摘 要
酿酒酵母是一种传统的乙醇生产微生物，通常用于乙醇燃料生产和酿造业，但过量的乙醇会抑制细胞的生长和活性，对酵母细胞产生毒害作用。ROS（Reactive Oxygen Species）是一类性质活泼的小分子化合物，在多种逆境胁迫中期起重要作用，但是否在乙醇胁迫中起重要作用尚无定论。
为了解ROS在乙醇胁迫中的作用及机制，本文以酿酒酵母为材料，检测了乙醇
-胁迫对酵母细胞超氧阴离子（O2·）含量、过氧化氢（H2O2）含量、酵母细胞生长
状况、膜完整性、线粒体膜电位以及脂质和蛋白质损伤的影响。
实验结果表明，乙醇可以抑制对数生长期酵母的生长，导致膜完整性受损、
-线粒体膜电位降低、O2· 和H2O2水平增加、脂质过氧化物MDA含量增加。加入
外源还原型谷胱甘肽（GSH），蛋氨酸（Met），N-acetylcysteine（N-乙酰半胱氨酸，
-NAC）后，可以提高酿酒酵母细胞存活率及膜完整性，线粒体膜电位、降低O2· 和
H2O2水平。添加GSH，Met，NAC到发酵培养基中，检测发酵后乙醇含量发现，正常组为7.3%，Met，NAC可以将乙醇产率分别提高到8.62%和8.56%，而GSH
-只有6.35%。以上结果表明乙醇能够诱导O2· 和H2O2等ROS的产生，导致氧化胁
迫，从而造成酵母细胞发生膜质过氧化，生长受到抑制。而GSH，Met，NAC可以清除过量的ROS，降低乙醇胁迫引起的酵母损伤，其中Met和NAC虽然可以提高乙醇产率，但是只有NAC处理在统计学上具有差异性。
为进一步研究ROS变化的机制，采用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂雷帕霉
-素(rapamycin)处理乙醇胁迫条件下的酵母细胞，检测对O2· 和H2O2水平，菌落形-态以及膜完整性的影响。结果表明，3MA可以有效降低O2· 和H2O2水平，降低乙
醇对酵母菌落的抑制，提高膜完整性，而雷帕霉素进一步加剧对菌落的抑制，降低
-膜完整性，提高O2· 和H2O2水平。表明自噬是影响ROS水平的机制之一，它通过
调节ROS参与酿酒酵母乙醇胁迫损伤。
关键词：酿酒酵母；乙醇胁迫；自噬；ROS
I
Abstract
Saccharomyces cerevisiae is a strain used to produce ethanol and is applied in the production of ethanol fuel and brewing industry.Saccharomyces cerevisiae is a tranditional yield ethanol strain, but is sensitive to the high concent of ethanol. Excessive accumulation of enthanol could inhibit the growth and activity of cells, induce reactive oxygen species，thereby lead to a damage to yeast cells. Autophagy is an important degradation pathway for maintaining the balance and matter cycle in eukaryotic cells. Although we have a certain amiynt research on ethanol stress, the mechanism of ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae, which ROS plays a leading role under ethanol stress, whether autophagy is involved in ethanol strees and what role autophagy has in ethanol. The above problems are not yet clear.
To understand which ROS has an important role in ethanol stress, Saccharomyces cerevisiae from Angel Yeast was as the experimental material in this work, we studied the effect of reactive oxygen species (ROS) on Saccharomyces cerevisiae growth and fermentation under ethanol stress, through detecting physiological indicatiors including
-cell growth, the membrane integrity, superoxide anion(O2·) conctent, hydrogen peroxide
(H2O2)content, malondialdehyde(MDA), carbonyl content and so on. The result showed that ethanol could inhibit the growth of yeast cells in the logarithmic phase, damage the
-membrance integrity, rise the levels of O2· and H2O2 , increase the content of MDA (the
product of Lipid peroxide). We used exogenous Glutathione (GSH), Methionine (Met) and N-acetylcysteine (NAC) treated ethanol stressed Sacchayomycescerevisiae
-respectively, and found that they could reduced the level O2· and H2O2, increased cells
activity and decreased the concent of MDA. This indicates tha ethanol couldinduce the
-generation of O2· and H2O2, leding to the oxidative stress, resulting in the damage to
yeast cells. When the growth inhibited serious, ethanol even could lead to the death. GSH and Met, NAC could clear the excess of ROS, reduce the yeast damage caused by ethanol stress and improve the ethanol yield.
In order to understand whether autophagy was involved in the ethanol stress in the S. cerevisiae as well as it was related with ROS, we used 3-MA (autophagy inhibitor) and rapamycin (autophagy inducer) to treat ethanol-stressed Saccharomyces cerevisiae,
I
-the membrane integrity was by PI staining, the level of O2· and H2O2 was detected by
ROS fluorescent probe DHE and DCFH-DA staining. The results showed that 3-MA could reduce the inhibition of ethanol on yeast cells, improve the membane integrity,
-reduce the levels of O2· and H2O2. But rapamycin could further deepen the colony -inhibition, reduce the membrane integrity, improve the levels of O2· and H2O2. This
indicates that autophagy involves in Saccharomyces cerevisiae ethanol stress by regulating the level of ROS, and plays a role of maintaining cell survival in ethanol-stressed Saccharomyces cerevisiae.
