光甘草定抑制p38MAPKERK信号通路减轻脂多糖致大鼠肺损伤的实验观察论文

史堡匡堂塞查！！！！生！！旦！！旦筮堑鲞箍垡翅盟型！丛笪』坠ｉ！！，旦！！！迪竺望：！Ｑ！！：！些堑：塑！：堡．基础研究．光甘草定抑制ｐ３８ＭＡＰＫ／ＥＲＫ信号通路减轻脂多糖致大鼠肺损伤的实验观察张利鹏李建国【摘要】目的探讨中药光甘草定（Ｇｌａｂｒｉｄｉｎ，ＧＬＡ）对脂多糖（ＬＰＳ）致急性呼吸窘迫综合征（ＡＲＤＳ）大鼠的保护作用及可能机制。方法３２只Ｗｉｓｔａｒ大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组（ＬＰＳ组）、光甘草定（ＧＬＡ）组、乌司他丁（咖）组，每组８只。采用腹腔注射ＬＰＳ（１０腔注射乌司他丁（２００００ｍｇ／ｋｇ）的方法制备大鼠ＡＲＤＳ模型，对照组注射同等剂量的生理盐水，ＧＬＡ组将光甘草定灌胃（３０ｍｇ／ｋｇ），ＵＴＩ组腹Ｕ／ｋｇ），１２ｈ后各组大鼠留肺组织及血浆标本。计算肺组织湿／干质量（Ｗｅｔ／Ｄｒｙ，Ｗ／Ｄ）比值；光镜下观察肺组织病理改变；用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）法检测各组血浆中肿瘤坏死因子．ｄ（ＴＮＦ．０【）、自细胞介素．１８（ＩＬ．１８）含量，检测各组肺匀浆中丙二醛（ＭＤＡ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和一氧化氮（ＮＯ）含量；免疫组织化学法检测ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶（ｐ３８ＭＡＰＫ）、细胞外信号调节蛋白激酶（ＥＲＫ）蛋白表达情况；Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测肺组织中磷酸化ｐ３８ＭＡＰＫ（ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ）及磷酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）蛋白表达的变化。结果光镜下观察对照组肺组织结构完整，肺泡腔清晰；ＬＰＳ组肺泡壁增厚，渗出明显，肺组织出现损伤性变化，ＧＬＡ组及ｕ，Ｉ’Ｉ组病理改变较ＬＰＳ组明显减轻。与对照组比较，ＬＰＳ组肺组织Ｗ／Ｄ比值，血浆ＴＮＦ－ｄ、ＩＬ－１８含量，肺匀浆ＭＤＡ、ＮＯ含量均明显升高（Ｐ＜０．０５），而血浆ＳＯＤ含量明显降低；与ＬＰＳ组比较，ＧＬＡ组肺组织Ｗ／Ｄ比值，血浆ＴＮＦ．Ｏｔ、ＩＬ．１８含量，肺匀浆ＭＤＡ、ＮＯ含量均明显降低，而血浆ＳＯＤ含量明显增高［（ＴＮＦ．Ⅸ（肛ｇ／Ｌ）：５１．７±１０．３比１０５．７±３０。５，ＩＬ一１８（仙ｇ／Ｌ）：３７。９４－１３．９比４９．２±１４．５，ＭＤＡ（ｎｍｏｌ／ｍｇ蛋白（ｐｒｏｔ）：２．８７±０．６２比３．８１±０．４２，ＮＯ（Ｉｘｍｏｌ／Ｌ）：１８．９６４－０．７９比２８．５８±２．５１，ＳＯＤ（Ｕ／ｍｇｐｒｏｔ）：１１５．５４－１５．２比７５．９±１４．ｏ）］；免疫组化结果显示：与对照组比较，ＬＰＳ组ｐ．ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐＥＲＫ蛋白在胞核表达均明显增加，而ＧＬＡ组与ＵＴＩ组较ＬＰＳ组表达明显减少；Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测结果显示：与对照组比较，ＬＰＳ组肺组织ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表达明显增高，而ＧＬＡ及ｕＴＩ干预组蛋白表达明显受抑制。结论传统中药光甘草定通过抑制ｐ３８ＭＡＰＫ／ＥＲＫ信号通路、抗氧化作用而减轻炎症，发挥对ＬＰＳ致大鼠ＡＲＤＳ的保护作用。【关键词】蛋白激酶光甘草定；急性呼吸窘迫综合征；ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶；细胞外信号调节基金项目：内蒙古自治区自然科学基金（２０１３ＭＳｌｌ２８）；内蒙古自治区卫生与计划生育委员会基金（２０１３０２０７７）Ｇｌａｂｒｉｄｉｎｒｅｄｕｃｅｓｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙｉｎｒａｔｓｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｐａＳｍｉｔｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ／ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙＺｈａｎｇ￡咖增，丘Ａ口ｎｇｕｏ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｒｉｔｉｃａｌＣａｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，￡ｋＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＺｈｏｎｇｎａｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７１，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＬｉＪｉａｎｇｕｏ，Ｅｍａｉｌ：ｄｒｌｊｇｌ８１７＠１６３．