溶氧对L-缬氨酸发酵过程的影响

生技　术　通　讯…ＬＥ　ＴｒＥＲ　Ｓ　ＩＮ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　Ｖｏｌ　．２１　　Ｎｏ４　Ｊ．　ｕｌ　２０１０　．，　２０１０１ＴＩ　…一・一，．．．，５０９　ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００９—０００２．２０１０．０４．０１４　研究报告　溶氧对　一缬氨酸发酵过程的影响　马雷　一，秦永峰　，徐庆阳　，谢希贤　天津科技大学ａ．电子信息与自动化学院，天津３００２２２；ｂ．生物工程学院，天津３００４５７　［摘要］　目的：以黄色短杆菌ＸＶ０５０５为供试菌，探索溶氧对　一缬氨酸发酵过程的影响及其控制策略。方法：利用　５Ｌ发酵罐，考察了不同溶氧浓度对　一缬氨酸发酵的影响，并采用代谢流分析对其结果进行阐述，提出分阶段溶氧控　制策略。结果：采用分阶段溶氧控制策略，即在０－２４　ｈ溶氧浓度为２０％，２４～６０　ｈ溶氧浓度为５％，发酵６０　ｈ，Ｌ一缬　氨酸可达到５８．３６　ｇ／Ｌ，比５％和２０％溶氧浓度下分别提高了１８．９５％和１３．５６％。结论：溶氧浓度对，Ｊ一缬氨酸发酵有　重要影响。　［关键词］￡一缬氨酸；溶氧；代谢流分析；发酵　［中图分类号］ＴＱ９２２　［文献标识码］Ａ　［文章编号］　１００９—０００２（２０１０）０４—０５０９—０６　Ｔｈｅ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ　Ｏｘｙｇｅｎ　ｏｎ　Ｌ－Ｖａｌｉｎｅ　ｉｎ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ＭＡ　Ｌｅｉ　ｂ，ＱＩＮ　Ｙｏｎｇ－Ｆｅ　ＸＵ　Ｑｉｎｇ－Ｙａｎｇｂ，ＸＩＥ　Ｘｉ－Ｘｉａｎ　ａ．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３００２２２；ｂ．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３００４５７；　Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｃｈｉｎａ　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ　ｏｘｙｇｅｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌ－ｖａｌｉｎｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆｏｒ　ｃｏｎｔｒｏｎｌｉｎｇ　ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ　ｏｘｙｇｅｎ　ｗｉｔｈ　Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌ￣ｕｍ　ＸＶ０５０５　ａｓｆ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｓｔｒａｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ　ｏｘｙｇｅｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｌ－ｖａｌｉｎｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｔｉｅｄ．Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｒｅａｓｏｎ　ｗａｓ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ　ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ　ｉｎ　ｄｅ—　ｔａｉｌ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｌｕｘ　ｆｏｒ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｉｎ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｎｅｔｗｏｒｋ，　ａｎｄ　ｐｏｓｅ　ｔｈａｔ　ａ　ｔｗｏ－ｓｔａｇｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｕｐｐｌｙ　ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｏｎ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｕｐｐｌｙ　ｓｔｒａｔｅｇｙ，ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｌ－ｖａｌｉｎｅ　ｗａｓ　５８．３６　ｇ／Ｌ　ｉｎ　５　ｌｉｔｅｒ　ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ　ｉｎ　６０　ｈ．　ｉｎｃｅａｓｅｓ　１８．９５％ａｎｄ　１３．５６％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｗｉｔｈ　ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ　ｏｘｙｇｅｎ　ｃｏｎｃｅｎｔ　ｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　５％ａｎｄ　２０％．Ｃｏｎｃｌｕｔｉｏｎ：Ｔｈｅ　ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ　ｏｘｙｇｅｎ　ｈａｖｅ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｉｍｐａｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｌ－ｖａｌｉｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］Ｌ－ｖａｌｉｎｅ；ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ　ｏｘｙｇｅｎ；ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ａｎｓｙｓｉｓ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　一缬氨酸属分支链氨基酸，是人和动物的必需　好氧微生物通常需要大量的氧来氧化细胞中　氨基酸之一，也是合成机体抗体、激素和酶的原料，　广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品等领域。随着　对　一缬氨酸发酵法的深入研究，发酵法已取代了传　统的化学合成法、提取法，成为生产，Ｊ一缬氨酸的主　的ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ和ＦＡＤＨ　，将能量转化为生物体可利　用的ＡＴＰ，以维持细胞正常代谢。