Key words: Saccharomyces cerevisiae；ethanol stress；autophagy；ROS
II
缩略词
英文缩写 BSA Cvt DAB DCFH-DA DHE DMSO DNPH EDTA GSH Met 3-MA NAC NBT
-O2·
英文全称
Bovine serum albumin Cytoplasm to vacuole targeting
3, 3´-Diaminobenzidine,tetrahydrochloride 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate Dihydroethidium Dimethyl sulfoxide 2,4-Dinitrophenylhydrazine Ethylenediamine tetracetic acid Glutathione Methionine 3-Methyladenine N-acetylcysteine Nitroblue tetrazolium Superoxide anion
The phagophore assembly site Phosphate buffer solution Phenmethyl sulfonyl chlorine Reactive oxygen species Rounds per minute S-Adenosylmethionine, Sodium dodecyl sulfate 2-Thiobarbituric acid Trichloroacetic acid
2-AminoAmino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanedi
ol
Triton-X-100
中文名称
牛血清白蛋白 细胞质到液泡途径 3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐
2’，7’-二氯荧光素二脂 二氢溴化非啶 二甲基亚砜 2,4-二硝基苯肼 乙二胺四乙酸 谷胱甘肽 蛋氨酸 3-甲基腺嘌呤 N-乙酰半胱氨酸 氯化硝基四氮唑蓝 超氧阴离子 自噬体组装位点 磷酸缓冲液 苯甲基磺酰氯 活性氧 每分钟转速 腺苷蛋氨酸 十二烷基硫酸钠 硫代巴比妥酸 三氯乙酸 三羟甲基氨基甲烷 曲拉通100
PAS PBS PMSF ROS rpm SAM SDS TBA TCA Tris Triton-X-100
III
IV
目录
第一章 前 言 ................................................................................................................... 1 1.1 乙醇对酵母的影响 .................................................................................................... 1 1.1.1乙醇对酵母的毒害作用 .......................................................................................... 1 1.2 活性氧 ........................................................................................................................ 2 1.2.1 活性氧的危害 ......................................................................................................... 3 1.2.2常见抗氧化剂ROS防御系统 ................................................................................ 4 1.3 自噬 ............................................................................................................................ 6 1.4研究内容及目的、意义 ............................................................................................. 7 第二章 材料与方法 ......................................................................................................... 8 2.1 实验材料、仪器和试剂 ............................................................................................ 8 2.2实验主要试剂 ............................................................................................................. 9 2.2.1 实验所用培养基配方 ............................................................................................. 9 2.2.2 蛋白含量测定试剂配方 ....................................................................................... 10 2.2.3荧光试剂配制 ........................................................................................................ 10 2.2.4自噬相关试剂配制 ................................................................................................. 11 2.3 实验方法 ................................................................................................................... 