ｃｏｒｎｒａｔｓ，ａｎｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｉｒｔｙ－ｔｗｏＷｉｓｔａｒｒａｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙａｓｓｉｇｎｅｄｉｎｔｏｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ（ＬＰＳｇｒｏｕｐ），ｇｌａｂｒｉｄｉｎｇｒｏｕｐ（ＧＬＡｇｒｏｕｐ），ａｎｄｕｌｉｎａｓｔａｔｉｎｇｒｏｕｐ（ＵＴＩｇｒｏｕｐ），ｗｉｔｈ８ｒａｔｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ．ＡＲＤＳｒａｔｍｏｄｅｌｗａｓｒｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆＬＰＳ（１０ｍｓ／ｋｇ）．Ｔｈｅｒａｔｓｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｒｅｃｅｉｖｅｄａｎ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯＭｅｅｔｌｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｗｈｅｔｈｅｒｇｌａｂｆｉｄｉｎ（ＬＰＳ）ｉｎｄｕｃｅｄａｃｕｔｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｔｒｅｓｓｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＡＲＤＳ）ｉｎｈａｓａｂｅｎｅｆｉｃｉａｌｅｆｆｅｃｔＯｉｌｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｑｕａｌｖｏｌｕｍｅｏｆｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅｓ．ＴｈｅｒａｔｓｉｎＧＬＡｇｒｏｕｐｗｅｒｅＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０３７６－２４９１．２０１６．４８．００９作者单位：４３００７１武汉大学附属中南医院重症医学科（张利鹏现在内蒙古医科大学附属医院工作）通信作者：李建国，Ｅｍａｉｌ：ｄｒｌｊ９１８１７＠１６３．ｃｏｒｎ万方数据生堡医堂苤盍！Ｑ！ｉ芏！！旦！！旦筮！！鲞箜塑塑盟型！丛塑！￡！ｉ塑：旦！！！堡垒竺！！：！！！！：ｙ！！：！！：堕垒堡ｇａｖａｇｅｄｂｙｗｅｒｅｇｌａｂｒｉｄｉｎ（３０ｍｓ／ｋｇ）．Ｔｈｅ１２ｈｏｕｒｓａｆｔｅｒＬＰＳｒａｔｓｉｎＵＴＩｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎｊｅｃｔｅｄｕｌｉｎａｓｔａｔｉｎ（２００００Ｕ／ｋｇ）．Ａｎｉｍａｌｓａｎｄｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｓａｃｒｉｆｉｃｅｄｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｐｌａｓｍａｃｏｌｌｅｃｔｅｄ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏ百ｃａｌｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ｌｕｎｇｗｅｔ／ｄｒｙ（Ｗ／Ｄ）ｒａｔｉｏ，ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ．ｏｔ（ＴＮＦ一０１），ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１８（ＩＬ－１８），ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ（ＭＤＡ），ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ（ＮＯ）ａｎｄｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ）ｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐ３８ＭＡＰＫａｎｄＥＲＫ．