氨基酸生产菌株　均为好氧微生物，故溶氧浓度（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ　ｏｘｙｇｅｎ，　ＤＯ）是微生物发酵生产氨基酸的一个重要参数。需　氧浓度取决于细胞代谢、基因调控机制，以及目的　要方法，但目前国内发酵水平（５３．４　ｇ／Ｌ）与国际水　平（７０　Ｌ）仍有很大差距，需要进一步技术攻关，提　产物合成的共同的作用结果［３１。溶氧浓度过低，菌体　的生长呼吸得不到满足，生长受限，致使菌体浓度　过低，影响目的产物的合成；溶氧浓度过高，会产生　超氧化物或羟基自由基，抑制目的产物合成途径中　酶的活力，也影响目的产物的积累　。为了了解不同　溶氧浓度对　一缬氨酸发酵中胞内代谢流分布的影　［收稿日期］２０１０—０３—０４　［基金项目］国家科技重大专项（２００８ＺＸ０９４０１—０５）；天津市应用基　础及前沿技术研究计划（０８ＪＣＺＤＪＣ１５４００）；天津市科技　支撑计划重点项目（０８ＺＣＫＦＳＨ０１９０ｏ）　［作者简介］马雷（１９７１一），男，副教授，博士研究生　［通信作者］谢希贤，（Ｅ—ｍａｉｌ）ｘｉｘｉａｎｘｉｅ＠ｔｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃａ　高发酵产率【”。在传统的发酵控制优化方法中，通过　过程参数优化环境条件及营养物质，使其适于细胞　的生长和产物的生成，但未能掌握环境因子扰动下　的细胞内代谢信息，使在优化过程中缺乏足够的依　据。而代谢流分析通过对不同条件下细胞内代谢流　分布的研究，提供了代谢网络中的流量分配信息，　将各条件下细胞代谢信息量化，可弥补传统控制优　化的缺陷。目前，代谢流分析方法已成功地用于部　分氨基酸和有机酸的发酵控制优化闭。　５１０　响，我们利用代谢流分析方法探讨了各条件下的代　谢信息，以期得到较优的溶氧控制策略。　１材料与方法　１．１　菌种　黄色短杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）ＸＶ０５０５　（Ｌｅｕ一＋Ｉｌｅ一十２一ＴＡ　＋仅一ＡＢ　＋ＳＧ　）为天津科技大学代谢　工程研究室保藏菌种。　１．２培养基（／Ｌ）　１．２．１　活化培养基蛋白胨１０．０　ｇ，牛肉膏１０．０　ｇ，　酵母膏５．０　ｇ，氯化钠２．５　ｇ，琼脂条２５．０　ｇ，葡萄糖　１．０　ｇ，ｐＨ７．０－７．２，０．１　ＭＰａ灭菌２０　ｍｉｎ。　１．２．２种子培养基葡萄糖２５．０　ｇ，玉米浆２０　ｍＬ，　豆饼水解液１５　ｍＬ，酵母粉４．０　ｇ，尿素０．６　ｇ，　Ｋ２ＨＰＯ４　１．０　ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．４　ｇ，ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０１　ｇ，ＶＢ１　０．３　ｍｇ，生物素０．２　ｍｇ，ｐＨ７．０－７．２，０．１　ＭＰａ灭菌２０　ｍｉｎ。　１．２．３发酵培养基葡萄糖８０．０　ｇ，玉米浆２０　ｍＬ，　豆饼水解液２５　ｍＬ，（ＮＨ４）２ＳＯ４　２．０　ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４　１．２　ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０　０．４　ｇ，ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０１５　ｇ，Ｉｌｅ　０．０６　ｇ，Ｌｅｕ　０．２　ｇ，Ｍｅｔ　０．５　ｇ，ＶＢ１　０．３　ｍｇ，生物素　０．