不同发育时间蓖麻鲜种子中毒蛋白含量的测定

●　Ｃ　Ｔ　＿　ＡＢＩＩＩＣＵＬＩ＇ＵＲＡＥ　华北农学报Ｂ口哪ｔｌ—Ｉ哪髓　・２０１　５，３０（３）：１　８６－１　９１　不同发育时间蓖麻鲜种子中毒蛋白含量的测定　黄凤兰　，雷　雪　，朱国立　，罗　蕊　，陈晓凤　，赵　永　，李　跃　，孙华军　（１．内蒙古民族大学生命科学院，内蒙古通辽０２８０００；２．内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心，内蒙古通辽０２８０００；　３．东北林业大学生命科学院，黑龙江哈尔滨　１５００３６）　摘要：蓖麻是一种重要的油料作物，种子中含有毒蛋白，蓖麻毒蛋白具有相当明显的抗肿瘤作用。以２１２９蓖麻品　系不同发育时间的鲜种子为材料，利用磷酸盐提取法、ＢＣＡ试剂盒法和ＵＶｗｉｎ５紫外Ｖ５．１．０、ＢａｎｄＳｃａｎ蛋白定量分　析、Ｅｘｃｅｌ、ＩＢＭ　ＳＰＳＳ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ软件，研究种子中毒蛋白的动态积累过程。结果表明：不同发育时间蓖麻鲜种子中，毒蛋　白的含量随着发育时间的增加而逐渐在发育完全成熟即６０　ｄ时达到最大；毒蛋白含量与粗蛋白含量、种仁质量、种子　质量分别呈极显著正相关、显著正相关和正相关关系。基于种子中毒蛋白含量将蓖麻鲜种子的发育时间分为３类：　第１类包括３Ｏ，４Ｏ，５０，６０　ｄ，这些发育时间蓖麻鲜种子中蓖麻毒蛋白含量较高；第Ⅱ类只包括１０　ｄ，毒蛋白含量较低；　第Ⅲ类只包括２０　ｄ，毒蛋白含量中等。不同发育时间蓖麻鲜种子中毒蛋白的动态积累过程是，在种子发育ｌ０～２０，　２０—３０　ｄ时迅速积累，３０—６０　ｄ时积累速度较慢，完全成熟即６０　ｄ时毒蛋白含量达到最大。　关键词：蓖麻种子；毒蛋白；发育时间　中图分类号：￥５６５．６　文献标识码：Ａ　文章编号：１０００—７０９１（２０１５）Ｏ３一Ｏ１８６—０６　ｄｏｌ：１０．７６６８／ｈｂｎｘｂ．２０１５．０３．０３２　Ｍｅａｓｕｒｅｄ　ａｔ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　Ｒｉｅｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｆｒｅｓｈ　Ｃａｓｔｏｒ　Ｓｅｅｄ　ＨＵＡＮＧ　Ｆｅｎｇ　１ａｎ　一，ＬＥＩ　Ｘｕｅ　，ＺＨＵ　Ｇｕｏ—ｌｉ　一，ＬＵＯ　Ｒｕｉ　，　ＣＨＥＮ　Ｘｉａｏ　ｆｅｎｇ　，ＺＨＡ０　Ｙｏｎｇ　，ＬＩ　ｒｕｅ　，ＳＵＮ　Ｈｕａ—ｊｕｎ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｔｏｎｇｌｉａｏ　０２８０００，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｃａｓｔｏｒ，Ｔｏｎｇｌｉａｏ　０２８０００，Ｃｈｉｎａ；　３．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１　５００３６，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃａｓｔｏｒ　ｉｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｏｉｌ　ｃｒｏｐｓ，ｓｅｅｄｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｒｉｃｉｎ，ｗｈｉｃｈ　ｈａｖｅ　ａｎ　ｑｕｉｔｅ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ａｎｔｉ—　ｔｕｍｏｒ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｗｅ　ｕｓｅｄ　２　１　２９　ｃａｓｔｏｒ　ｆｌｅｓｈ　ｓｅｅｄ　ｗｈｉｃｈ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｔｉｍｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ，ｕｓｉｎｇ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ，ＢＣＡ　ｋｉｔ　ｍｅｔｈｏｄ，ＵＶｗｉｎ５，ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔＶ５．１．０，ＢａｎｄＳｃａｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｅｘｃｅｌ，ＩＢＭ　ＳＰＳＳ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｔｏ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｄｙｎａｍｉｃ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｒｉｃｉｎ　ｉｎ　ｓｅｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｅｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：ｒｉｃｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｆｒｅｓｈ　ｃａｓｔｏｒ　ｓｅｅｄｓ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｔｉｍｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｓ　ｗｉｔｈ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｔｉｍｅ，ａｎｄ　ｇｒａｄｕａｌｌｙ　ｒｅａｃｈｅｄ　ｔｈｅ　ｍａｘｉｍｕｍ　ｉｎ　６０　ｄ　ｗｈｅｎ　ｆｕｌｌｙ　ｍａｔｕｒｅ；ｒｉｃｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｎｄ　ｃｒｕｄｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｗａｓ　ｈｉｇｈ—ｓｉｇｎｉｉ－　ｆｃａｎｔ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ，ｗｉｔｈ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｓｅｅｄｓ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｓｅｅｄ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｗｅｒｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｒ—　ｒｅｌａｔｉｏｎ．Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｓｅｅｄ　ｒｉｅｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｆｌｅｓｈ　ｃａｓｔｏｒ　ｓｅｅｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｔｉｍｅ　ｗｉｌｌ　ｂｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｒｅｅ　ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ：Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　３０，４０，５０，６０　ｄ，ｔｈｅｓｅ　ｃａｓｔｏｒ　ｓｅｅｄｓ　ｒｉｃｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ，ｔｙｐｅ　ＩＩ　ｉｎｃｌｕｄｅｄ　ｏｎｌｙ　１０　ｄ，ｌｏｗ　ｒｉｃｉｎ　ｃｏｎ—　ｔｅｎｔ；ｃｌａｓｓ　ＩＩＩ　ｉｎｃｌｕｄｅｄ　ｏｎｌｙ　２０　ｄ，ｍｏｄｅｒａｔｅ　ｒｉｃｉｎ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｉｓ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：ｄｙｎａｍｉｃ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｒｉｃｉｎ　ｉｎ　ｆｌｅｓｈ　ｃａｓｔｏｒ　ｓｅｅｄｓ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｔｉｍｅ　ｉｓ　ｒａｐｉｄｌｙ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ　ｄｕｒｉｎｇ　ｓｅｅｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１　０—２０．