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｐ３８ｍｉｔｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ（ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ）ａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ（ｐＥＲＫ）ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅｓ．ＲｅｓｕｌｔＩｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｓ．１ｕｎｇｔｉｓｓｕｅｓｈｏｗｅｄａｎｏｒｍａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｃｌｅａｒｐｕｌｍｏｎａｒｙａｌｖｅｏｌｉｕｎｄｅｒａｌｉｇｈｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｉｎｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ。ＡＲＤＳｃｈａｒａｃｔｅｒｓｓｕｃｈａｓｅｘｔｅｎｓｉｖｅｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇｏｆｔｈｅａｌｖｅｏｌａｒｗａｌｌ．ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｆｉｈｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｅｌｌｓ，ｄｅｍｏｌｉｓｈｅｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｐｕｌｍｏｎａｒｙａｌｖｅｏｌｉ，ａｎｄｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｗｅｒｅｆｏｕｎｄ．ＩｎｔｈｅＧＬＡａｎｄＵＴＩｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｓｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｉｎｌｕｎｇｗｅｒｅｍａｒｋｅｄｌｙａｌｌｅｖｉａｔｅｄｗｉｔｈＬＰＳ—ｉｎｄｕｃｅｄＡＲＤＳｇｒｏｕｐ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｓ，ｌｕｎｇＷ／Ｄｒａｔｉｏ，ＴＮＦ—ｆｔ．ａｎｄＩＬ一１８ｉｎｐｌａｓｍａ，ａｎｄｌｕｎｇＭＤＡ，ＮＯｌｅｖｅｌｓｉｎｌｕｎｇｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓｏｆｔｈｅＬＰＳｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｌｕｎｇＳＯＤｌｅｖｅｌｓｏｆｔｈｅＬＰＳｇｒｏｕｐｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅＬＰＳｇｒｏｕｐ，ｌｕｎｇＷ／Ｄｒａｔｉｏ，ｃｏｍｐａｒｅＴＮＦ—ａａｎｄＩＬ－１８ｉｎｐｌａｓｍａ，ａｎｄｌｕｎｇＭＤＡ，ＮＯｌｅｖｅｌｓｉｎｌｕｎｇｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓｏｆｔｈｅＧＬＡｇｒｏｕｐａｎｄＵＴＩｇｒｏｕｐｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｌｕｎｇＳＯＤｌｅｖｅｌｓｏｆｔｈｅＧＬＡａｎｄｕｌｉｎａｓｔａｔｉｎｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄ４９．２±１４．５，ＭＤＡ［ＴＮＦ－ｏｔ（斗∥Ｌ）：５１．７士１０．３１０５．７±３０．５，ＩＬ一１８（斗∥Ｌ）：３７．９±１３．９ｖｓｖｓ（ｎｍｏ］／ｍｇｐｒｏｔ）：２．８７±０．６２３．８１±０．４２，ＮＯ（ｔｘｍｏｌ／Ｌ）：１８．９６±０．７９２８．５８±２．５１，ＳＯＤ（Ｕ／ｍｇｐｒｏｔ）：１１５．５±１５．２ｖｓ７５．９±１４．０，ａｌｌＰ＜０．０５］．