２　ｎａｇ，ｐＨ７．０－７．２，０．７５　ＭＰａ灭菌２０　ｍｉｎ。　１．３培养方法　１．３．１　斜面活化培养３２　培养２０　ｈ。　１＿３．２种子培养　５００　ｍＬ挡板三角瓶装液量５０　ｍＬ，９层纱布覆口，旋转式摇床１８０　ｒ／ｍｉｎ，３２ｏｃ振荡　培养１５　ｈ。　１．３＿３　５Ｌ发酵罐分批补料发酵　装液量３　Ｌ，接种　量４００　ｍＬ，３２℃，自动流加２５％氨水控制ｐＨ７．０，通　风量３　Ｌ／ｒａｉｎ，搅拌转速依溶氧所需设定，发酵到一　定时间开始流加８００　ｇ／Ｌ的葡萄糖补料液，发酵６０　ｈ。　１．４分析方法　１．４．１　菌体浓度测定　发酵液用蒸馏水稀释至１／　２０后，用Ｖ一１２００型分光度计测定Ｄ　值，测得的　Ｄ值与吸光度一菌体干重曲线对照。　１．４．２发酵液中氨基酸含量的测定参照文献　］。　１－４＿３残糖和乳酸测定　采用ＳＢＡ一４０Ｃ生物传感　仪测定。　１－４．４溶氧及ｐＨ值测定利用电极在线测定（溶　氧以溶氧电极在空气中的溶氧水平设定为１００％，　以饱和亚硫酸钠溶液中的溶氧为０）。　１．５　Ｌ一缬氨酸生物合成代谢流平衡模型的建立　相关文献报道同，在黄色短杆菌中，存在ＥＭＰ、　生ＬＥ　ＴＴＥＲ　技　术　通　讯…１丫ｒ　Ｓ　ＩＮ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　Ｖｏｌ　２　．１．一１　Ｎ。．・一１　ｏ・　４　Ｊｕｌ．　２０１０　・，２０１０，　ＴＣＡ和ＨＭＰ途径，其中ＨＭＰ途径能为氨基酸合成　提供大量的ＮＡＤＰＨ，对　一缬氨酸合成意义重大，因　此在构建，Ｊ一缬氨酸生物合成途径时必须完整保留　ＨＭＰ途径。研究表明［７１，在以葡萄糖为底物的培养基　中，乙醛酸循环并未出现，且磷酸烯醇式丙酮酸羧　化酶（ＰＰＣ）在黄色短杆菌回补途径代谢流中占到　９０％，故ＴＣＡ循环的回补途径中仅考虑磷酸烯醇式　丙酮酸的羧化反应。　通过对发酵液的检测得知，其中仅含有缬氨　酸、丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸和乳酸，因此代谢途径　中不考虑其他合成支路。基于以下原则建立Ｌ一缬氨　酸的代谢网络：①细胞代谢过程中不存在乙醛酸循　环；②不考虑　一亮氨酸和Ｌ一异亮氨酸代谢支路；⑧　反应途径产生的ＮＡＤＰＨ与ＴＣＡ循环、ＨＭＰ途径产　生的ＮＡＤＰＨ总数相等；④Ｐ／Ｏ假设为１：２；⑤按固　定比例进行的反应以及无分支的中间反应尽量简　化为一个反应方程；⑥根据Ｊｏｓｅｐｈ对菌体组成的报　道［８］，该菌的化学式为Ｃ，所Ｈ　Ｏ　．９４Ｎｎ　。　一缬氨酸的　生物合成途径如图１所示。　２结果与讨论　２．１　不同溶氧浓度下　一缬氨酸的分批发酵过程　黄色短杆菌ＸＶ０５０５为好氧微生物，溶氧过高　或过低均对发酵过程不利，过高会导致后期酶活力　降低，过低会影响前期菌体的生长。因此，有必要考　察溶氧浓度对整个发酵过程的影响。我们研究了　５％、２０％、３５％和５０％溶氧浓度下　一缬氨酸的分批　补料发酵情况，结果见图２，发酵过程参数见表１。　由图２Ａ可知，溶氧浓度为５％时菌体量明显低　于其他条件，菌体生长的延滞期随着溶氧浓度的增　加而逐渐缩短。说明供氧充足时菌体呼吸旺盛，可　保持较快的生长速率。溶氧浓度较低时，菌体的生　长呼吸得不到满足，生长受限，致使菌体浓度过低，　影响发酵中后期　一缬氨酸的生成。由图２Ｂ、Ｃ及表　１可知，随着溶氧浓度的增加，最高耗糖速率和最高　产酸速率逐渐增大，达到最大值的时间也逐渐缩　短，但维持时间越来越短。其中，当溶氧浓度为２０％　时平均耗糖速率最高，不利于糖酸转化率的提高；　而溶氧浓度为５％时高产酸速率维持时间较长，有　明　，由于　一缬氨酸合成途径不经过ＴＣＡ循环，则　知，在高溶氧浓度（２０％、３５％和５０％）下，菌体产酸　利于Ｌ一缬氨酸的积累。