２０—　３０　ｄ，ｔｈｅｎ　３０—６０　ｄ　ｂｅｃａｍｅ　ｓｌｏｗ，ｒｉｃｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｒｅａｃｈｅｓ　ｔｈｅ　ｍａｘｉｍｕｍ　ｗｈｅｎ　６０　ｄ　ｆｕｌｌｙ　ｒｉｐｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃａｓｔｏｒ　ｓｅｅｄｓ；Ｒｉｃｉｎ；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｔｉｍｅ　收稿日期：２０１５—０３—２７　基金项目：国家自然科学基金项目（３０７６０１２３；３１１６０２９０）；国家农业部公益性行业专项（２０１００３０５７）；内蒙古自治区高等学校“青年科技　英才支持计划”（ＮＪＹＴ一１４一Ａ１０）；市校合作项目（ＳＸＺＤ２０１２０１８）；内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心开放基金项目　（ＢＭＹＪ２０１１００９）　作者简介：黄凤兰（１９７３一），女，山东菏泽人，教授，博士，主要从事蓖麻分子育种研究。　＾　Ｃ　Ｔ　●　３期　黄风兰等：不同发育时间蓖麻鲜种子中毒蛋白含量的测定　ｌｌｌｌｌｌｌＣＵＬＴＵｌＩＩＩ｜　１８７　蓖麻（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｒｎｍｕｔ￣ｉｓ　Ｌ．）为大戟科蓖麻属植　物…，是世界十大油料作物之一，种子可以榨油。　蓖麻毒蛋白（Ｒｉｃｉｎ）是一种植物毒蛋白，具有相当明　显的抗肿瘤作用，它们能通过抑制蛋白质合成来杀　死癌细胞，是一种对红细胞有强烈凝集活性的蛋白　质　。它于１８８８年由Ｓｔｉｌｌｍａｒｋ从蓖麻种子中分离　得到并命名的。蓖麻毒蛋白相对分子质量约６４．０　ｋＤａ，由Ａ、Ｂ两条链构成，其毒性部分Ａ链相对分子　质量为３２．０　ｋＤａ，是一种Ｎ－糖苷酶，可失活６０　Ｓ核　糖体，导致真核细胞的死亡，是活性链；Ｂ链相对分　子质量为３４．０　ｋＤａ，是一种半乳糖结合型蛋白，几　乎可与所有的真核细胞上半乳糖残基相结合　，　是运载体；Ａ、Ｂ链通过二硫键相连。曾佑炜等　曾　测定过蓖麻种子中毒蛋白的含量，Ｆｅｎｇｌａｎ等　对通　辽地区的蓖麻品种种子中的毒蛋白含量进行了定量　测定；赵志强等　对蓖麻不同部位叶柄中的毒蛋白　含量进行了测定；罗蕊等　对蓖麻组培苗不同部位　叶片中毒蛋白含量进行了测定。但是对不同发育时　间蓖麻鲜种子中毒蛋白含量动态积累的研究未见　报道。　本研究以２１２９蓖麻品系的鲜种子为研究对象，　测定不同发育时间种子中的毒蛋白含量；毒蛋白含　量与种子质量、种仁质量、粗蛋白含量的相关性进行　分析；基于毒蛋白含量对蓖麻鲜种子的发育时间进　行聚类分析，以期研究不同发育时间蓖麻鲜种子中　毒蛋白含量的动态积累过程。　１　材料和方法　１．１试验材料　植物材料为２１２９蓖麻品系材料发育１０，２０，　３０，４０，５０，６０　ｄ的鲜种子，由内蒙古民族大学的内蒙　古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心提供。　仪器：ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ移液枪，德国；Ｈｅｍａ冷冻离心　机，珠海黑马医学仪器有限公司；ＢＣＤ－５５６ＷＳＤＨ型　冰箱，澳柯玛股份有限公司；ＢＳＡ２２４Ｓ－ＣＷ型电子天　平，赛多利斯科学仪器有限公司；ｐＨＳ・３Ｃ精密ｐＨ　计，上海精密科学仪器有限公司；ＤＹＹ一６Ｃ型电泳　仪，北京六一仪器厂；恒温干燥箱，精宏有限公司；格　兰仕微电脑－ＣＨ２０８２型电磁炉，中山市格兰仕生活　电器制造有限公司；ＷＤ－９４０６型胶片观察灯，北京　六一仪器厂；漩涡振荡仪，上海大有仪器；９００　ＳＥ－　ＲＩＥＳ型超低温冰箱，美国Ｔｈｅｒｍｏ；紫外分光光度计，　上海谱元仪器有限公司。　药品：磷酸氢二钠（Ｎａ：ＨＰＯ　・１２Ｈ：０）、磷酸二　氢钠（ＮａＨ２ＰＯ　・２Ｈ：０）、氯化钠（ＮａＣ１）、Ｎ，Ｎ一亚甲基　叫脏札ｌ＿｜１１１１Ｃ●　双丙烯酰胺（ＢＩＳ）、丙烯酰胺（Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、三羟甲　基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ－Ｂａｓｅ）、浓盐酸（ＨＣ１）、过硫酸铵　（（ＮＨ　）　Ｓ　０。）