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｖｓｖｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｐ３８ＭＡＰＫａｎｄＥＲＫｉｎｃｙｔｏｐｌａｓｍａｎｄｎｕｃｌｅｕｓｏｆｔｈｅｇｌａｂｒｉｄｉｎａｎｄｕｌｉｎａｓｔａｔｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｐ－ｐ３８ＭＡＰＫａｎｄｐＥＲＫｐｒｏｔｅｉｎｇｌａｂｒｉｄｉｎａｎｄｕｌｉｎａｓｔａｔｉｎｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＬＰＳｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ．ｐｒｏｔｅｉｎＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｇｌａｂｒｉｄｉｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｍｅｌｉｏｒａｔｅｄｔｈｅｌｕｎｇｉｎｉｕｒｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙＬＰＳｉｎｒａｔｓｖｉａｒｅｄｕｃｉｎｇｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｆｆｅｃｔ．ｗｈｉｃｈｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｐ３８ＭＡＰＫａｎｄＥＲＫｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙａｎｄ【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｇｌａｂｒｉｄｉｎ；Ａｃｕｔｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｔｒｅｓｓｓｙｎｄｒｏｍｅ；ｐ３８ｍｉｔｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｌａｎｋｉｎａｓｅ；ＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓＦｕｎｄｐｒｏｇｒａｍ：ＴｈｅＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ（２０１３ＭＳｌｏｆＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＨｅａｌｔｈａｎｄＦａｍｉｌｙＰｌａｎｎｉｎｇＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（２０１３０２０７７）１２８），Ｔｈｅ急性呼吸窘迫综合征（ＡＲＤＳ）是由肺内和（或）肺外因素导致的肺部并发症，以局部或全身炎症反应失衡，导致肺部肺泡．毛细血管膜通透性增加为主要特征的肺部炎症综合征，由于病程进展迅速，且缺乏有效的治疗方法，病死率居高不下，是临床医学研究的热点和难点‘１Ｊ。传统中药光甘草定是甘草黄酮类化合物中的一种，具有抗炎、抗氧化、类雌激素样作用以及抑制酪氨酸酶活性而日益受到关注心Ｊ。丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫｓ）信号通路是细胞内调控炎症产生的主要信号转导通路，与脂多糖（ＬＰＳ）诱发的ＡＲＤＳ有密切关系旧ｏ。因此，本研究旨在通过ＬＰＳ诱导大鼠ＡＲＤＳ模型，探讨光甘草定对ＡＲＤＳ的保护作用及可能机制。材料与方法一、材料购于Ｓｉｇｍａ公司（美国）；光甘草定购于南通飞宇生物科技有限公司；大鼠肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）一ｏＬ、白细胞介素（ＩＬ）一１８购于武汉基因美生物科技有限公司；丙二醛（ＭＤＡ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和一氧化氮（ＮＯ）试剂盒购于南京建成生物工程研究所；乌司他丁（ｕＴＩ）购于广州天普洛安公司。二、方法１．实验动物分组及模型制备：按随机数字表法将大鼠分为：对照组、模型组（ＬＰＳ组）、光甘草定组（ＧＬＡ组）、乌司他丁组（ＵＴＩ组），每组８只。采用腹腔注射ＬＰＳ１０ｍｇ／ｋｇ的方法制备大鼠ＡＲＤＳ模型，对照组注射同等剂量的生理盐水，ＧＬＡ组在腹腔注射ＬＰＳ后１ｈ予以光甘草定灌胃（３０ｍｇ／ｋｇ），ＵＴＩ组在腹腔注射ＬＰＳｌ４１后１ｈ即在对侧腹腔注射ＵＴＩ２００００Ｕ／ｋｇ，于给药后１２ｈ后处死大鼠留取血及肺组织标本进行下列指标检测。２．肺湿／干重比：采用湿干重法，分别取大鼠右肺上叶称重，放入无菌无酶管，称湿重后，８０℃连续烘箱烘干７２ｈ，称干重，计算肺湿／干重比值。