说明高溶氧使菌体过早衰　退，酶活力下降较快，产酸稳定期较短。且有研究表　后期产酸稳定期不需过高溶氧。由图２Ｄ及表１可　马雷等：溶氧对三一缬氨酸发酵过程的影响　５１１　图ｌ　一缬氨酸生物合成代谢网络　Ｇ６Ｐ：６－磷酸葡萄糖；Ｆ６Ｐ：６－磷酸果糖；ＧＡＰ：３－磷酸甘油醛；３一ＰＧ：３一磷酸甘油酸；ＰＥＰ：磷酸烯醇式丙酮酸；Ｐｙｒ：丙酮酸；Ｒｉｂｕ５Ｐ：５－磷酸核酮　糖；Ｒｉｂ５Ｐ：５一磷酸核糖；ＸｙＩ５Ｐ：５一磷酸木酮糖；Ｓｅｄ７Ｐ：７－磷酸景天糖；Ｅ４Ｐ：４一赤藓糖；Ａｌａ：丙氨酸；Ｌａｃ：乳酸；ｄ—ＫＩＶ：ｄ一酮异戊酸；ＣＩＴ：柠檬酸；　ＩＣＩ：异柠檬酸；Ｏｔ—ＫＧ：Ｏｔ一酮戊二酸；ＳｕｃＣｏＡ：琥珀酰辅酶Ａ；Ｓｕｅ：琥珀酸；ＯＡＡ：草酰乙酸　较早，较５％溶氧浓度提前了５　ｈ左右，但菌体活力　较早衰退，则较高产酸速率维持时间较短，后期产　酸缓慢。溶氧浓度为５％时高产酸速率维持时间较　长，说明低溶氧有利于菌体保持酶活力，但由于前　５０％时０．９　ｇ／Ｌ，故采用２０％为高溶氧浓度。在发酵　中后期，有大量　一缬氨酸合成，生物量几乎不变，溶　氧只须维持菌体基本呼吸即可。低溶氧浓度（５％）　下，菌体不易衰退且活力维持时间长，产酸速率可　达到１．２　ｇ／（Ｌ・ｈ）左右，维持时间为４０　ｈ。由上述分　期菌体净增较低，产酸未达到最高。由上述分析可　知，溶氧对发酵生产Ｌ一缬氨酸有重要影响，故须合　理控制溶氧浓度，使菌体在较佳的环境中得以更充　析可知，根据　一缬氨酸发酵过程中菌体生长和目的　产物合成情况，可其将分成２个阶段，即菌体生长　表１　不同溶氧浓度下￡一缬氨酸发酵过程的参数比较　分地生长和最大限度地合成目的产物，但二者较佳　环境条件不同。　一缬氨酸的形成速度与生物量有　关，在发酵前期，　一缬氨酸合成较少，以菌体生长为　主。由图２Ａ可知，维持高溶氧浓度，菌体延滞期缩　短，生物量大，可为中后期合成　一缬氨酸提供更多　的中间代谢物。溶氧浓度为２０％时平均产酸速率最　高，生物量可达到２０．６３　ｇ／Ｌ，仅低于溶氧浓度为　５ｌ２　生　ＬＥＴＴＥＲＳ　ＩＮ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　Ｖｏ１．２１　Ｎｏ．４　Ｊｕ１．，２０１０　物　技　术　通　讯　Ａ　年　：　一一　　１嘲ｆ　瓣　期　鞋　Ｃ　车　２　、。　一　蒯　眭　脯　臻　｛Ｉｌ｝　馏　崩　』　图２不同溶氧条件下　一缬氨酸的分批发酵过程　■５％ＤＯ；●２Ｏ％Ｄ０；▲３５％Ｄ０；Ｙ５０％ＤＯ　阶段（４－１６　ｈ）和　一缬氨酸合成阶段（２８～５６　ｈ）。　２．２不同溶氧浓度下　一缬氨酸发酵过程中的代谢　流分析　（ＰＥＰ）和仅一酮戊二酸（仅一ＫＧ）等前体物质和还原力　ＮＡＤＰＨ。从表３可以看出，随着溶氧浓度的增加，通　往ＨＭＰ和ＥＭＰ途径的ｒ２和ｒ８流量由６．２８和　为了掌握各溶氧浓度对　一缬氨酸发酵过程的　影响，了解溶氧浓度下代谢网络中主要节点处的代　谢流分布情况，我们对其进行了胞内代谢流分析，　以期为优化　一缬氨酸发酵过程中的溶氧控制提供　更充足的依据。　１０５．３８分别增至１０．０６和１０９．０４，生成菌体的ｒ２９　代谢流由４３．８３增至４９．５６，通往ＴＣＡ循环的ｒ１５流　量从１１１．７１增至１１５．６０，由此可为菌体生长提供更　多的Ｏｒ．一ＫＧ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ及ＡＴＰ。故从菌体生长　期代谢流分布来看，２０％的溶氧浓度有利于前期菌　体生长。　