免疫磁珠捕获法检测志贺菌的模拟研究

检验医学２０１２年３月第２７卷第３期Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍａｒｃｈ　２０１２，Ｖｏｌ　２７．Ｎｏ　３　文章编号：１６７３．８６４０（２０１２）０３－０１６７－０４　中图分类号：Ｒ３７８．２　文献标志码：Ａ　免疫磁珠捕获法检测志贺茵的模拟研究　盛跃颖，　陈洪友，　张曦，　庄　源，　陈敏　（上海市疾病预防控制中心，上海２００３３６）　摘要：目的评估所制备的志贺菌免疫磁珠特异性富集作用，为建立基于免疫磁珠捕获法的志贺菌检测流程　提供技术依据。方法制备志贺菌属细菌（鲍氏志贺菌除外）、非目标菌（大肠埃希菌、产气肠杆菌、鲍曼不动杆菌、　肺炎克雷伯菌、弗尼斯弧菌、表皮葡萄球菌）的菌悬液，利用志贺菌特异性多抗免疫磁珠进行捕获，接种平板后进行　菌落计数，并计算免疫磁珠的特异性及非特异性吸附效率。设计干扰试验，在含有１０　ｃｆｕ／ｍＬ的大肠埃希菌悬液　中，加入不同浓度的目标菌，用所制备的磁珠进行捕获，评估免疫磁珠的特异性富集效率。在经３和６　ｈ预增菌的　含有已知量目标菌的奶粉模拟标本及未增菌的粪便模拟标本中，分别加入所制备的磁珠进行捕获，评估基于免疫　磁珠捕获法的志贺菌检测流程的可行性。结果菌落计数表明，制备的志贺菌免疫磁珠对痢疾志贺菌、福氏志贺　茵和宋内志贺菌的捕获效率均超过３０％，对６种非目标菌的非特异性吸附效率＜３％。干扰试验结果显示，与常规　直接平板接种法相比，免疫磁珠捕获法的敏感性提高了约１００倍；奶粉和粪便模拟试验的结果显示，免疫磁珠捕获　法的最低检测限分别可达１０　ｃｆｕ／２５　ｇ和１０　ｃｆｕ／ｍＬ，并对标本中目标菌的检出率有一定提高。结论关键词：免疫磁珠；志贺菌；吸附效率　Ｔｈｅ　ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ＳＨＥＮＧ　志贺菌免疫　磁珠对志贺菌属细菌（鲍氏志贺菌除外）具有一定特异捕获与富集作用，可应用于实验室的日常检测工作。　Ｙｕｅｙｉｎｇ，ＣＨＥＮＨｏｎｇｙｏｕ，ＺＨＡＮＧＸｉ，ＺＨＵＡＮＧ　Ｙｕａｎ，ＣＨＥＮＭｉｎ．　（Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｍｕｎｉｃｉｐａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００３３６，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ　ｏｆ　Ｓｈｉｇｅｌｌａ，ａｎｄ　ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｔｈｅ　ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ　ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｓｐｅｃｉｅｓ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｐｕｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｓｐｅｃｉｅｓ（ｅｘｃｅｐｔ　Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｂｏｙｄｉｉ）ａｎｄ　ｎｏｎ—ｔａｒｇｅｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｕｍａｎｎｉｉ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｖｉｂｒｉｏ　ｌｕｖｆｉａｌｉｓ　ａｎｄ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｃａｌｃｕｌａｔｅ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ａｎｄ　ｎｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｅｆｉｃｉｅｎｃｉｆｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ　ｂｙ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｏｌｏｎｙ．　