结果发现，当ＤＮＡ的量为１．６　ｔｚｇ・ｍＬ　时，转　染率为３．６４％，显著高于０．８　ｇ・ｍＬ　组时的　２．２４％，但是其他三组与上述两组差异不显著。　表１不同ＤＮＡ浓度对转染效率的影响　Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｅｆｉｆｃｉｅｎｃｙ　注：表中同一列标注字母不同表示差异显著（Ｐ＜０．０５　ｏ　Ｎｏｔｅ：ｖａｌｕｅｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓ　ｄｉｆｆｅｒ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５）　２．２不同脂质体浓度对转染效率的影响　１．６　ｔｚｇ・ｍＬ　重组质粒ＤＮＡ分别与２．０、３．０、　４．０、５．０、６．０　ｔｚｇ・ｍＬ　脂质体转染６　ｈ（见表２）。　表２不同脂质体浓度对转染效率的影响　Ｔａｂｌｅ．２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｒｅｇｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｅｆｉｆｃｉｅｎｃｙ　注：表中同一列标注字母不同表示差异显著（Ｐ＜０．０５）。　Ｎｏｔｅ：ｖａｌｕｅｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓ　ｄｉｆｆｅｒ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５）　维普资讯 http://www.cqvip.com ．６６・　东北农业大学学报　第３９卷　结果发现，当脂质体为４．０　ｔｘｇ・ｍＬ　时，转染　分重构胚可以见到明显的绿色荧光（见图版Ⅲ），如　效率最高为３．６１％，与２．０　ｔｘｇ・ｍＬ　的２．０１％转染　图４所示，以表达立场色荧光蛋白的体细胞为共体　效率和６．０　Ｉ＊ｇ・ｍＬ　的２．７０％转染效率两组差异显　获得的重构胚。卵裂率为６６．９％、囊胚率为　著，３．０　ｇ。ｍＬ－　和５．０　ｇ・ｍＬ－　两组与４．０　ｔｘｇ・ｍＬ一　ｌ１．４％、阳性囊胚率为５５．２５％。　和６．０　ｇ・ｍＬ－　组间差异不显著，与２．０　ｔｘｇ・ｍＬ－　组　之间差异显著。　表３不同转染时间对转染效率的影响　Ｔａｂｌｅ　３　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄ翊Ｆｅｒｅｎｔ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　２．３不同转染时间对转染效率的影响　１．６　ｇ・ｍＬ　重组质粒与４　ｇ・ｍＬ－　脂质体分别　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｅｆｉｆｃｉｅｎｃｙ　转染２、４、６、８、１０　ｈ后更换含血清的培养液（见　表３）。结果发现，６　ｈ效率最高为３．７８％，２　ｈ效率　最低为１．９２％，分别与其他四组差异都显著，４、８、　１０　ｈ三组之间差异不显著，与其他两组差异显著。　２．４胚胎体外培养和绿色荧光蛋白表达结果　以Ｇ４１　８筛选的阳性细胞为核供体进行核移植　操作，转染后细胞经过Ｇ４１８筛选，可以形成表达　绿色荧光的细胞克隆（见图版Ｉ），获得的核移植重　注：表中同一列标注字母不同表示差异显著（Ｐ＜０．０５）。　构胚可以正常发育到囊胚期（见图版Ⅱ），并且大部　Ｎｏｔｅ：ｖａｌｕｅｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓ　ｄｉｆｅｒ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．５０）．　表４转基因克隆胚胎体外发育及绿色荧光蛋白表达结果　Ｔａｂｌｅ　４　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ａｎｄ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＧＦＰ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　注：表中同一列标注字母不同表示差异显著（Ｐ＜０．０５）。　Ｎｏｔｅ：ｖａｌｕｅｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓ　ｄｉｆｆｅｒ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５）　Ａ、Ｂ一荧光显微镜下阳性细胞；Ａ　、Ｂ＇－普通光镜下细胞　Ａ．Ｂ－ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌ　ｕｎｄｅｒ　ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；Ａ　．Ｂ　－ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｕｎｄｅｒ　ｎｏｒｍａｌ　ｌｉｇｈｔ　图版Ｉ　筛选３０　ｄ后散在的细胞克隆形成　Ｐｌａｔｅ　Ｉ　Ｓｃａｔｔｅｒｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｃｌｏｎｅ　ｅｍｅｒｇｅ　ａｆｔｅｒ　Ｇ４１８　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｆｏｒ　３０　ｄ　维普资讯 http://www.cqvip.com 第３期　朱军等：利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究　Ａ—Ｄ一分别是荧光镜下ｌ一细胞至８一细胞期的核移植Ｊｌ五胎ＧＦＰ的表达情况；Ａ　一Ｄ　一分别是普通镜下ｌ一细胞至８一细胞期的核移植胚胎的发育形　态；Ｅ，Ｆ一分别是荧光镜下核移植囊胚的ＧＦＰ表达的情况；Ｅ　，Ｆ＇－分别为普通镜下的囊胚形态　Ａ—Ｄ—ｏｎｅ—ｃｅｌｌ　ｓｔａｇｅ　ｔｏ　ｅｉｇｈｔ—ｃｅｌｌ　ｓｔａｇｅ　ｅｍｂ￣ｏｓ　ｕｎｄｅｒ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ＧＦＰ，Ａ　一１）　－ｏｎｅ－ｃｅｌｌ　ｓｔａｇｅ　ｔｏ　ｅｉｇｈｔ—ｃｅｌｌ　ｓｔａｇｅ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｕｎｄｅｒ　ｎｏｒｍａｌ　ｌｉｇｈｔ．