分别在５％和２０％溶氧条件下于５Ｌ发酵罐中　进行　一缬氨酸的发酵，并测定各阶段发酵液中的葡　萄糖、缬氨酸、丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸及乳酸的胞　外浓度，计算各自的消耗或积累速率，结果如表２，　进入产酸稳定期，菌体生长缓慢，与其合成相　关的代谢流接近于０，代谢流重新分配，碳架导向　表２不同溶氧浓度控制下　一缬氨酸发酵过程中　代谢产物的变化速率［ｇ／（Ｌ・ｈ）］　为便于计算，葡萄糖摩尔消耗速率假定为１００　ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）。利用ＭＡＴＬＡＢ软件计算出５％和２０％　溶氧浓度下各阶段代谢流分布，结果见表３。　在菌体生长期，利用葡萄糖等小分子化合物来　合成细胞的组成物质，以满足菌体生长的需要，因　此须增大ＥＭＰ、ＨＭＰ途径和ＴＣＡ循环的代谢流，为　菌体生长提供６一磷酸葡萄糖（Ｇ６Ｐ）、６一磷酸果糖　（Ｆ６Ｐ）、３一磷酸甘油酸（３－ＰＧ）、磷酸烯醇式丙酮酸　马雷等：溶氧对　一缬氨酸发酵过程的影响　５１３　表３不同溶氧控制方式下　一缬氨酸生物合成的代谢流分布　∞　…　生长期　产酸期　分阶段　…ｍ　　ｒ１６　ｒ１７　ｒｌ８　ｒ１９　ｒ２０　ｒ２１　ｒ２２　ｒ２３　ｒ２４　ｒ２５　ｒ２６　ｒ２７　ｒ２８　ｒ２９　生长期　产酸期　分阶段　５％Ｄ０　２０％Ｄ０　５％ＤＯ　２０％ＤＯ　５％Ｄ０　１０Ｏ　６Ｉ２８　１－２３　５．Ｏ５　１．２　１．２　０．０３　ｌ０５．３８　１Ｏ５－２６　２０９．９８　２０４＿３１　１２．９７　１８８．４８　１２５．６４　１１　１　７ｌ　１００　ｌＯ．Ｏ６　３－３６　６．７　２．３４　２．３４　１．０２　１００　４．０４　２．６９　１．３５　１．３４　１．３４　１．３４　１００　０．４９　０．２７　Ｏ．２２　０．１４　０．１４　０　１２　１００　７．Ｏ５　４．６９　２．３６　２－３５　２－３５　２．３４　１０７．０５　１１　１．７４　２２５．８３　２２５．８１　２．９８　２２２．８２　１０９．５８　１０９．５３　５％Ｄ０　２０％Ｄ０　５％Ｄ０　２０％Ｄ０　５％Ｄ０　ｌｌ１．７１　１ｌ１．７１　１０６．２３　１０６－３５　０－２４　Ｏ．１２　０．１２　２６．２　０．５８　２５．２６　２５－２６　０．２１　４３．８３　ｌ１５．６　ｌｌ５．６　１０７．９５　ｌ０７．９５　１０３．９９　１０９．５３　１０３．９９　１０９，５３　ｒｌ　ｒ２　ｒ３　ｒ４　ｒ５　ｒ６　ｒ７　ｒ８　ｒ９　ｒｌ０　ｒ１１　ｒ１２　ｒ１３　ｒ１４　ｒｌ５　１０６－３５　１０９．５４　１Ｏ７．９４　１０３．８８　１０９．５１　１０９．４４　１０５．９９　∞　１０２．２３　∞　ｌＯ７．９５　∞　１Ｏ９．５４　０．１９　０．１　Ｏ．Ｏ９　２７－２３　Ｏ．５２　２６－４２　２６．４２　Ｏ．１　８　４９．５６　１０７．９４　１０３－８８　１Ｏ９．５１　３．６９　１．９４　１．７５　５９．５８　１３．９　４０．Ｏ５　４０．０５　７．Ｏ８　Ｏ．１２　２．８５　１．６５　１．２　５３－３６　１２＿３９　３６．４７　３６．４７　６．７２　Ｏ．９３　２．９４　１．５６　１．３８　６３．６６　１４．０３　４５．１３　４５．１３　７－３５　０．１５　∞　∞　伯　１０９．０４　１０４．０４　１００．４７　１　ｌＯ．８７　ｌＯ６．７２　１ｏ０．７１　２２２．１３　２１４．７９　２Ｏ１．５３　２１５．７　１４．５８　２１４．７７　２０１．４１　３．７２　３．１２　１９７．８９　２１１．０４　１９８．２３　ｌ３１．３５　１０７．９９　１０４．２９　１１５．６　１０７．９５　１０３．９９　一ｌ｛　Ｖ　其他　旦　１　００　ａｔ　６，　ｌＯ　ｌｔ其他　ｎｔ　上　墉　４９，　删　趔　ｌ瞳　矮　ｌ　—ｊ　—　潞　箍　—、　ｌ两　Ｈ一　Ｊ　图４　５Ｌ罐Ｌ一缬氨酸产量曲线　Ｌ一缬氨酸的合成。