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｂｙ　ａｄｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｉｘｔｕｒｅｓ　ｗｉｔｈ　１０　ｃｆｕ／ｍＬ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｎｄ　ｄｉａｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｔｈｅ　ｂｅａｄｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｔｈｅ　ＳｈｉｇｅＵａ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｍｉｌｋ　ｐｏｗｄｅｒ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅ—ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｆｏｒ　３　ａｎｄ　６　ｈ　ａｎｄ　ｆｅｃａｌ　ｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅ　ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｕｓｉｎｇ　ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｗａｓ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ｉｆｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ　ｗａｓ　ａｂｏｖｅ　３０％ｔｏ　ｔｈｅ　ｐｕｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ，Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｌｅｆｘｎｅｒｉ　ａｎｄ　Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｓｏｎｎｅｉ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｎｏｎ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｅｆｉｃｉｆｅｎｃｙ　ｏｆ　６　ｎｏｎ—　ｔａｒｇｅｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗａｓ　ｂｅｌｏｗ　３％．Ｔｈｅ　ｄａｔａ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｈａｄ　１００　ｆｏｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｈｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔｓ　ｏｆ　ａｒｔｉｉｆｃｉａｌｌｙ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｍｉｌｋ　ｐｏｗｄｅｒ　ａｎｄ　ｆｅｃａｌ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｉｔｍｓ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅａｃｈ　１０　ｃｆｕ／２５ｇ　ａｎｄ　１０　ｃｆｕ／ｍＬ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ　ｈａｖｅ　ｓｏｍｅ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｃａｐｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ｔｏ　Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ，Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｌｅｆｘｎｅｒｉ　ａｎｄ　ＳｈｉｇｅＵａ　ｓｏｎｎｅｉ，ａｎｄ　ｉｔ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｉｎｔｏ　ｒｏｕｔｉｎｅ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｉｍｍｕｎ０ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄ；Ｓｈｉｇｅｌｌａ；Ｃａｐｔｕｒｅ　ｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｆ志贺菌感染可引起一种常见的肠道传染　病——细菌性痢疾。在我国，由志贺菌引起的食　基金项目：上海市卫生局课题资助项目（２００９１８６）　物中毒事件时有报道　。该菌属细菌的感染剂　量低，少量细菌感染即可导致发病。