３．相关因子测定：取左肺上叶肺组织，用ＥＬＩＳＡ法按严格说明书步骤检测血浆ＴＮＦ一０【、ＩＬ一１８３２只Ｗｉｓｔａｒ大鼠由内蒙古大学动物实验中心提供，雄性清洁级，体质量（１８０±２０）ｇ，动物合格证号：ＳＣＸＫ（蒙）２００２－０００１，大鼠在自然光照的条件下饲养，自由进食，饮水。ＬＰＳ、抗磷酸化Ｐ３８ＭＡＰＫ抗体、抗Ｐ３８ＭＡＰＫ、抗磷酸化ＥＲＫ抗体、抗ＥＲＫ抗体万方数据史堡医堂盘查！Ｑ！！生１２旦塑旦筮！！鲞筮塑塑盟塑丛生』￡丛塑：旦！！！坐！笪２１：垫！！：Ｙ丛堑：塑！：堡含量；肺组织ＭＤＡ、ＮＯ、ＳＯＤ活性检测：采用硫代巴比妥酸比色法检测肺组织ＭＤＡ含量；采用硝基还原酶法测定肺组织Ｎ０２－和ＮＯ；浓度，以代表ＮＯ含量；采用黄嘌呤氧化酶法测定肺组织ＳＯＤ含量。４．肺组织病理学观察：取右肺下叶肺组织，以４％甲醛固定２４ｈ后，常规修块，脱水，透明，包埋，结果１．肺干湿重比（Ｗ／Ｄ）（表１）：ＬＰＳ组肺Ｗ／Ｄ比值较对照组明显增加（Ｐ＜０．０５）；ＧＬＡ和ＵＴＩ组肺Ｗ／Ｄ比值较ＬＰＳ组明显下降（Ｐ＜０．０５），但ＧＬＡ和ＵＴＩ两组间差异无统计学意义，提示光甘草定在减轻ＬＰＳ致大鼠肺水肿方面与乌司他丁有相同效果。苏木素一伊红（ＨＥ）染色，光镜下观察肺组织变化。５．免疫组化检测肺组织ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐＥＲＫ表达：所用的载玻片需预先用０．１％的多聚赖氨酸处理，切片厚度为５斗ｍ，肺组织石蜡标本常规脱蜡水化，抗原热修复１２ｍｉｎ，磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）冲洗，３％双氧水阻断内源性过氧化物酶室温３０ｒａｉｎ，ＰＢＳ２．血浆中ＴＮＦ．仪、ＩＬ．１８水平（表１）：对照组血浆中ＴＮＦ一０【和ＩＬ．１８含量较低，ＬＰＳ组大鼠血浆中ＴＮＦ．仅和ＩＬ．１８水平均较对照组显著增加（均Ｐ＜Ｏ．０５）；而光甘草定和乌司他丁均可抑制ＬＰＳ所致ＴＮＦ．０【和ＩＬ一１８增加（均Ｐ＜０．０５），但光甘草定抑制效果优于乌司他丁（Ｐ＜０．０５）。３．肺组织ＭＤＡ、ＳＯＤ和ＮＯ含量（表１）：与对照组比较，ＬＰＳ组肺组织ＭＤＡ、ＮＯ含量均明显增冲洗，羊血清工作液封闭３０ｍｉｎ，各组分别滴加１：１００兔抗大鼠ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ、ＥＲＫ蛋白激酶单克隆抗体一抗４℃过夜，分别加入生物素标记的相应的二抗，ＤＡＢ显色，阴性对照用ＰＢＳ代替一抗，光镜下观察肺组织胞质中棕黄色颗粒增多为阳性。６．Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测肺组织ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐＥＲＫ的表达：左肺下叶肺组织称重、剪碎，加入组织裂解液于４℃下匀浆，４℃１２０００加，ＳＯＤ含量明显减少（均Ｐ＜０。０５）；ＧＬＡ和ＵＴＯ组肺组织ＭＤＡ、ＮＯ均较模型组明显下降，而ＳＯＤ明显上升（均Ｐ＜０．０５）。ｇ离心１０ｒａｉｎ，吸取上４．肺组织病理学改变（图１）：光镜下观察对照组肺组织结构完整、肺泡壁无充血，肺泡腔清晰，肺间质无炎性细胞浸润；ＬＰＳ组肺泡壁弥漫性增厚、部分肺泡壁破坏，有明显的炎性细胞浸润、肺泡出血和结构破坏；ＧＬＡ组和ＵＴＩ组病理改变较ＬＰＳ组明显减轻，证实光甘草定可改善ＬＰＳ致大鼠肺损伤。５．肺组织ｐ３８ＭＡＰＫ／ＥＲＫ表达：（１）ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ清。应用考马斯亮蓝法进行蛋白定量，各组取８０¨ｇ样品蛋白行１２％烷基酸钠（ＳＤＳ）一聚丙烯酰氨凝胶电泳后，转入硝酸纤维素膜。应用２％脱脂奶粉室温封闭硝酸纤维素膜，加入以０．１％ＰＢＳ溶液按ｌ：５００稀释的ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ、ＥＲＫ抗体，４℃密封过夜。ＴＰＢＳ振荡洗膜后，应用辣根过氧化物酶标记的二抗及ＤＡＢ显色试剂盒进行检测，免疫印迹化学发光法（ＥＣＬ）显色，凝胶图像处理系统分析目标的免疫组化结果（图２）：对照组肺组织胞核中ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ阳性信号极弱。ＬＰＳ组大鼠ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ条带的吸光度（Ａ）值。三、统计学处理阳性信号表达明显增强，主要分布于浸润的炎性细胞、气道上皮细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞内，采用ＳＰＳＳ１７．