丙酮酸为　一缬氨酸生物合成和　ＴＣＡ循环的前体，故丙酮酸节点处代谢流分布对　一　缬氨酸合成起关键作用。ＨＭＰ途径是　一缬氨酸合　为５１．１７％和５２．６１％。与２Ｏ％溶氧浓度相比，５％的　溶氧浓度时通往ＴＣＡ循环的流量增大，减少了碳架　浪费，使更多的碳架导向　一缬氨酸的合成。溶氧浓　成提供ＮＡＤＰＨ的主要途径，增大ＨＭＰ途径的代谢　流是提高　一缬氨酸生物合成所必须的［９－Ⅷ。由图３　可知，在产酸稳定期，在５％和２０％溶氧浓度下，流　向丙酮酸的ｒ１３流量分别为２１１．０４和１９８．２３，其中　流向　一缬氨酸合成途径分别为３７．９５％和３６．７８％，　度控制在５％时，流向ＨＭＰ途径代谢流为４．０４，比　溶氧浓度为２０％时提高了８７．８７％，为　一缬氨酸合　成途径中乙酰乳酸异构酶提供的还原力ＮＡＤＰＨ的　量增加，有利于￡一缬氨酸的积累。　２．３　分阶段溶氧控制策略的提出及验证　流向ＴＣＡ循环（以形成ＰＥＰ的流量为１００％）分别　综上所述，在发酵前期，菌体生长旺盛，￡一缬氨　５ｌ４　生Ｌ技术通讯…Ｖｏ１．．　…２１　Ｎ—ｏ．．　４　Ｊ－－ｕ！．，２．，　…０１０一　ｎ１ＥＲ　ＥＴＴ　Ｓ　ＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ酸合成量较少，提高溶氧浓度有利于菌体生长；在　发酵中后期，菌体浓度基本不变，　一缬氨酸大量合　渐增加，为菌体合成提供了更多中间代谢物，满足　了菌体生长。在产酸稳定期，相对２０％的溶氧浓度，　成，降低溶氧浓度可增加前体物丙酮酸和ＮＡＤＰＨ　的量，使得合成　一缬氨酸的代谢流增加。故为使菌　体生长和产酸能达到最佳，对溶氧进行如下分阶段　控制：Ｏ～２４　ｈ，溶氧浓度为２０％；２４～６０　ｈ，溶氧浓度　为５％。在５Ｌ发酵罐中验证分阶段溶氧控制策略下　一缬氨酸的发酵情况，结果如图４。采用分阶段溶氧　控制策略后，与５％和２０％溶氧浓度相比，Ｌ一缬氨酸　产量分别提高了１８．９５％和１３．５６％。整个发酵过程　保持了较高的菌体合成率和　一缬氨酸产率。利用　ＭＡＴＬＡＢ软件计算出分阶段溶氧控制策略下的代　谢流分布，见表３。　在分阶段溶氧控制策略下，通往ＨＭＰ途径的　流量ｒ２为７．０６，较５％恒溶氧控制时提高了　４２．７７％，说明有更多的代谢流进入ＨＭＰ途径，并产　生更多的ＮＡＤＰＨ，为　一缬氨酸的生物合成提供了　必要的还原力。由图３可知，有４０．５ｌ％的丙酮酸通　往￡一缬氨酸合成途径，而通往ＴＣＡ循环的丙酮酸　流量分别比５％和２０％溶氧浓度下减少了４．０５％和　６．７４％。同时，合成谷氨酸的ｒ２４流量明显高于恒溶　氧控制下的值，为合成　一缬氨酸途径中的转氨作用　提供了更多氨基。　２．４结论　溶氧是微生物好氧发酵的重要营养和环境因　素，不同发酵阶段的需氧量通常不同。本研究中，当　溶氧浓度控制在２０％、３５％和５０％时，菌体干重明　显高于溶氧为５％时，菌体生长的延滞期随着溶氧　浓度．的增加而逐渐缩短。但在此３个溶氧浓度下，　最高产酸速率和最高耗糖速率维持时间较短，而在　５％溶氧浓度下较高的产酸速率可维持４０　ｈ左右，　有利于　一缬氨酸的积累。进一步对５％和２０％溶氧　条件进行了代谢流分析。在菌体生长期，溶氧浓度　增加后，ＥＭＰ、ＨＭＰ途径和ＴＣＡ循环的代谢流量逐　在５％下流向ｒｒＣＡ循环的丙酮酸流量减少，使更多　的碳架导向Ｌ一缬氨酸的合成。通过分析，我们提出　了分阶段溶氧控制策略：０～２４　ｈ，溶氧浓度为２０％；　２４—６０　ｈ，溶氧浓度为５％。在该策略下，发酵６０　ｈ，　￡一缬氨酸产量达到５８．