11 2.3.1 生长情况检测 ........................................................................................................ 11 2.3.2 粗裂解酶液的制备 ............................................................................................... 12 2.3.3 点菌落实验 ........................................................................................................... 12 2.3.4总蛋白含量测定 .................................................................................................... 12 2.3.5 存活率测定 ........................................................................................................... 13 2.3.6 酒精含量测定 ....................................................................................................... 13 2.3.7膜完整性测定 ........................................................................................................ 14 2.3.8 H2O2含量测定 ....................................................................................................... 14
-2.3.9 O2·含量测定（DHE法） ..................................................................................... 15
2.3.10 O2·-含量测定（NBT法） ................................................................................... 15 2.3.11膜脂过氧化水平测定 .......................................................................................... 15
V
2.3.12线粒体膜电位检测………………………………………………………………15 第三章 结果与分析 ....................................................................................................... 17 3.1 乙醇对酿酒酵母生长发育的影响 .......................................................................... 17 3.2乙醇胁迫对酿酒酵母细胞膜完整性的影响 ........................................................... 18 3.3 GSH、Met和NAC对乙醇胁迫酿酒酵母的影响 ................................................. 19 3.3.1对乙醇胁迫酿酒菌落形态的影响 ........................................................................ 19 3.3.2对乙醇胁迫酿酒酵母细胞膜完整性的影响 ........................................................ 20 3.3.3对乙醇胁迫酿酒酵母线粒体膜电位的影响 ................................................................. 22 3.3.4对乙醇胁迫酿酒酵母中ROS的影响 .................................................................. 24 3.3.5对乙醇胁迫酿酒酵母中MDA含量的影响 ......................................................... 28 3.3.6对乙醇胁迫酿酒酵母中乙醇产率的影响………………………………………..28 3.4自噬在乙醇胁迫中的作用 ..................................................................................................... 29 3.4.1自噬对酵母菌落形态的影响……………………………………………………..29 3.4.2自噬对膜完整性的影响 ........................................................................................ 32 3.4.3自噬对ROS的影响 .............................................................................................. 33 3.5 讨论 .......................................................................................................................... 35 3.5.1 ROS增加是乙醇胁迫抑制酿酒酵母生长的主要原因 ....................................... 35 3.5.2 Met可以恢复乙醇对酿酒酵母的损伤 ................................................................. 36 3.5.3 自噬通过减少ROS降低乙醇胁迫损伤 ............................................................. 