、硫酸铵（（ＮＨ　）　ＳＯ　）、十二烷基磺　酸钠（ＳＤＳ）、四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）、甘氨酸　（Ｇｌｙ）、低相对分子质量蛋白相对分子质量标准（非　预染，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍａｒｋｅｒ）、冰乙酸（ＣＨ　ＣＯＯＨ）、乙醇　（Ｃ　Ｈ　ＯＨ）、考马斯亮蓝Ｒ一２５０（Ｃ　Ｈ　ＮⅫＳ　Ｎａ）、异　丙醇（（ＣＨ　）　ＣＨＯＨ）、聚乙二醇（ＰＥＧ８０００）、甘油　（Ｃ　Ｈ　０　）、溴酚蓝（ｃ　Ｈ　。Ｂｒ　０　Ｓ）、ＢＣＡ蛋白定量　试剂盒等，均购于北京庄盟国际生物基因科技有限　公司。液氮，购于通辽市通达气体公司。　试剂：缓冲液Ａ（磷酸缓冲液ＰＢＳ，含１００　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１，ｐＨ　ｍ－－６．５）、３０％（ｍ／Ｖ）凝胶贮液、１０％（ｍ／Ｖ）　过硫酸铵、１．５　ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ—ＨＣ１（ｐＨ＝８．８）、１　ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣ１（ｐＨ＝６．８）、１０％（ｍ／Ｖ）ＳＤＳ、５×ＳＤＳ－　ＰＡＧＥ　Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ、１　Ｘ　Ｔｒｉｓ—Ｇｌｙｃｉｎｅ　Ｂｕｆｆｅｒ、考马斯　亮蓝Ｒ－２５０染色液、考马斯亮蓝脱色液。　用具：离心管（１００，５００，１　０００　Ｌ）、研钵、研锤、　刀片、ＭＤ２５　ｍｍ透析袋（ＭＷ８０００－１４０００）、培养皿、　烧杯、量筒、玻璃棒、容量瓶等。　１．２试验方法　１．２．１　不同发育时间蓖麻鲜种子中粗蛋白的含量　测定粗蛋白的提取：参照Ｆｅｎｇｌａｎ等　对大量蓖　麻种子中毒蛋白含量的测定方法，并对该方法进行　了优化。具体过程如下：称取一粒发育到某时间的　蓖麻种子，在液氮中充分研磨；加入３　ｍＬ　５　ｍｍｏｌ／Ｌ　磷酸缓冲液（ＰＢＳ，ｐＨ＝６．５，含１００　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１，称　为缓冲液Ａ），并充分混匀，４℃放置过夜；４℃下　１４　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心３０　ｒａｉｎ，小心去除沉淀和白色脂　肪；重复离心一次，取上清；在上清中加入固体　（ＮＨ　）：ＳＯ　，达到７０％饱和度；４℃放置过夜；４　ｃＩ＝　下１４　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心３０　ｒａｉｎ；倒去上清，把沉淀溶解　在３　ｍＬ缓冲液Ａ中；装入透析袋（ＭＷ：８　０００～　１４　０００），用ＰＥＧ（相对分子质量８　０００）包埋后４℃　透析１．５　ｈ；４℃下１４　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心３０　ｒａｉｎ，取上清　即为粗蛋白。记录所得粗蛋白的体积，并设置３个　重复。　蛋白标准曲线的制作：制作标准曲线的方法和　步骤参照北京庄盟国际生物基因科技有限公司的　ＢＣＡ蛋白定量试剂盒说明。　粗蛋白浓度的测定：取１　Ｌ的粗蛋白，稀释　１００倍后测定Ａｂｓ值，并根据蛋白标准曲线公式计　算稀释１００倍后粗蛋白的浓度（ｔｘｇ／ｔｘＬ）。粗蛋白的　浓度（￣ｇ／ＩｘＬ）（Ｃ）＝（ｋ．Ｘ稀释１００倍后的Ａｂｓ＋　ｋ０）Ｘ　１００，ｋｏ＝一０．０８０　９１，ｋ　＝０．９８２　７９。　一－　Ｃ　Ｔ　●　３期　茎　兰兰：三璺查！　苎　兰　！兰竺皇竺兰竺　墨　！１　２２髭黜　蹁监　２．２不同发育时间蓖麻种子粗蛋白含量测定结果　２．２．１粗蛋白提取结果　不同发育时间蓖麻鲜种　蛋白标准曲线折算出稀释１００倍后粗蛋白的浓度，　计算出不同发育时间蓖麻鲜种子中粗蛋白的含量，　子的种子质量、种仁质量和得到的粗蛋白体积见表　１。从表１可以看出，种子质量波动在０．３６８　４～　见表２。从表２可以看出，不同发育时间蓖麻鲜种　子中粗蛋白含量波动在３．６５１　５～１４．７９３　９　ｍｇ，并　在０．０１水平上差异显著。　０．４８６　２　ｇ，在０．０１水平上差异显著；种仁质量波动　范围在０．２３６　７～０．３４０　３　ｇ，在０．Ｏ１水平上差异显　著；粗蛋白的体积波动在０．７０６　７～１．１１３　３　ｍＬ，在　０．０５水平上差异显著。　２．２．２蛋白标准曲线的制作结果根据ＢＣＡ蛋白　定量试剂盒说明，得出浓度计算公式：Ｃ＝ｋ，×　（Ａｂｓ）＋ｋ。，其校正方法为浓度法，ｋ。：一０．０８０　９１，　ｋ，＝０．