但由于受污　作者简介：盛跃颖，女，１９７８年生，学士，主管技师，主要从事病原菌检验工作。　通讯作者：陈敏，联系电话：０２１￣２７５８７１０。　检验医学２０１２年３月第２７卷第３期Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍａｒｃｈ　２０１２，Ｖｏｌ　２７．Ｎｏ　３　染的食品中或带菌者中该病原菌含量可能很低，　而其他杂菌种类复杂，易造成漏检。为提高实验　室对该菌的检出率，本研究拟在检测流程中引入　志贺菌多抗免疫磁珠，通过对模拟标本（食品及　粪便标本）中的目标菌进行捕获后分离培养，并　与传统分离方法进行比较，初步评估免疫磁珠捕　获法对目标菌检出率的影响。　材料和方法　一、材料　１．试验菌株用于免疫动物制备抗血清的　菌株分别由南开大学泰达生物技术学院和本实验　室菌种库提供，血清型分别为痢疾志贺菌２型、福　氏志贺菌（１ａ、ｌｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ、６、　ｘ、Ｙ）及宋内志贺菌Ｉ型。其他试验菌株购自美国　典型菌种保藏中心（ＡＴＣＣ）、中国医学微生物菌　种保藏管理中心（ＣＭＣＣ）或由本实验室菌种库　提供。　２．志贺菌多抗免疫磁珠的制备　志贺菌属　多抗免疫磁珠的制备由天津生物芯片技术有限公　司协助完成。采用Ｄｙｎａｌ公司的表面羧基化磁　珠，粒径为１　ｍ。免疫大耳白兔获得针对志贺菌　的多克隆抗血清，与裸磁珠偶联后再进行封闭。　３．试剂和仪器　志贺菌诊断血清购自兰州　生物制品研究所。水解酪蛋白胨（ＭＨ）平板、麦　康凯平板、革兰阴性杆菌（ＧＮ）增菌液、含有　０．１％吐温２０的磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ—Ｔ，ｐＨ值　７．２～７．４）为上海市疾病预防控制中心培养基室配　制。木糖赖氨酸脱氧胆盐（ＸＬＤ）琼脂平板购自上　海科玛嘉公司。麦氏比浊仪购自法国生物梅里埃　公司。磁力架和混旋仪均购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。　４．菌悬液的制备取各试验菌株复苏后，用　比浊仪调节麦氏浊度为１．０—１．５作为原液（起始　菌浓度约１０　ｃｆｕ／ｍＬ），用１％灭菌脱脂牛奶液体　进行系列（１０倍）稀释至菌浓度约为１０　ｃｆｕ／ｍＬ。　取推算浓度为１０。ｃｆｕ／ｍＬ的菌液１００　ｐ，Ｌ接种　ＭＨ平板，置３７℃培养过夜后观察，进行平板计　数，准确细菌定量。　二、方法　１．吸附效率及特异性测定　选取本实验室　保存的痢疾志贺菌２型１株、福氏志贺菌（１ａ、１ｂ、　２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ、６、Ｘ、Ｙ）各１株、宋内　志贺菌Ｉ型１株及非目标菌（大肠埃希菌、产气　肠杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、弗尼斯弧　菌、表皮葡萄球菌）各１株按菌悬液制备的方法　配制一系列菌悬液，选择１０　ｃｆｕ／ｍＬ浓度的菌悬　液１　ｍＬ，取５０　Ｌ接种ＭＨ平板，进行准确的细　菌定量推算菌悬液浓度。在剩余各菌悬液中分别　加人５Ｏ　Ｌ志贺菌多抗免疫磁珠，在常温混合１５　ｍｉｎ后，用混旋仪以１００　ｇ的匀速混合１５　ｍｉｎ，然　后置于磁力架上作用３　ｍｉｎ，弃去上清，加入１　ｍＬ　ＰＢＳ—Ｔ缓冲液重悬磁珠进行洗涤后，重新做磁场　分离，重复该洗涤步骤２次后，用５０　Ｌ缓冲液重　悬磁珠，涂布ＭＨ平板，置３７　ｑＣ培养过夜后观察　结果，进行菌落计数并计算吸附效率：吸附效率　（％）＝吸附后平板上目标菌数量／吸附前标本中　目标菌数量×１００％。　２．干扰试验配制浓度约１０　ｃｆｕ／ｍＬ的干　扰菌［大肠埃希菌（ＡＴＣＣ　２５９２２）］形成原始菌　液，分装成ｉ　ｍｌＭ管，再在原始菌液中定量依次加　入３株实验室分离株（分别为痢疾志贺菌２型，福　氏志贺菌１ａ，宋内志贺菌Ｉ型），使其终浓度分别　约为１０　、１０　、１０　和１０　ｃｆｕ／ｍＬ，充分混合后取１　环（约１０　ＩＬＬ）直接划麦康凯平板进行培养作比　对，再在各菌液标本中加入５０　志贺菌多抗免　疫磁珠，进行免疫磁珠捕获后，涂布麦康凯平板，　置３７℃培养过夜观察结果，并进行菌落计数。　３．志贺菌多抗免疫磁珠对食品模拟标本的　检测取２５　ｇ奶粉加入２２５　ｍＬ的ＧＮ增菌液，再　分别加入１０　、１０　、１０　、１０　ｃｆｕ／ｍＬ的３株实验室　分离株（分别为痢疾志贺菌２型、福氏志贺菌１ａ、　宋内志贺菌Ｉ型）各１　ｍＬ，制成模拟标本１２份，　置于３７℃增菌３和６　ｈ后，取１环（约１０　Ｌ）直　接划ＸＬＤ平板进行培养、比对。同时取１　ｍＬ增　菌液加入５０　志贺菌多抗免疫磁珠，进行免疫　磁珠捕获后，涂布ＸＬＤ平板，置３７℃培养过夜观　察结果，并进行菌落计数。　４．志贺菌多抗免疫磁珠对粪便模拟标本的　测定　以常规培养法志贺菌检测结果为阴性的粪　便ｌＯ份，分别加入适量生理盐水混匀成稀糊状，　分装成１　ｍＬ／管。