36 第四章 结论 ................................................................................................................... 37 参考文献 ......................................................................................................................... 38 致谢 ................................................................................................................................. 41 个人简历 ......................................................................................... 错误！未定义书签。
VI
活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
第一章 前 言
1.1 乙醇对酵母的影响
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种重要的工业微生物，由于其在发酵工业中的广泛应用，导致国内外很多学者将其对环境胁迫因素的反应作为研究重点[1]，而提高酿酒酵母对环境胁迫因素的耐受性对食品，酿酒等工业的生产具有重要的实际意义。近年来，以燃料乙醇为代表的生物能源生产受到全球的关注，其中燃料乙醇作为可再生的情节能源，已经率先实现了大规模的工业化生产和应用。而乙醇是酵母菌发酵糖的重要产物之一，虽然酵母具有较高的乙醇耐受力和乙醇产率，但是当乙醇在培养基中的浓度超过一定值时，就会对酵母细胞生长和乙醇发酵具有强烈的抑制作用，严重时甚至导致细胞死亡。在发酵过程中，使用酿酒酵母酿酒或者生产燃料乙醇，都会涉及到乙醇的积累对酵母细胞的毒害作用，从而使得乙醇的产量受到限制[2]。
酵母菌对乙醇的耐受性受多种基因的共同调控，这与乙醇能对酵母造成多方面的损伤及毒害作用相一致。为了鉴别与乙醇耐受性相关的基因，通过观察在含有不同浓度乙醇培养基上的酵母菌单基因突变体的生长发现了137个与乙醇耐性相关的基因[3]，而Auesukaree C等人通过对4828株酵母缺陷型菌株进行全基因筛选，发现与乙醇耐性相关的基因数目为95个[4]，虽然两个实验组得到的数据不同，所揭示的基因在两个报道中也是不完全一致，但是通过对缺失基因分类后发现，大部分基因都涉及到了对液泡 H+-ATPase (V-ATPase)，细胞骨架合成和细胞壁完整性等功能的可能。最近的研究结果除了肯定以往的结果以外，还发现了一些新的与酵母细胞的乙醇耐性相关的机制。
1.1.1乙醇对酵母的毒害作用
细胞膜 酵母菌的细胞膜是乙醇胁迫时攻击的主要目标，乙醇通过增加质膜的流动性从而对正常的膜结构造成损伤。而酵母细胞可以改变膜的组成来减少膜的流动性，使质膜处于稳定状态。这说明质膜的流动性和完整性在乙醇胁迫条件下对细胞有很重要的保护作用[5-6]。早期的实验发现BEM2，PAT2，ROM2，VSP34 和ADA2的基因缺失突
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河南工业大学硕士学位论文
变体对乙醇和白色荧光染料都非常敏感。通过筛选酿酒酵母二倍体纯合子的缺失突变体库，发现单基因缺失的突变体ΔURA7和 ΔGAL6在含8% (V/V)乙醇的培养基中的生长速度明显高于野生型。URA7 编码 CTP 合成酶，主要负责磷脂的生物合成及嘧啶的从头合成。GAL6 编码氨基肽酶，属于半胱氨酸蛋白酶家族。这2种缺失突变体均对细胞壁溶解酶(β-1,3-葡聚糖酶)的抗性增强，说明了细胞壁的完整性与其乙醇耐性相关。推测有可能是ΔGAL6 中的热击蛋白基因 HSP12 和 HSP26 转录水平提高，导致了该突变体乙醇耐性的提高，而ΔURA7 的乙醇耐性提高则有可能与URA7 参与磷脂的合成有关[7]。
脂肪酸 大量实验表明，在乙醇胁迫作用下，细胞内的脂质成分发生了改变，单不饱和脂肪酸的含量明显提高。酵母的去饱和酶基因OLE1编码的是位于质膜上的去饱和酶，它可以通过氧化作用和依赖NADH的去饱和过程催化酵母中的棕榈酸(C16:0) 和硬脂酸 (C18:0)变为单不饱和脂肪酸棕榈油酸（Δ9Z-C16:1），油酸（Δ9Z-C18:1）。You等将昆虫的膜去饱和酶基因TniNPVE插入OLE1基因突变体的基因组中。发现表达昆虫去饱和酶基因的转化子乙醇耐性最强，这个转化子在不含乙醇的YPD液体培养基中培养至对数后期时油酸产量是棕榈酸的2倍，在含有5% (V/V)乙醇的YPD液体培养基中油酸和棕榈酸产量的比例提高了4倍，这些结果表明油酸在乙醇耐性中具有重要的作用[8]。为了探明不饱和脂肪酸各种组成在乙醇胁迫中的作用，分别将使ScOLE1(酿酒酵母∆9脂肪酸脱氢酶基因)，CaFAD2 (白假丝酵母∆12脂肪酸脱氢酶基因)，和CaFAD3 (白假丝酵母ω3脂肪酸脱氢酶基因)基因在酵母中过表达。结果发现，与正常菌株相比，ScOLE1过表达提高了总不饱和脂肪酸的含量和对乙醇的耐性，而过表达CaFAD2和 CaFAD3的菌株只是分别生成了亚油酸（18:2）和α-亚油酸（18:3)，而不饱和脂肪酸总量和乙醇耐性都没有明显改变。这表明可能是总不饱和酸的含量而非不饱和程度在乙醇胁迫中起重要作用[9]。
1.2 活性氧
活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)是指活泼的氧自由基与具有氧自由基反
-应特性的其它含氧物质的总称，包括O2·、HO2·、·OH、H2O2、1O2、LO·、LOO·和LOOH，
具有比氧更活泼的化学性质。好氧性微生物把氧气作为电子传递链中的的电子受体[10]。从电子呼吸链中泄露的电子，大概有5%会生成超氧和过氧化氢等活性氧[11-12]。
2
活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
1.2.1 活性氧的危害
在正常情况下，低水平的ROS是细胞行使生物学功能所必需的，因为ROS可参与细胞内许多重要途径的信号转导调控。但在某些特殊的情况下，比如细胞自身氧化还原代谢紊乱或外界离子辐射等原因就会造成细胞内ROS的大量积聚，这种超过了细胞抗氧化防御缓冲能力的ROS可以攻击蛋白质、脂质及DNA等细胞组分而造成生物大分子的损伤，进而影响细胞的功能甚至造成细胞死亡[13-15]。
任何有机生物体的组织在水匮乏时都能存活下来一段时间，对亲水性蛋白缺失菌株进行筛选时发现，STF2在维持细胞存活方面有重要作用[16]。进一步研究发现STF2基因缺失促进了ROS的积累，导致细胞凋亡。过表达STF2可以减少氧化应激后ROS的积累，表明STF2p通过降低活性氧积累提高了细胞在脱水胁迫下的存活率。