０统计软件进行分析，统计数据以元±ｓ表示，多样本问比较采用单因素方差分析，两两比较用ｔ检验，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。且胞质表达无差异，胞核表达明显增强；ＧＬＡ组和ＵⅡ组肺组织ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ阳性细胞分布于ＬＰＳ组相似，但胞核阳性细胞显著减少，信号明显较ＬＰＳ组减弱。（２）ｐＥＲＫ的免疫组化结果（图３）：对照组胞质表１各组大鼠肺干湿重比、ＴＮＦ—ｄ、ＩＬ一１８、ＮＯ、ＭＤＡ、ＳＯＤ结果比较（面４－ｓ）注：与对照组比较８Ｐ＜Ｏ．０５；与ＬＰＳ组比较５Ｐ＜Ｏ．０５；与ＵＴＩ组比较。Ｐ＜０．０５。ＬＰＳ：脂多糖，Ｗ／Ｄ：湿干重比值，ＴＮＦ，ｎ：肿瘤坏死因子．ｏｃＩＬ．１８：白细胞介素一１８，ＮＯ：一氧化氮，ＭＤＡ：丙二醛，ＳＯＤ：超氧化物歧化酶万方数据・３８９６－主堡医堂盘查！！！！生！！旦！！旦筮堑鲞笠堡塑盟塑坠型』堡！ｉ塑，里！！！坐ｂ竺！！，垫！ｉ：ｙ！！：堑：盟！：塑图１光镜下观察４组大鼠肺组织病理学改变对照组（Ａ）肺组织结构完整、肺泡壁无充血，肺泡腔清晰；ＬＰＳ（脂多糖）组（Ｂ）肺泡壁弥漫性增厚、部分肺泡壁破坏，有明显的炎性细胞浸润、肺泡出血和结构破坏；ＧＬＡ（光甘草定）组和ＴＵＩ（乌司他丁）组（ｃ、Ｄ）肺泡壁增厚较ＬＰＳ组减轻，炎性细胞减少。（ＨＥ染色ｘ４００）渗≥◆◆冬簌。妻囊◆◆图２光镜下观察各组大鼠肺组织磷酸化ｐ３８ＭＡＰＫ表达（细胞核呈棕黄色染色为阳性细胞。对照组（Ａ）表达极弱，散在分布于气道上皮细胞和肺泡上皮细胞内；ＬＰＳ（脂多糖）组（Ｂ）炎性细胞、气道上皮细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞胞核内可见磷酸化ｐ３８ＭＡＰＫ阳性细胞表达；ＧＬＡ组及ｕｒｒＩ组（ｃ、Ｄ）阳性细胞表达较ＬＰＳ组明显减少。（免疫组化ｘ４００）・：ｏ，，≯≥咚。≯孵内ｐＥＲＫ表达极弱，散在分布于气道上皮细胞和肺泡上皮细胞内胞质内；ＬＰＳ组炎性细胞、气道上皮细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞胞质及胞核内均可见磷酸化ＥＲＫ阳性细胞表达；ＧＬＡ组及ＵｒＩ’Ｉ组胞质及胞核阳性细胞表达较ＬＰＳ组明显减少（图３）。（３）ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ／ｐＥＲＫ的Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹结果（图４）：ＬＰＳ组肺内ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ／ｐＥＲＫ的表达明显增加（ＬＰＳ组：ｐ－ｐ３８ＭＡＰ：０．９５３±０．０５９），ＧＬＡ组图３光镜下观察各组大鼠肺组织磷酸化ＥＲＫ表达（细胞核呈棕黄色染色为阳性细胞。对照组（Ａ）表达极弱，散在分布于气道上皮细胞和肺泡上皮细胞内胞质内；ＬＰＳ（脂多糖）组（Ｂ）炎性细胞、气道上皮细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞胞质及胞核内均可见磷酸化ＥＲＫ阳性细胞表达；ＧＬＡ（光甘草定）组及ｕｒｒＩ组（ｃ、Ｄ）阳性细胞表达较ＬＰＳ组明显减少。（免疫组化ｘ４００）０．０５３）。各组间ｐ３８ＭＡＰＫ的表达差异无统计学意义。对照组ＬＰｓ组光甘草定组乌司他丁组拿：：４３０００ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫｐ３８ＭＡＰＫ４３０００能明显抑制ＬＰＳ诱导的ｐ３８ＭＡＰＫ的磷酸化（ＧＬＡ组Ｐ．ｐ３８ＭＡＰＫ：０．６９３±０．０３１），且其抑制作用较ＵｒｒＩ组强（Ｕ１１组：ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ：０．８１６±０．０３６）。ＬＰＳ组ＥＲＫ及ｐＥＲＫ表达均增强（ＬＰＳ组：ｐＥＲＫ：ｐＥＲＫｌ／２１———●—ｒ，＿ｒ一４４４２４４４２０００００００００００００．８０１±０．０７３），ＧＬＡ组能明显抑制ＬＰＳ诱导的ＥＲＫ及其磷酸化（ＧＬＡ组：ｐ－ＥＲＫ：０．７２１土０．０６９），但其抑制作用较ｕＴＩ略弱（ｕⅡ组：ｐ－ＥＲＫ万方数据０．６０３±Ｗｅｓｔｅｍ印迹为蛋白质免疫印迹试验，ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ为磷酸化ｐ３８ＭＡＰＫ，ｐＥＲＫｌ／２为磷酸化的ＥＲＫｌ／２圈４Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测各组大鼠肺组织ｐ—ｐ３８ＭＡＰＫ及ｐＥＲＫｌ／２的蛋白表达史堡匿堂盘查！！！！生！！旦！！