再定量依次加入３株实验室分　离株（分别为痢疾志贺菌２型、福氏志贺菌１ａ、宋　内志贺菌Ｉ型），使其终浓度分别为１０　、ｌ０　、１０　和１０　ｃｆｕ／ｍＬ。充分混合后取１环（约１０　Ｌ）直　接划ＸＬＤ平板进行培养、比对，再在各标本中加　入５０　志贺菌多抗免疫磁珠，进行免疫磁珠捕　获后，涂布ＸＬＤ平板，置３７℃培养过夜观察结　果，并进行菌落计数。　检验医学２０１２年３月第２７卷第３期ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍａｒｃｈ　２０１２，Ｖｏｌ　２７．Ｎｏ　３　三、统计学方法　采用ＳＰＳＳ　１３．０软件进行分析，组问比较采　用　检验，尸＜０．０５为差异有统计学意义。　结　果　一、吸附效率测定　为了解所制备志贺菌多抗免疫磁珠对目标菌　和非目标菌的捕获率，用本实验室分离获得的志　贺菌进行吸附效率的测定，结果表明所制备的志　贺菌多抗免疫磁珠对目标菌的吸附效率均＞　３０％，对非目标菌的非特异性吸附率均＜３％。见　表１。　表１吸附效率测定结果　菌株　菌株来源　吸附效率（％）　一最　暴　粗　，＼暴＋１粗　帕　１　１　０　Ｏ　Ｏ　０　２　０　８　６　４　２　Ｏ　二、干扰试验　为了解在高浓度杂菌存在下，免疫磁珠对目　标菌的捕获率是否受到影响，将１０　ｃｆｕ／ｍＬ干扰　菌［大肠埃希菌（ＡＴＣＣ　２５９２２）］菌悬液分别与不　同浓度梯度的３种目标菌（痢疾志贺菌２型、福氏　志贺菌１ａ、宋内志贺菌Ｉ型）混合后进行免疫磁　珠捕获，结果显示在干扰菌浓度高于目标菌浓度　１　０００倍的情况下（志贺菌／大肠埃希菌的混合比　例为１　Ｘ　１０　／１×１０　），目标菌检出结果仍为阳性，　其方法敏感性比直接平板划线分离提高了约１００　倍。见图１。　三、志贺菌多抗免疫磁珠对食品模拟标本的　检测　在奶粉模拟标本中，分别加入一系列浓度的　３种目标菌，在３　ｈ时利用免疫磁珠富集后，其检　测限最低可为１０　ｃｆｕ／２５　ｇ，在６　ｈ时，２种方法的　检测限均达到１０　ｃｆｕ／２５　ｇ。见表２。　（１）　（２）　（３）　（４）　混合方案（志贺菌／大肠埃希菌）　注：－．－－免疫磁珠法（痢疾志贺菌２型）；・－■－直接平板　分离法（痢疾志贺菌２型）；＿１．ｒ＿免疫磁珠法（福氏志贺菌１ａ）　一　－直接平板分离法（福氏志贺菌１ａ）；＿．．卜－免疫磁珠法（宋　内志贺菌）；－－◆一直接平板分离法（宋内志贺菌）；混合　方案（志贺’　大肠埃希菌）：（１）１　Ｘ　１０＇／１　Ｘ　１０　，（２）１×１０　／１　×１０　，（３）１　ｘ　１０。／１×１０　，（４）１×１０　／１　ｘ　１０　图１干扰试验结果　表２免疫磁珠捕获法及直接平板分离法检测效果的比较　［％（阳性标本数／总标本数）］　１０　１００（３／３）１００（３／３）１００（３／３）１００（３／３）　１０　１００（３／３）１００（３／３）１００（３／３）１００（３／３）　１０　１００（３／３）１００（３／３）３３（１／３）１００（３／３）　１０　１００（３／３）１００（３／３）０（０／３）１００（３／３）　四、志贺菌多抗免疫磁珠对粪便模拟标本的　检测　在１０份正常粪便标本中，分别加入不同量的　３种目标菌，利用免疫磁珠捕获后其检测限最低　可为１０　ｃｆｕ／ｍＬ。在加入目标菌量１０　和１０　ｃｆｕ　的情况下，免疫磁珠处理后的检出率明显高于直　接平板划线法（Ｐ＜０．０５），在加入目标菌量为　１０　、１０　和１０　ｃｆｕ时，２种方法的检出率差异无统　计学意义（Ｐ＞０．０５）。见表３。　表３免疫磁珠捕获法及直接平板分离法检测效果的比较　［％（阳性标本数／总标本数）］　注：与同加入起始菌量的免疫磁珠捕获法比较，　Ｐ＜Ｏ．０５　检验医学２０１２年３月第２７卷第３期Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍａｒｃｈ　２０１２，Ｖｏｌ　２７．Ｎｏ　３　讨　论　免疫磁珠分离技术是一种利用经过修饰的磁　性微球作为载体进行目标物捕获及富集的技　术　］。在病原微生物检测领域，可用特异性抗体　（单克隆抗体或多克隆抗体）包被磁珠，通过抗原　抗体反应，若标本中存在靶微生物，即可形成磁　珠一目标微生物复合物，并在外部磁力作用下，将　目标微生物从标本中分离出来。目前针对大肠埃　希菌（血清型０２６、Ｏ１１１、０１５７等）、沙门菌等的　免疫磁珠已被商业化，副溶血弧菌、念珠菌等其他　病原体的免疫磁珠也被相继开发，并应用到各种　科研及实验室检测工作中　。　本研究中采用的志贺菌免疫磁珠包被的针对　志贺菌属（除鲍氏志贺菌）的特异性多克隆抗体，　其制备简易，选择上海地区的分离株对其进行吸　附效率测定的结果显示，其对目标菌有较好的富　集作用。为进一步评估免疫磁珠分离技术进行标　本的前处理后是否能提高培养法的敏感性，缩短　检测时间，我们进行了食品和粪便的模拟标本检　测。以低污染的奶粉为食品的模拟标本，加入１０　～１０　０００个目标菌进行２个增菌时间点的取样检　测。