蛋白质损伤[17] 在ROS产生的部位附近的氨基酸残基、肽链、蛋白质、酶是ROS首先攻击的目标。活性氧通过对蛋白质的氧化修饰使得蛋白质构象改变，肽链断裂、聚合或交联，从而引起蛋白质功能丧失，酶和受体的功能下降，正常的生理活动受到影响。蛋白质侧链氨基酸的氧化是生命系统的一个重要信号，其侧链羰基的形成是蛋白质受到损伤的一个标志[18]。
脂质损伤 脂质过氧化作用（Lipid Peroxidation）是自由基生物学的一个分支，是指脂类多不饱和脂肪酸（PUFA）与自由基反应，形成中间体自由基，再与分子氧化反应形成脂质过氧化自由基，引起酸败作用。生物膜还有较多的多不饱和脂肪酸，由于不饱和脂肪酸双键电子云密度大，化学性质很不稳定，容易发生脂质过氧化，从而导致膜功能和结构的损伤[19]。
DNA损伤 核酸同样易受ROS攻击，ROS能使DNA双链断裂和单链断裂，使DNA的碱基变成自由基，并生成稳定化合物，对核酸造成氧化性损伤。羟自由基和单线氧可以直接攻击DNA，而超氧阴离子和过氧化氢是通过产生羟自由基对DNA造成损伤的
[20-21]
。
检测DNA单链或双链断裂（DNA single or double breaks, SSBs and DSBs, respectively）的程度是目前检测DNA损伤水平的主要方法[22]。研究已经表明，氧化损伤是引起DNA损伤的一个主要原因，在一定程度上被认为是造成SSBs and DSBs的前提因素[23]。在正常条件下，Yap1通过与核外运受体Crm1构成了核外运蛋白，主要存在
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河南工业大学硕士学位论文
于细胞质中。为了探明Yap1在 DNA损伤中的作用，Lori A. Rowe 等人[24]通过添加DNA损伤试剂MMS和UV-C（这两种试剂可以产生不同的DNA损伤且都不直接引起ROS的产生）发现，MMS处理使Yap1聚集于细胞核内，但是UV-C没有出现类似现象，检测ROS水平发现，MMS中的ROS水平高于UV-C结果表明DNA损伤通过诱导ROS造成Yap1在核内积累，而Yap1在核内的积累会上调参与BER和ROS清除途径的基因，从而激活DNA修复，预防对DNA的进一步伤害，维持细胞基因组稳定。
1.2.2常见抗氧化剂ROS防御系统
当酵母细胞从厌氧呼吸转换到有氧呼吸，或是暴露在H2O2以及低浓度氧化性药物中时，就会全面启动氧化防御系统，来保护胞内组分从而维持其氧化还原状态。ROS防御系统主要分为非酶类和酶类两种。 1.2.2.1非酶防御系统
酵母细胞中的非酶防御系统主要包括像蛋白质、氨基酸衍生物、维生素、脂肪酸、糖类和起缓冲平衡调节作用的离子等的一些小分子，它们可以从溶液中直接清除氧化产物。
谷胱甘肽(glutathione, GSH)是酵母细胞中最丰富最重要的抗氧化剂分子，它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三种构成的一种含有巯基的生物活性肽，在体内主要以还原态的GSH和氧化态的GSSG两种形态存在。其中GSH存在于所有生物细胞中，是机体内重要的活性物质。具有多种生理功能，主要体现在：清除自由基，保护细胞；参与氨基酸转运；解除外源性物质的毒性；参与转甲基反应，维持肝细胞正常功能；维持D N A 的生物合成，细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能等。
N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine，NAC）是细胞内还原性谷胱甘肽的前体，是一种含有巯基的抗氧化剂。它可以通过增加GSH含量间接发挥重要的生理功能，主要体现在：抗氧化作用；减少NO的生成；抑制炎症因子的表达；保护DNA，减轻DNA损伤，抑制NDA修复相关的突变；抑制细胞凋亡等。
甲硫氨酸（Met），又名蛋氨酸，以腺苷蛋氨酸（S-Adenosylmethionine, SAM）活性形式广泛存在于动物、植物和微生物体内。主要功能是参与蛋白质的合成。在生物体内Met先从ATP接受腺苷变成SAM，再进行甲基转移。如果Met缺乏就会导致体内蛋白质合成受阻，造成机体损害。体内氧自由基造成的膜脂质过度氧化是导致机体多种损害
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活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
的原因。脂质过氧化会损害初级和次级溶酶体膜，是溶酶体内含有的作为水解的酸性磷酸酶释放出来，对细胞核线粒体膜等重要的细胞器造成损害，甲硫氨酸通过多种途径抗击这些损伤。 1.2.2.2酶防御系统
酿酒酵母中重要的抗氧化系统
Important antioxidant defence systems in Saccharamyces cerevislae
酵母在适应周围的恶劣环境的过程中，已经进化出一套抗氧化防御酶系。酶防御系统不仅可以直接清除进入细胞内的各种氧化剂，修复受损的蛋白质和核酸，还可以维持
-非酶防御体系里起主要作用的抗氧化分子的防御水平。O2·是所有氧自由基中的第一个
生成的自由基，在超氧化物歧化酶的催化作用下，可以被还原为H2O2。而H2O2又在过氧化氢酶和过氧化物酶的作用下得以清除。硫氧还蛋白过氧化物酶/硫氧还蛋白还原酶系可以将H2O2还原或烷基化，谷胱甘肽还原酶/谷胱甘肽氧化物酶系可以还原氧化态的谷
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胱甘肽，从而维持细胞内的GSH/GSSG的比率。硫氧甲硫氨酸还原酶通过修复氧化的Met残基来保护蛋白质活性位点，脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶能够修复突变的DNA。所有这些不同形式的酶体都参与了细胞抗氧化攻击。
1.3 自噬
自噬是真核细胞中高度保守的一个大分子降解途径，最早由Ashford等人于1962年在研究酵母时发现存在―自己吃自己‖现象后提出，随着对自噬研究的进一步深入，人们发现自噬在维持细胞代谢平衡和物质循环以及压力胁迫中都起着至关重要的作用[24]。
细胞自噬现象自二十世纪六十年代初就已发现[26]，但是其引起人们的重视却是在一二十年前。其大体过程是，在刺激作用下细胞生成的双成膜结构包裹住受损蛋白或细胞器形成自噬小体，自噬小体进一步与液泡（酵母和植物）或溶酶体（动物）融合成为自噬溶酶体，随后内容物被降解[25-26]。自噬可以是非选择的，也可以是选择性的。酵母中的选择性细胞自噬主要有Cvt (Cytoplasm to vacuole targeting)途径、线粒体自噬(Mitophagy)、过氧化物酶体自噬(Pexophagy)等三种途径。