３６　ｇ／Ｌ，且通往ＨＭＰ途径、　丙酮酸和谷氨酸的代谢流高于恒溶氧控制时，为　一　缬氨酸的生物合成提供了更多的前体物。　参考文献　【１】Ｐａｒｋ　Ｊ　Ｈ，Ｌｅｅ　Ｓ　Ｙ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｒａｎｃｈｅｄ　ｃｈａｉｎ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ：ａ　ｆｏｃｕｓ　ｏｎ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ［Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏ—　ｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，８５（３）：４９１－５０６．　【２】卫功元，王大慧，陈坚．不同溶氧控制方式下的的谷胱甘　肽分批发酵过程分析【ＪＪ．化工学报，２００７，５８（９）：２３２９—２３３５．　［３］Ｘｕ　Ｈｏｎｇ，Ｄｏｕ　Ｗｅｎｆａｎｇ，Ｘｕ　Ｈｏｎｇｙｕ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｔｗｏ—ｓｔａｇｅ　ｏｘｙ—　ｇｅｎ　ｓｕｐｐｌｙ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆｏｒ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｌ－ａｒｇｉｎｉｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃｒｅｎａｔｕｍ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｈｘｅｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｅｎｇ　Ｊ，２００９，４３：４１－５１．　［４］徐庆阳，冯志彬，孙玉华．等．溶氧对Ｌ一苏氨酸发酵的影响Ⅲ．　微生物学报，２００７，３４（２）：３１２－３１４．　［５］何晨光，马雷，徐庆阳，等．高效液相法测定分支链氨基酸的　研究叨．生物技术通讯，２００９，２０（４）：５５６－５５８．　［６］　张克旭，赵丽丽，张蓓，等．Ｌ一缬氨酸生物合成中的代谢流量　分析［Ｊ】．微生物学通报，２００３，３０（５）：４９—５３．　［７］李晓华，陈宁，方正星，等．Ｌ一缬氨酸发酵过程的代谢流分析　ｆＪ］．计算机与应用化学，２００４，２１（２）：２５４－２５８．　［８】刘辉，徐庆阳，谢希贤，等．不同碳源生物转化合成Ｌ一亮氨酸　的代谢计量分析脚．生物技术通讯，２００８，１９ｆ２）：２５１—２５４．　［９］　Ｓｈｏｈｅｉ　Ｏ，Ｍａｓａｋｏ　Ｓ，Ｋｅｉｔａｒｏ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄ—ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂｙ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ｕｎｄｅｒ　ｏｘｙｇｅｎ　ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ　［Ｊ】．Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ，２００８，７８：４４９－４５４．　［１０】Ｒｕｋｌｉｓｈａ　Ｍ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