旦筮堑鲞筮堡塑盟型！丛盟』垦！ｉ塑：望！！！坐！笪！！：！Ｑ！！：！！！：墅：盟！：堡讨论本研究结果提示：光甘草定可减轻ＬＰＳ所致大鼠肺损伤，表现为与ＬＰＳ组比较ＧＬＡ组肺组织病理改变减轻，肺Ｗ／Ｄ比值下降，血浆中ＴＮＦ－ｄ、ＩＬ一１８及肺匀浆中ＮＯ含量减少。有研究发现，在体内光甘草定（１～１０ｍｇ／ｋｇ）通过减少各种炎性介质的产生而保护潮霉素抗性转基因ＢＤＦｌ小鼠对抗ＬＰＳ诱导的脓毒症ＨＪ。甘草总黄酮能通过抑制炎性细胞浸润和炎症介质释放减少中性粒细胞募集，有效对抗ＬＰＳ诱发的肺炎Ｍ…。因此本研究结果与既往研究结果一致，光甘草定可通过抑制炎症介质而缓解ＬＰＳ导致的肺损伤ｏ７Ｉ。杨晓露等。８ｏ研究表明，甘草总黄酮的抗炎机制主要在于抑制ＥＲＫ／ＭＡＰＫ通路中的ＥＲＫ的磷酸化水平，从而发挥下调ｉＮＯＳ及ＣＯＸ．２的基因和蛋白表达的作用。本研究结果显示光甘草定能减轻ＬＰＳ所致损伤肺组织中ｐ３８ＭＡＰＫ及ＥＲＫ的磷酸化。证实光甘草定对ｐ３８ＭＡＰＫ及ＥＲＫ信号通路均有抑制作用，与既往研究结果有差异。有研究表明ＬＰＳ可以刺激大鼠肺组织ｉＮＯＳ表达一１和ＮＯ的过度释放导致肺组织的直接损伤被认为是ＡＬＩ的发病机制之一，Ｙｅｈｕｄａ等ｕ叫研究提示光甘草定可引起ＬＰＳ诱导ｉＮＯＳｍＲＮＡ表达降低４８％，本研究结果显示在ＬＰＳ组肺匀浆中ＮＯ含量较对照组明显增高，而光甘草定组含量明显下降，肺组织病理改变也同样减轻，证实光甘草定可减轻过度的ＮＯ释放，降低ＮＯ直接导致的肺组织损伤，但具体机制有待进一步研究。Ｙｕ等’１ｕ研究发现光甘草定可明显降低脑内ＭＤＡ浓度和增强内源性抗氧化剂ＳＯＤ等活性，显著减轻脑损伤程度。Ｙｏｋｏｔａ等‘１２‘研究发现，光甘草定在０．３３３～３３．３恤∥ＩＩｌｌ的浓度就可以抑制超氧阴离子的产生。Ｙｅｈｕｄａ等¨引研究证实光甘草定具有强化抗氧化防御机制的潜力。本研究结果显示：光甘草定干预后肺匀浆中ＭＤＡ含量明显降低，而ＳＯＤ含量增高明显，且光甘草定组肺组织的病理改变较ＬＰＳ组减轻，与既往研究结果一致。总之，光甘草定对ＬＰＳ所致的大鼠ＡＲＤＳ具有保护作用，可能与以下机制有关：（１）光甘草定能抑制ｐ３８ＭＡＰＫ及ＥＲＫ信号转导途径激活从而抑制炎症反应而发挥保护作用。（２）光甘草定能通过抗氧化作用，清除氧自由基而减轻肺组织损伤。光甘草万方数据定的最佳治疗剂量、作用持续时间和其抗氧化、抗炎作用机制仍有待深入研究。参考文献［１］乔良，刘志．按柏林新标准分析急诊脓毒症患者发生急性呼吸窘迫综合征的危险因素［Ｊ］．中华危重病急救医学，２０１５，２７（７）：５５８．５６２．ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５－４３５２．２０１５．０７．００４．『２１赵焱张利鹏．光甘草定生物学活性研究进展［Ｊ］．国际中医中药杂志，２０１５，３７（９）：８６０－８６４．ＯＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｕ．１６７３－４２４６．２０１５．０９．０３１．『３］孟莹，余常辉，李婷，等．Ｔｏｌｌ样受体４在烟熏和脂多糖联合烟熏所致肺损伤大鼠中的表达及意义［Ｊ］．中华医学杂志，２０１３，９３（２８）：２２３０－２２３４．ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．Ｊ．ｉｓｓｎ．０３７６－２４９１．２０１３．２８．０１５，ｆ４］ＦｉｓｈｅｒＢＪ，ＳｅｒｏｐｉａｎＩＭ，ＫｒａｓｋａｕｓｋａｓＤ，ｅｔａ１．ＡｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄａｔｔｅｎｕａｔｅｓＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｎｄｕｃｅｄａｃｕｔｅｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ２０１１．３９（６）：１４５４—１４６０．ＤＯＩ：１０．１０９７／ＣＣＭ，０ｂ０１３ｅ３１８２１２０ｃｂ８．’５］Ｋａｎｇｊｓ，ＹｏｏｎＹＤ，ＣｈｏＩＪ，ｅｔａ１．Ｇｌａｂｒｉｄｉｎ，ａｎｉｓｏｎａｖａｉｌｆｒｏｍｌｉｃｏｒｉｃｅｒｏｏｔ，ｉｎｈｉｂｉｔｓｉｎｄｕｃｉｂｌｅｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｓｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｍｉｃｅｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｏｄｅｌｏｆｓｅｐｔｉｃｓｈｏｃｋ［Ｊ］．ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＥｘｐＴｈｅｒ，２００５，３１２（３）：１１８７—１１９４．