Cvt途径。Cvt途径是目前研究的最透彻的选择性自噬，也是已知的唯一一个利用自噬机制为核心的生物合成途径。其主要功能是将α甘露糖苷酶(Ams1)和氨肽酶(Ape1)等两种水解酶的前体定向转移至液泡中。作为酶原，Ape1以没有活性的前体PrApe1存在于细胞质中。Cvt途径在自噬体组装位点（PAS，Pre-autophagygosomal structure/the phagophore assembly site）将捕获的Ape1 前体包裹进Cvt囊泡中，PrApe1首先与其受体Atg19（也叫Cvt19）结合，接着Atg11通过与Atg19 C末端结合，引导Cvt复合物定位到PAS位点。Atg19进而与Atg8-PE相互作用，促进特化的自噬体-Cvt囊泡的形成。
线粒体自噬。线粒体作为细胞新陈代谢的主要细胞器，不仅是能量的提供者还是细胞内ROS主要来源。维持其正常功能对细胞有极其重要的作用。而线粒体自噬是调节线粒体数量和质量的主要途径。利用全基因组筛选线粒体自噬基因缺失突变体，Tomotake Kanki等人发现Atg32是线粒体自噬的关键蛋白（但不是自噬和其他选择自噬的关键蛋白）。位于线粒体外膜上的Atg32可以作为受体与Atg11结合[27]。而在Cvt途径中，Atg32被 prApe1、Ams1和Atg19的复合物所代替与Atg11结合，定位于PAS( the perivacuolar phagophore assembly site)，之后再与Atg8-PE相互作用。
过氧化物酶体自噬。过氧化物酶体负责脂类代谢与细胞内过氧化物的降解，其生成
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活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
与降解受到严格的调控。研究过氧化物酶体自噬最常用的模式生物是生有大量过氧化物酶体的酵母——Pichia pastoris与Hansenula Polymorpha[28]。同其他两种选择性自噬一样，过氧化物酶体自噬也需要Atg11的参与。Pex14是其发生的标志性蛋白[29]。
1.4研究内容及目的、意义
(1) 以往研究表明，乙醇导致的细胞损伤有可能是过量的ROS产生的氧化胁迫所致。但是ROS是否参与了乙醇胁迫以及具体为哪种活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中起作用并不清楚。本实验通过，通过检测酵母细胞生长状况，膜完整性，使用荧光探针DHE
-和DCFH-DA，特异性地检测了O2·和H2O2的水平以及检测了丙二醛（MDA）含量，
乙醇产量等生理指标，研究了乙醇胁迫条件下，活性氧（ROS）在酿酒酵母菌生长和发酵过程中的作用以及GSH、Met和NAC对乙醇胁迫的恢复作用。
(2) 自噬在细胞存活和物质平衡方面起着重要作用，为了探明自噬是否参与了酿酒酵母乙醇胁迫，以及自噬在乙醇胁迫中起了什么作用，在乙醇胁迫中，自噬和ROS之间是否有联系，这些问题都值得深入探讨。本文以乙醇胁迫下的酿酒酵母为实验材料，分别添加自噬抑制剂和诱导剂，通过点菌落实验分析研究了自噬在乙醇胁迫中的作用。
-乙醇胁迫条件下，通过测定膜完整性，O2·和H2O2的水平的变化，分析乙醇胁迫下，自
噬和ROS之间的关系。
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第二章 材料与方法
2.1 实验材料、仪器和试剂
（1）菌种
本实验室从安琪酵母粉中提取的酿酒酵母菌 （2）主要仪器设备 见表2.1。
表2.1 主要仪器设备
名称 型号 产地 电子天平 岛津AY120，日本 高速冷冻离心机 艾本德5804R， 德国
紫外可见分光光度计 UV-1600，上海美谱达仪器公司 冷冻离心机 GL-16A，上海菲恰尔分析仪器有限公司 电热恒温水浴锅 DK-S24，上海精宏实验设备有限公司 可调式移液器 Finnpipette，芬兰
超声波细胞粉碎机 JY92-II，宁波新芝生物科技股份有限公司 灭菌锅 TOMYSX-500，日本
漩涡混合器 WH966，上海康华生化仪器制造有限公司 荧光酶标仪 BioTeK FLX800，中国 荧光显微镜 NikonTE2000-U，日本
振荡培养箱 HZQ-X100，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 生化培养箱 PHX-150H，宁波莱福科技有限公司
超净工作台 SW-CJ-1FD，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司 酶标仪 1020，郑州安图生物工程有限公司
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活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
（1） 主要试剂
见表2.2。
表2.2. 主要试剂
名称 DAB
DCFH-DA
DHE GSH
Hoechst33342 3-MA
Mitotrack green NAC
NBT Rhodamine123 Tris TTC
牛血清白蛋白（BSA） 蛋白胨 L-甲硫氨酸 酵母浸膏
考马斯亮蓝G－250 葡萄糖 盐酸
乙二胺四乙酸二钠 95%乙醇
产地 sigma Sigma Sigma Solarbio Solarbio Sigma Solarbio Solarbio Sigma Sigma
Bio Basic Inc Solarbio sigma Oxoid
北京鼎国生物有限公司 Oxoid Solarbio
北京鼎国生物有限公司 洛阳昊华化学试剂有限公司 Solarbio
洛阳化学试剂厂
2.2实验主要试剂
2.2.1 实验所用培养基配方 1) YPD培养基
① YPD液体培养基 酵母浸膏 蛋白胨 葡萄糖 1 g 2 g 2 g 混匀后 蒸馏水定容至 100 ml ② YPD固体培养基：含1%琼脂的YPD液体培养基 2) 发酵培养基
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酵母抽提物 蛋白胨 硫酸铵 磷酸二氢钾 硫酸镁 氯化钙 葡萄糖 0.75 g 0.75 g 0.25 g 0.125 g 0.25 g 0.07 g 25 g 混匀后 定容至250 ml 2.2.2 蛋白含量测定试剂配方 1）考马斯亮蓝G250溶液
考马斯亮蓝G-250 95% 乙醇 85% 磷酸 100 mg 50 ml 100 ml 混匀后 蒸馏水定容至 1 000 ml 2）1mg/ml牛血清白蛋白(BSA) BSA H2O 4℃保存 2.2.3荧光试剂配制
1）5 mmol/L DCFH-DA储存液：