Ｅ，Ｆ－ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ　ｕｎｄｅ　ｒ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｔ￣￣ＧＦＰ；Ｅ　，Ｆ＇－ｂｌａｓｔｏｅｙｓｔｓ　ｕｎｄｅｒ　ｎｏｒｍａｌ　ｌｉｇｈｔ　图版Ⅱ　转基因克隆胚胎从细胞到囊胚阶段的体外发育和ＧＦＰ表达情况　Ｐｌａｔｅ　１１　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ＧＦＰ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｃｌｏｎｅｄ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｆｒｏｍ　ｏｎｅ　ｃｅｌｌ　ｔｏ　ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ　ｓｔａｇｅｓ　Ａ、Ｂ一荧光镜下的ＧＦＰ胚胎；Ａ　一普通镜下的ＧＦＰ胚胎；Ｂ　一荧光和白光混合下的ＧＦＰ胚胎　Ａ．Ｂ—ｅｍｂｒｙｏｓ　ｕｎｄｅｒ　ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ＧＦＰ；Ａ　一ｅｍｂｒｙｏｓ　ｕｎｄｅｒ　ｎｏｒｍａｌ　ｌｉｇｈｔ；Ｂ　－ｅｍｂｒｙｏｓ　ｕｎｄｅｒ　ｎｏｒｍａｌ　ｌｉｇｈｔ　ａｎｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　图版Ⅲ　转基因克隆胚胎体外发育及绿色荧光蛋白表达结果　Ｐｌａｔｅ　ｍ　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ａｎｄ　ＧＦＰ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　良好的基础数据。　４　讨　论　试验采用了简便易行的脂质体转染法，脂质体　是介导ＤＮＡ进入细胞的重要试剂，由于其应用简　绿色荧光蛋白是进行转基囚研究的重要标记基　单，效果稳定，现在已经成为非病毒载体转染细胞　因，通过研究绿色荧光蛋白转基因动物，可以为其　的主要转染手段。通过对比研究不同脂质体浓度、　他各类具有重要应用价值的转基因动物的研究提供　不同质粒浓度和不同转染时间对猪胎儿成纤维细胞　维普资讯 http://www.cqvip.com

东北农业大学学报　第３９卷　内的成纤维细胞而言，以４．０　ＩｘＬ・ｍＬ一质脂体和　１．６　・ｍＬ一质粒混合孵育细胞６　ｈ，转染效率最　佳，但是低于报道中效率…】。我们认为之所以转染　效率相对较低，可能是因为所使用的脂质体种类不　同，以及转染效率的计算方法不尽相同。但是应用　此脂质体获得的阳性细胞数可以满足阳性细胞筛　选、建系和核移植的需要。这为今后的同类研究提　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｆｒｏｍ　ｎｏｎｑｕｉｅｓｃｅｎｔ　ｆｅｔａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌｓｔｓ【ａＪ】．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，　２８０：ｌ２５６一ｌ２５８．　［２］Ｗａｌｌ　Ｒ　Ｐｏｗｅｌｌ　Ａ　Ｍ，Ｐａａｐｅ　Ｍ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ＣＯ－－　ＷＳ　ｒｅｓｉｓｔ　ｉｎｔｒａｍａｎｍｍｒｙ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５，２３：４４５—４５　１．　［３］ＭｃＣｒｅａｔｈ　Ｋ　Ｈｏｗｃｒｏｆｌ　Ｊ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ　Ｋ　Ｈ，ｅｔ　１．Ｐｒａｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅ－　Ｂｅ—ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｓｈｅｅｐ　ｂｙ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｆｒｏｍ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　供了可靠的研究基础。　转染后细胞经过Ｇ４１８的筛选，可以形成表　达绿色荧光的细胞克隆（见图版Ｉ），经过挑选培　养后用于核移植。理论上，以阳性体细胞为核供　体经过核移植获得的胚胎，也应该都是阳性胚　胎。但是本试验发现并不是所有的胚胎都是阳　性，这与文献中的结果相符［１２－１３］。原因可能是显　微操作仪不具备荧光激发系统，不能直接挑取　ＧＦＰ阳性细胞用于核移植，也可能由外源基因整　合得不稳定造成，因此不可避免会导致非转基因　细胞核移植胚胎的存在。　本试验中核移植重构胚的卵裂率为６６．９％、　囊胚率为１１．４％、阳性囊胚率为５５．２５％（见表　４）。而在阳性胚胎中发现在２一细胞期胚胎的荧　光变弱，在４一细胞期以后荧光重新开始表达荧　光（见图版Ⅱ），这与Ｌａｉ等对ＥＧＦＰ在早期胚胎　中的表达研究一致，他们认为，刚融合后的核移　植重构胚发出较强的荧光是转染后供体核带入的　ＥＧＦＰ蛋白和ｍＲＮＡ所致；此后带入的蛋白和　ｍＲＮＡ渐渐消亡，荧光变弱；２一和４一细胞期胚　胎发生了母源基因向合子基因的表达转换　（Ｍａｔｅｒｎａｌ—ｚｙｇｏｔｅ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＭＺＴ），ＥＦＧＰ的转录　水平上升，荧光则又开始出现。主要是由于发生　ＭＺＴ所造成的Ｉｌ２】。　在转基因胚胎中，有些卯裂球发出荧光，有　些则不发荧光。其原因可能与卯裂球死亡有关。　