９８２　７９，相关性为０．９９９　７，测量波长为５６２．０　ａｍ。从紫外分光光度计上得出的蛋白标准曲线见　图３。从图３可以看出，所制作的蛋白标准曲线能　达到要求。　２．２．３粗蛋白含量测定结果　不同发育时间蓖麻　鲜种子的粗蛋白稀释１００倍后测定的Ａｂｓ值、根据　表２不同发育时间蓖麻种子粗蛋白含量测定结果　Ｔａｂ．２　Ｃａｓｔｏｒ　ｓｅｅｄｓ　ａｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｔｉｍｅ　ｃｒｕｄｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｒｅｓｕｌｔｓ　浓度／（ｐｇ／ｐ　Ｌ）　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　图３蛋白标准曲线　Ｆｉｇ．３　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ　２．３不同发育时间蓖麻鲜种子中毒蛋白含量的测　定结果　上差异显著；毒蛋白含量波动是０～２．８００　２　ｍｇ，在　０．Ｏ１水平上差异显著。　２．３．１　粗蛋白的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳结果　不同发育　时间蓖麻鲜种子的粗蛋白进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，重　复３次，其中１次的结果见图４。从图４可以看出，　电泳结果清晰，可被用于ＢａｎｄＳｃａｎ蛋白定量分析软　件进行分析。　２．３．２毒蛋白条带灰度百分比分析和毒蛋白含量　测定结果　不同发育时间蓖麻鲜种子粗蛋白进行　１薰６．０　ｋＤａ■　Ｍ．蛋白Ｍａｒｋｅｒ；１，２，３，４，５，６．发育ｌ０，２０，　３Ｏ，４０，５０，６０　ｄ的蓖麻鲜种子。　Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍａｒｋｅｒ；１，２，３，４，５，６．Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｃａｓｔｏｒ　ｆｒｅｓｈ　ｓｅｅｄｓ　ｉｎ　１０，２０，３０，４０，５０，６０　ｄ．　ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳后，每种蛋白条带的灰度值用Ｂａｎｄ－　Ｓｃａｎ蛋白定量分析软件进行分析，重复３次，其中１　次的分析结果见图５。　根据ＢａｎｄＳｃａｎ蛋白定量分析软件的３次分析　结果，得到毒蛋白含量占粗蛋白含量百分比，并计算　出不同发育时间蓖麻鲜种子中的毒蛋白含量，见表　图４不同发育时间蓖麻鲜种子粗蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳谱　Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｃｒｕｄｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｆｒｅｓｈ　ｃａｓｔｏｒ　ｓｅｅｄｓ　３。从表３可以看出，不同发育时间蓖麻鲜种子中毒　蛋白灰度百分比波动是０～２２．８６％，在０．０１水平　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｔｉｍｅ　３期　黄凤兰等：不同发育时间蓖麻鲜种子中毒蛋白含量的测定　ｌ９ｌ　２０　ｄ，毒蛋白含量中等。　０　∞　５　如　Ｏ　矗；　∞　１５　ｍ　２０　∞图　ｌ２５　７　Ｔ］　Ｉ　］＿Ｊ　ＩＩ　Ⅲｌ　基于毒蛋白含量对蓖麻鲜种子　不同发育时间的聚类图　Ｆｉｇ・７　Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｒｉｃｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｆｒｅｓｈ　ｓｅｅｄ　ｃｌｕｓｔｅｒｓ　ｃｈａｒｔ　ａｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｔｉｍｅ　综合上述结果，可以得出不同发育时间蓖麻鲜　种子中毒蛋白的动态积累过程是，在种子发育１０～　２０，２０～３０　ｄ时迅速积累，３０～６０　ｄ时积累速度较　慢，完全成熟即６０　ｄ时毒蛋白含量达到最大。　３　结论与讨论　３．１　结论　蓖麻是一种重要的油料作物，种子中含有毒蛋　白，蓖麻毒蛋白具有相当明显的抗肿瘤作用。本研　究以２１２９蓖麻品系不同发育时间的鲜种子为材料，　利用磷酸盐提取法、ＢＣＡ试剂盒法和ＵＶｗｉｎ５紫外　Ｖ５．