DCFH-DA 二甲基亚砜（DMSO） 使用时每1 ml细胞加4 μl 2）10 mg/ml DHE储存液： DHE 二甲基亚砜（DMSO） 5 mg 500 μl 0.0012 g 500 μl 1 mg 1 ml 10
活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
使用时每1 ml细胞悬浮液加4 μl 3）1 mg/ml PI储存液： 碘化丙啶 H2O 使用时每1 ml细胞悬浮液加4 μl 2.2.4自噬相关试剂配制
1）雷帕霉素（rapamycin）
Ethanol Rapamycin TritonX-100 使用时每1 ml细胞加50 μl 2）100 mM 3-甲基腺嘌呤（3-MA） 3-MA 二甲基亚砜DMSO 分装，-20℃下保存 100 mg 6.7 ml 0.9 ml 40 μg 0.1 ml 1 mg 1 ml 2.3 实验方法
2.3.1 生长情况检测
本实验室从安琪酵母粉中提取的酿酒酵母。挑单菌落于YPD培养基中于180 rpm，30℃下培养至对数期制成种子液，按1%接种量接种于新鲜YPD培养基培养至对数期（OD=1.0）后，加入相应的试剂处理一定时间，按不同的指标测定作相应的处理。按以下不同处理设置实验，每个处理3个平行。
CK：蒸馏水
5% E：5%（v/v） 无水乙醇 10% E：10%（v/v）无水乙醇
5% E+GSH：5%（v/v）无水乙醇+2.5 mM GSH 10% E+GSH：10%（v/v）无水乙醇+2.5 mM GSH
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5% E+Met：5%（v/v） 无水乙醇+6 mM GSH 10% E+Met：10%（v/v） 无水乙醇+6 mM GSH 5% E+NAC：5%（v/v） 无水乙醇+10 mM GSH 10% E+NAC：10%（v/v） 无水乙醇+10 mM GSH 5% E+3-MA：5%（v/v） 无水乙醇+5 mM GSH 10% E+3-MA：10%（v/v） 无水乙醇+5 mM GSH 5% E+Rapa：5%（v/v） 无水乙醇+10 mM GSH 10% E+Rapa：10%（v/v） 无水乙醇+10 mM GSH 2.3.2 粗裂解酶液的制备
根据需要取不同处理酿酒酵母细胞培养液，12000 g，4 ℃离心5分钟，收集菌体。得到的菌体重悬于同体积的无菌去离子水中洗涤两次，置于冰上超声波破碎300秒（60次，每次5秒，间隔5秒），得裂解液。 2.3.3 点菌落实验
取各处理酵母细胞悬液，分别稀释101,102,103,104,105,106倍，各取2 μl滴加到YPD固体培养基上，30℃下倒置培养2 d，拍照观察各处理下菌落形态。 2.3.4总蛋白含量测定：
本实验采用Bradford法测定蛋白含量[30]，具体方法如下： 1）蛋白标准曲线的绘制 按下表顺序依次加入各试剂：
表2.3 蛋白质含量测定所加试剂表
管号
1mg/ml BSA(ml) 蒸馏水(ml)
1 0 1
2 0.02 0.08 5
3 0.04 0.06 5
4 0.06 0.04 5
5 0.08 0.02 5
6 1.0 0 5
考马斯亮蓝G-250(ml) 5
充分混匀，10 min后于595 nm下测定光吸收值。
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活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
用标准蛋白质量（mg）为横坐标，吸光度值A595为纵坐标，作图，即得蛋白的标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。
0.80.70.60.5y = 0.0035x + 0.3846R = 0.99222A5950.40.30.20.10020406080100120protein content（μg/ml)
图 2.1蛋白质标准曲线图
2.3.5 存活率测定
取不同处理的酵母细胞，用平板计数法测定存活率。取各处理酵母细胞悬液，分别稀释101,102,103,104,105,106倍，取100 μl适宜梯度的稀释液均匀倾注到YPD固体培养基上，30℃下倒置培养72 h后计数。 2.3.6 酒精含量测定 1)密度瓶质量的测定
将密度瓶洗净、干燥、反复称重，直至恒重，记录密度瓶质量 (m)。
2)蒸馏水质量的测定 将蒸馏水注满已恒重的密度瓶，插上带温度计的瓶塞（瓶中无气泡），立即浸于 20℃的高精度恒温水浴中，保持 15～20 min，待整体温度达到20℃后取出，用滤纸吸去溢出支管的水，盖好小帽，取出密度瓶，立即擦干后称重，记录密瓶和水的质量 (m1)。 3）蒸馏液的测定
将第二步中测定过的密度瓶内的水倒去，用蒸馏得到的蒸馏液冲洗密度瓶 2～3 次，然后装满蒸馏液，按 第二步中的操作处理，记录密度瓶和酒样蒸馏液的质量（m2） 。
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结果计算
按下式计算试样馏出液在 20℃时的密度：
m2- mA200
m1-mAm1mAa
997.0式中：
ρ20—酒样馏出液在 20℃时的密度，g/L；
m ——密度瓶的质量，g；
m1 ——20℃时密度瓶与充满密度瓶蒸馏水的总质量，g； m2 ——20℃时密度瓶与充满密度瓶酒样馏出液的总质量，g； ρ0 —20℃时蒸馏水的密度，998.20 g/L； A—空气浮力校正值；
ρa —干燥空气在 20℃、1013.25 hPa 时的密度值，约为 1.2 g/L（该值随气压条件略有变化，但这种变化一般对密度测定没有影响）； 997.0 —在 20℃时蒸馏水与干燥空气密度值之差，g/L。 2.3.7膜完整性测定
取不同处理酿酒酵母细胞培养液5 ml，10 000 g，4 ℃离心5分钟，收集菌体。得到的菌体重悬于同体积的无菌去离子水中洗涤两次，每毫升细胞悬液加入 10 μl 10 mgml− 1 PI，室温黑暗处理10 min，取100 μl液体加入酶标板中用荧光酶标仪测定荧光强度。 2.3.8 H2O2含量测定
参考Du Xiaoyi等人[31]的方法，采用DCFH-DA法测定H2O2含量。具体方法如下：取不同处理酿酒酵母细胞培养液1 ml，10 000 g，4 ℃离心5分钟，收集菌体。得到的菌体重悬于同体积的无菌去离子水中洗涤两次，使用 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA; Sigma-Aldrich)测定胞内H2O2，25℃下用20 μmol/L DCFH-DA于暗处孵育经过处理的 1×107细胞/ml，使用荧光酶标仪在激发光 485/14 nm，发射光535/25 nm下测定荧光强度，荧光显微镜下用蓝色滤光片观察拍照。
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活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