免疫磁珠捕获法由于取样量大（一般１　ｍＥ）　且有较好的富集作用，因此在增菌３　ｈ时其检测　限已达到１０　ｃｆｕ／２５　ｇ，比传统的直接平板分离法　提高至少１０倍。按照食品卫生微生物学检验标　准（ＧＢ／Ｔ　４７８９．５－２００３）进行６　ｈ增菌后，直接平　板分离法达到和免疫磁珠富集法相同的检测限。　可见，在标本前处理中加入免疫磁珠可缩短检验　流程中所需增菌的时间，提高方法的敏感性。　在粪便模拟标本的试验中，正常人粪便中大　肠埃希菌等杂菌成分复杂，进行增菌时，大量杂菌　的生长速度远超过了目标菌，易导致结果的假阴　性，因此在这类模拟标本检测过程中，未设计增菌　步骤。在试验中发现，由于标本中背景菌浓度较　高，且可存在各类食物残渣等，对磁珠吸附效率、　方法的检测限都有所影响。在干扰试验中，即使　存在较高浓度的干扰菌，但由于干扰菌成分单一　（只有一种菌），且无其他杂质干扰，免疫磁珠法　的检测限可达１０　ｃｆｕ／ｍＬ。但在粪便模拟标本　中，该方法仅对１份粪便标本（３种目标菌）的检　出限为１０　ｃｆｕ／ｍＬ（该标本中杂菌浓度较低）。可　见，在不同的标本性状及杂菌污染程度下，免疫磁　珠和目标微生物相互作用会受到影响，可降低该　技术的敏感性和特异性。有研究表明，杂菌污染　较多且富含脂质的牛肉类制品，并不适用于该技　术的检测。。　。　我们也对腹泻患者的粪便标本进行了检测，　免疫磁珠捕获法和直接平板分离法的检测结果一　致，未体现出前者对检出率的提高（具体检测数　据未统计）。这主要是由于这类粪便标本中致病　菌往往为优势菌种，菌量较大，对这类标本的检测　不能充分体现免疫磁珠法的优势。因此应扩大检　测范围，对标本中目标菌量较低的标本进行检测，　如慢性携带者或已使用过抗菌药物患者的标本，　利用免疫磁珠进行前处理，进一步评估免疫磁珠　法对粪便中目标菌检出率的影响。　综上所述，所制备的志贺菌免疫磁珠经本研　究初步评估可应用于相关实验室对食品或粪便标　本检测，在对各类标本的检测中，可进一步收集数　据，验证并完善方法，以增加其实用性。　参考文献　［１］　陈桂华，邓建军，陈昌辉，等．一起暴发宋内志贺菌　食物中毒的流行病学及临床特征分析［Ｊ］．临床儿　科杂志，２００９，２７（６）：５４７—５５０．　［２］　张卫军，王洪艳，倪爱琴．一起由志贺菌Ｆ４ｃ型引起　的食物中毒的实验室检测分析［Ｊ］．职业与健康，　２００８，２４（２４）：２６７２—２６７３．　［３］　Ｏｌｓｖｉｋ　Ｏ，Ｐｏｐｏｖｉｃ　Ｔ，Ｓｋｊｅｒｖｅ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｒｅｖ，１９９４，７（１）：４３－５４．　［４］张凡非，杉山宽治，西尾智裕，等．利用免疫磁珠法　分离环境及食品中产生ＴＤＨ副溶血性弧菌的研究　［Ｊ］．中国卫生监督杂志，２００４，１１（１）：７—９．　［５］Ｖａｎｈｅｅ　ＬＭ，Ｍｅｅｒｓｓｅｍａｎ　Ｗ，Ｌａｇｒｏｕ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｄｉｒｅｃｔ　ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖｉａｂｌｅ　Ｃａｎｄｉｄａ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｎ　ｗｈｏｌｅ　ｂｌｏｏｄ　ｂｙ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎ０ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１０，４８　（４）：１１２６－１１３１．　［６］Ｔａｔａｖａｒｔｈｙ　Ａ，Ｐｅａｋ　Ｋ，Ｖｅ：ｇｕｉＨａ　Ｗ，ｅｔ　ａ１．Ａｎ　ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｃａ　ｓｅｒｏｔｙｐｅ　Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ｆｒｏｍ　ａｒｔｉｉｆｃｉａｌｌｙ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ　ｆｏｏｄｓ，　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｓｈｏｒｔ　ｐｒｅｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ，　ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｘｙｌｏｓｅ－ｌｙｓｉｎｅ－ｄｅｓｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ　ａｇａｒ（６ＩＸ　ｍｅｔｈｏｄ）［Ｊ］．Ｊ　Ｆｏｏｄ　Ｐｒｏｔ，２００９，７２（３）：５８３－５９０．　（收稿日期：２０１１—１０—１６）　（本文编辑：姜敏）