Ｐａｒｋ等进行核移植时也发现，重构胚中有些卵裂　球发出荧光，有些则不发荧光，而在能表达ＥＧＦＰ　的重构胚中，５９％存在基因镶嵌表达现象。这是　否也与基因整合不稳定有关，其分子机理仍有待　揭示［　。　［参考文献］　［１】Ｃｉｂｅｌｌｉ　Ｊ　Ｂ，Ｓｔｉｃｅ　Ｓ　Ｌ，Ｇｏｌｕｅｋｅ　Ｐ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｃｌｏｎｅｄ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｃａｌｖｅｓ　．Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０５：１０６６－１０６９．　［４］Ｓｃｈｎｉｅｋｅ　Ａ　Ｅ，Ｋｉｎｄ　Ａ　Ｒｉｔｃｈｉｅ　Ｗ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｈｕｍａｎ　ｆａｃｔｏｒ　ＩＸ　ｔｒ—　ａｎｓｇｅｎｉｃ　ｓｈｅｅｐ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉ　ｆｒｏｍ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｄｅ　ｆｅｔａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌｓａｔｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７８：２１３０－２１３３．　［５］Ｌａｉ　Ｋｏｌｂｅｒ—Ｓｉｍｏｎｄｓ　Ｄ，Ｐａｒｋ　Ｋ　Ｗ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｐｈａ－１，　３－ｇａｌａｃｔｏｓｙｈｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｐｉｇｓ　ｂｙ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　［ＪＪ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９５：１０８９—１０９２．　【６］Ｄａｉ　Ｙ，Ｖａｕｇｈｔ　Ｔ　Ｄ，Ｂｏｏｎｅ　ｅｔ　ａ１．Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｌｐｈａ－１，３－ｇａｌａｅｔｏｓｙｈｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｃｌｏｎｅｄ　ｐｉｇｓ【ＪＪ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅ－　ｃｈｎｏ１．２００２，２０：２５ｌ一２５５．　［７］Ｈａｏ　Ｙ　Ｈ，Ｙｏｎｇ　Ｈ　Ｙ，Ｍｕｒｐｈｙ　Ｃ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｈｅ－　ｌｉａｌ　ｎｉｔｉｒｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｅＮＯＳ）ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｐｉｇｌｅｔｓ【ＪＪ．Ｔｒａｎｓ—　ｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，１５：７３９－７５０．　【８］Ｐｈｅｌｐｓ　Ｃ　Ｋｏｉｋｅ　Ｃ，Ｖａｕｇｈｔ　Ｔ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌａｐｈａ－１，３－　ｇａｌａｃｔｏｓｙｈｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｐｉｇｓ［￣．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，２９９：４１　１—　４１４．　［９］成勇，王玉阁，罗金平，等．由成年转基因山羊体细胞而来的克　隆山羊［ＪＪ．生物工程学报，２００２，ｌ８（１）：７９—８３．　【ｌ０］龚国春，戴蕴平，樊宝良，等．利用体细胞核移植技术生产转基　因牛【Ｊ】．科学通报，２００３，４８（２４）：２５２８—２５３３．　【１　１］Ｔａｎ￣ｒａａ　ｎｏｗｌｉｎｇ，Ｍｉｅｈｅｌｌｅ　ｄｅｓｌｅｒ，Ｃｈａｒｌｅｓ　ｋｕｓｚｙｎｓｋｉ，ｅｔ　１ａ．Ｔｒａｎｓｆ－　ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｍｂｒｙｏｎａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ａｔ　ｈｉｇｈ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｕｓｉｎｇ　ｌｉｐｏｓｏｍｅ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ【ＪＪ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｖ－ｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００２，６３：３０９－３１７．　［１２］Ｌａｉ　Ｌ，Ｐａｒｋ　Ｋ　Ｗ，Ｃｈｅｏｎｇ　Ｈ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｉｇ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｕｓｉｎｇ　ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ～ｔｒｅａｔｅｄ　ｆｉｂｒｏｂｌｓａｔｓ　ａｓ　ｄｏｎｏｒ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｒｅｐｒｏｄ　Ｄｅｖ，２００２，６２：３００—３０６．　