ＤＯＩ：１０．１１２４／ｊｐｅｔ．１０４．０７７１０７．『６］ＸｉｅＹＣ，ＤｏｎｇＸＷ。ＷｕＸＭ．ＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｌｉｃｏｒｉｃｅＯＮｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｅｃｈａｒｉｄｅ—ｉｎｄｕｃｅｄａｃｕｔｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅｆＪ】．ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｅｏｌ，２００９，９（２）：１９４－２００．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｉｎｔｉｍｐ．２００８．１１．００４，Ｅｐｕｂ２００８Ｄｅｃ９．［７］管燕，谢强敏．甘草黄酮对肺部炎症小鼠细胞因子表达和氧化反应的调节作用［Ｊ］．中草药，２００９，０８：１２５４．１２５９．ＤＯＩ：１０．３３２１／ｉ．ｉｓｓｎ：０２５３．２６７０．２００９．０８．０２７．［８］杨晓露，刘朵，卞卡，等．甘草总黄酮及其成分体外抗炎活性及机制研究［Ｊ］，中国中药杂志，２０１３，３８（１）：９９—１０４．ＤＯＩ：０．４２６８／ｃｊｃｍｍ２０１３０１２０．［９］穆恩，丁仁或，安欣，等．肝素通过抑制一氧化氮合酶和转化生长因子一１３／Ｓｍａｄ信号转导途径减轻脂多糖致大鼠急性肺损伤［Ｊ］．中华危重病急救医学，２０１４，２６（１１）：８１０－８１４．ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｉ．ｉｓｓｎ．２０９５－４３５２．２０１４．１１．００９．『ｌＯ］ＹｅｈｕｄａＩ，ＭａｄａｒＺ，Ｌｅｉｋｉｎ—ＦｒｅｎｋｅｌＡ，ｅｔａ１．Ｇ１ａｂｒｉｄｉｎ，ａｎｉｓｏｎａｖａｎｆｒｏｍｌｉｃｏｒｉｃｅｒｏｏｔ．ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓｉＮＯＳｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖｉｔｙｕｎｄｅｒｈｉｇｈ—ｇｌｕｃｏｓｅｓｔｒｅｓｓａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ『Ｊ］．ＭｏｌＮｕｔｒＦｏｏｄＲｅｓ，２０１５，５９（６）：１０４１－１０５２．ＤＯＩ：１０．１００２／ｍｎｆｒ．２０１４００８７６．Ｅｐｕｂ２０１５Ｍａｙ３．［１１］ＹｕＸＱ，ＸｕｅＣＣ，ＺｈｏｕＺＷ，ｅｔａ１．Ｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｇｌａｂｒｉｄｉｎ。ａｍａｊｏｒａｃｔｉｖｅｉｓｏｆｌａｖａｎｆｒｏｍＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｓｌｕｒ．（１ｉｃｏｒｉｃｅ）［Ｊ］．ＬｉｆｅＳｃｉ，２００８，８２（２）：６８－７８．ＤＯｔ：１０．１０１６／ｊ．１ｆｓ．２００７．１０．０１９．『１２］ＹｏｋｏｔａＴ，ＮｉｓｈｉｏＨ。ＫｕｂｏｔａＹ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆｇｌａｂｒｉｄｉｎｆｒｏｍｌｉｃｏｒｉｃｅｅｘｔｒａｃｔｓｏｎｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ［Ｊ］＋ＰｉｇｍｅｎｔＣｅｌｌＲｅｓ，１９９８，１１（６）：３５５－３６１．ＤＯＩ：１０．１１１１／ｊ．１６００－０７４９．１９９８．ｔｂ００４９４．ｘ．１３］ＹｅｈｕｄａＩ，ＭａｄａｒＺ，Ｓｚｕｃｈｍａｎ．ＳａｐｉｒＡ，ｅｔａ１．Ｇｌａｂｆｉｄｉｎ，ａｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｆｒｏｍｌｉｅｏｒｉｃｅｒｏｏｔ，ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｓｍａｎｇａｎｅｓｅｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ．ｃａｔａｌａｓｅａｎｄｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ２ｕｎｄｅｒｇｌｕｃｏｓｅｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．ＰｈｙｔｏｔｈｅｒＲｅｓ，２０１ｌ，２５（５）：６５９－６６７．ＤＯＩ：１０．１００２／ｐｔｒ．３３１８．（收稿日期：２０１６－０９－１９）（本文编辑：陈新石）