１．０、ＢａｎｄＳｃａｎ蛋白定量分析、Ｅｘｃｅｌ、ＩＢＭ　ＳＰＳＳ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ软件，研究种子中毒蛋白的动态积累过程。　试验结果表明：不同发育时间蓖麻鲜种子中，毒蛋白　的含量随着发育时间的增加而逐渐在发育完全成熟　即６０　ｄ时达到最大；毒蛋白含量与粗蛋白含量、种　仁质量、种子质量分别呈极显著正相关、显著正相关　和正相关关系。基于种子中毒蛋白含量将蓖麻鲜种　子的发育时间分为３类：第１类包括３０，４０，５０，　６０　ｄ，这些发育时间蓖麻鲜种子中蓖麻毒蛋白含量　较高；第Ⅱ类只包括１０　ｄ，毒蛋白含量较低；第Ⅲ类　只包括２０　ｄ，毒蛋白含量中等。结论如下：不同发育　时间蓖麻鲜种子中毒蛋白的动态积累过程是，在种　子发育ｌ０～２０，２Ｏ～３０　ｄ时迅速积累，３０～６０　ｄ时积累　速度较慢，完全成熟即６０　ｄ时毒蛋白含量达到最大。　３．２讨论　本研究所用材料是不同发育时间的蓖麻种子，　应严格取材时间。在２１２９蓖麻品系主穗开花前１　ｄ　去雄花、去掉发育较迟的雌花，套袋。第２天取其他　植株上雄花的花粉给雌花授粉，再套袋，记录授粉时　间。授粉５　ｄ后去掉纸袋，一方面保证雌花授粉充　分并且不接受外来花粉，另一方面保证果实发育所　需要的光照条件。在授粉ｌ０，２０，３０，４０，５０，６０　ｄ时　分别取蓖麻的果实，去除果皮，剥出种子用于试验。　在粗蛋白提取过程中，由于参照的方法　是对　５０　ｇ的种子中毒蛋白含量进行测定，样品量多，相对　误差小。在对单粒蓖麻鲜种子毒蛋白含量进行测定　的试验操作过程中，应尽量减小误差，可通过种子充　分研磨，尽量收集研钵和研锤上的蛋白质、充分溶解　蛋白质、硫酸铵沉淀完全等方式进行。　参考文献：　［１］　郑鹭，祁建民，陈绍军，等．蓖麻遗传育种进展及其　在生物能源与医药综合利用潜势［Ｊ］．中国农学通报，　２００６，２２（９）：１０９—１０３．　［２］　Ｍｏｓｉｎｇｅｒ　Ｍ．Ｔｈｅ　ｃｌａｓｔｏｇｅｎｉｃ　ａｎｄ　ｂｌａｓｔｏｇｅｎｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｂｙ　ｒｉ・　ｃｉｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｙｍｐｈｏｉｄ　ａｎｄ　ｍｙｅｌｏｉｄ　ｔｉｓｓｕｅｓ：ｔｈｅｉｒ　ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ　ａｎｄ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｔｈｅｒａｐｅｕ—　ｔｉｃ　ｖａｌｕｅ　ｉｎ　ｃａｎｃｅｒｏｌｏｙ［Ｊ］．Ｂｕｌｌ　Ａｃａｄ　Ｎａｔ１　Ｍｅｄ，１９５１，　１３５（３—４）：７０—７４．　［３］裴武红，沈倍奋，黎燕，等．ｒＲＴＡ：ＤＳ２７，ｒｉｃｉｎ：ＤＳ２７　两种免疫毒素的初步比较［Ｊ］．中国肿瘤生物治疗杂　志，１９９９，６（１）：４—７．　［４］　裴武红，沈倍奋，黎燕，等．ｒＲＴＡ：ＤＳ２７免疫毒素的　制备和胞内运输［Ｊ］．中国免疫学杂志，１９９９（１５）：　１７４—１７６．　［５］　曾佑炜，宋光泉，彭永红，等．蓖麻毒蛋白的分离纯化和　毒理作用研究［Ｊ］．中国农学通报，２００４，２０（４）：２３—２６．　［６］　Ｆｅｎｇｌａｎ　Ｈｕａｎｇ，Ｙｏｎｇｓｈｅｎｇ　Ｃｈｅｎ，Ｌａｔｕ　Ｓｕｙａ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ａ—　ｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｒｉｃｉｎ　ｆｒｏｍ　ｃａｓｔｏｒ　ｓｅｅｄｓ　ｏｆ　Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ　Ｌ．ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｎ　Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ［Ｊ］．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１２，５：３９９—４０１．　［７］　赵志强，黄凤兰，孙振娜，等．蓖麻不同部位叶柄毒蛋白　含量的测定［Ｊ］．内蒙古农业科技，２０１４（１）：２６—２８．　［８］　罗　蕊，赵志强，黄凤兰，等．蓖麻毒蛋白在蓖麻组培　苗不同部位叶片中含量的测定［Ｊ］．江苏农业科学，　２０１４，４２（４）：４３—４６．