［１３］Ｌｅｅ　Ｇ　Ｓ，Ｋｉｍ　Ｈ　Ｓ，Ｈｙｕｎ　Ｓ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｄｏｕｃｔｉｏｎ　ｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｃｌ—　ｏｎｅｄ　ｐｉｇｌｅｔｓ　ｆｒｏｍ　ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｆｅｔｌａ　ｆｉｂｒｏｂｌｓａｔｓ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ１．Ｔｈｅｒｌｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，２００５，６３：９７３—　９９１．　［１４］Ｐａｒｋ　Ｋ　Ｗ，Ｃｈｅｏｎｇ　Ｈ　Ｔ，Ｌａｉ　ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒｎａ－　ｓｆｅｒ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｓｗｉｎｅ　ｔｈａｔ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｔｈｅ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ａｎｉｍ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００１，１２：１７３—１８１．　维普资讯 http://www.cqvip.com 第３期　宋军等：利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究　６９　Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　（ＧＦＰ）ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｉｇ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ＳＯＮＧ　ＪｕｎＩ，ＷＡＮＧ　Ｚｈｅｎｋｕｎ　，ＫＯＮＧ　Ｑｉｎｇｒａｎ　，ＺＨＡＯ　Ｘｉａｎｇｊｉｅ　，ＬＩＵ　Ｌｉｑｉｎｇ　，　ＴＩＡＮ　Ｊｉａｎｇｔｉａｎ　，ＺＨＥＮＧ　Ｚｈｏｎｇ　，ＳＵＮ　Ｓｈｕａｎｇ　，ＹＩＮ　Ｚｈｉ　，ＬＩＵ　Ｚｈｏｎｇｈｕａ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１５００３０，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１５００３０，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗａｓ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｗｅｒｅ　ｒｅｃｏｎｓｔｒ—　ｕｃｔｅｄ　ｂｖ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｏｆ　ＧＦＰ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｔｏ　ｅｎｕｃｌｅａｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍａｔｕｒｅｄ　ｏｏｃｙｔｅｓ，ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｒｅｃ０ｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｂｏｔｈ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ，ａｎｄ　ＧＦＰ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｃｈｅｃｋｅｄ　ａｓ　ｗｅｌ１．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　Ｄｏｒｃｉｎｅ　ｆｅｔａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｃｕｌｌｔｕｒｅｄ　ｗｉｔｈ　４．０　Ｉｘｇ・ｍＬ一　ｌｉｐｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｒｅｇｅｎｔ　ａｎｄ　１．６　ｇ・ｍＬ一　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ　ｆｏｒ　６　ｈ０ｕｒｓ　ｒ｜ｅｓｕＩｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　４．４８％．ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＧＦＰ　ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｅｍｂｒｙ０ｓ　ｗａｓ　１０％。ＧＦＰ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　４８％．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｒｅｇｅｎｔ　ｃｏｕｌｄ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔ　ＰＦＦ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ　ｈａｖｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｔｙ　ｔｏ　ｓｕｐｐｏｒｔ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｎｓｔｕｒｃｔｅｄ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ｔｏ　ｔｅｒｍ－　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ；ｇｒｅｅｎ　ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ；ｌｉｐｏｓｏｍｅ；ｐｉｇ