-2.3.9 O2·含量测定（DHE法）
参考Ayer Anita等人[32]的方法，具体方法如下：取不同处理酿酒酵母细胞培养液1 ml，10 000 g，4 ℃离心5分钟，收集菌体。得到的菌体重悬于同体积的无菌去离子水
-中洗涤两次，使用DHE 测定胞内O2·水平。使用DHE（dihydroethidium; 终浓度 5 mg/ml）
30℃ 染色20 min后，用去离子水冲洗，重悬后在荧光显微镜下用蓝色滤光片观察）。
-2.3.10 O2·含量测定（NBT法）
胞内的NBT(硝基蓝四唑)可被超氧阴离子甲基化成蓝色，从而可以用来测定ROS的产生。参考Zhang Hui等人[33]的方法，具体方法如下：酵母细胞在30℃下用50 µmol/L NBT孵育15 min，用无水乙醇固定，空气干燥。接着用960 µL 2 mol/L的KOH和1120 μL的DMSO溶解，测定630 nm下的吸光度。 2.3.11膜脂过氧化水平检测
采用硫代巴比妥法测定MDA膜脂过氧化水平。具体方法如下：取不同处理酿酒酵母细胞培养液5 ml，12000 g，4 ℃离心5分钟，收集菌体。得到的菌体重悬于同体积的无菌去离子水中洗涤两次。超声波破碎取上清，即为待测酶液，在三个试管中各加酶液0.5 ml，然后各加入2 ml 0.5%的硫代巴比妥酸（TBA，用5%的三氯乙酸配制，现配现用）。混合均匀后沸水中浴15 min；然后使试管在冰浴中迅速冷却，高速冷冻离心机上
以10 000 rpm，离心10 min，取上清分别测定450 nm，532 nm和600 nm下光吸光值。
根据如下公式计算MDA含量。
MDA(mmol·g-1FW)=[6.452×(A532－ A600) －0.559×A450]×Vt/Vs/FW A450—— 450 nm下的吸光值
A532 ——532 nm下的吸光值 A600——600 nm下的吸光值
Vt —— 提取液总体积（ml） Vs —— 测定时提取液体积（ml）
FW ——菌体鲜重（g） 2.3.11线粒体膜电位检测
参考Wang Juan等人[34] 的方法，采用罗丹明123（Rhodamine 123，Rh123）测定线粒体膜电位变化。酵母细胞在含有指定试剂的YPD培养基中处理一定时间。2 μM
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Rh123中室温下孵育30 min，接着用蒸馏水冲洗重悬。采用荧光酶标仪在激发波长和发射波长分别为480和530 nm下测定Rh123的荧光强度。并用荧光显微镜拍摄照片。
所有实验重复三次，所得数据均以平均值±SD表示，用SPSS做t测验。P < 0.05为差异显著，用*表示， P < 0.01为差异极显著，用**表示。
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活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
第三章 结果与分析
3.1 乙醇对酿酒酵母生长发育的影响
1000800cfu/ml(%)CK5%10%60040020000h1htime(h)2h3h图3.1 不同浓度乙醇对酿酒酵母存活率的影响。取对数期酿酒酵母在含有不同浓度无水乙醇的YPD培养基中处理一定时间。平板梯度稀释法测定细胞存活率，涂有不同浓度梯度酵母细胞的YPD固体平板于30°C下孵育72 h，记菌落数。所有值均为三次平行实验的平均值±标准误（n=3）。 Fig. 3.1. Effects of differnent concentration of ethanol on the viability of S.cerevisiae cells. Cell were grown in YPD meidium until mid-log phase and treated with water, 5% ethanol or 10% ethanol. Cell viability was determined by standard dilution plate counts on solid YPD medium. The plates were incubated at 30°C for 72 h and the colonies were counted. Each rectangle represents the mean ±SE of three replicates (n=3).
活化后生长至对数期的酿酒酵母菌株分别在含有0，5 %和10%无水乙醇的YPD液
体培养基中培养3 h，隔1小时取一次样，采用平板计数法测定菌落数。如Fig.3.1所示，乙醇处理的酵母存活率均低于对照，并且随着乙醇浓度的增加，生长抑制越明显，10%乙醇处理组细胞存活率在三个小时内几乎不变。
图3.2 不同浓度乙醇对酿酒酵母菌落生长的影响。取不同浓度无水乙醇处理一定时间的对数期酿酒酵母，按10倍梯度稀释过后，各取2 μl点在YPD固体培养基上，将点有不同浓度梯度酵母细胞的YPD固体平板于30°C下孵育72 h后拍照。
Fig.3.2. Effects of different concentration ethanol on the colony size of S.cerevisiae cells. Cell were
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grown in YPD medium until mid-log phase and treated with water, 5% ethanol or 10% ethanol for indicated time. Each dilute sample (2 μl) was spotted onto YPD agar medium. Photographs were taken after 72 h incubation at 30℃. A:1h, B:2h, C:3h.
为了探明乙醇是否对酵母菌落生长具有抑制作用，将经过不同浓度乙醇处理不同时间的酿酒酵母细胞，按梯度稀释法稀释一定倍数，每稀释样取2 μl点加在YPD固体平板上。如图3.2A 所示，处理时间为15 min时，5%无水乙醇已对酵母细胞的生长有轻微的抑制作用，而10%的乙醇则有明显的抑制作用，随着时间的延长，5%和10%两种处理对酵母生长的抑制作用依然非常明显(图3.2)。以下实验无特别说明酒精处理时间均为1 h。
3.2乙醇胁迫对酿酒酵母细胞膜完整性的影响
图3.3不同浓度乙醇对酿酒酵母细胞膜完整性的影响。取经不同浓度无水乙醇处理1 h后的对数期酿酒酵母,用PI 暗处孵育10 min，使用荧光显微镜拍照(A)，使用荧光酶标仪测定荧光强度(B)。所有值均为三次平行实验的平均值±标准误（n=3）。与CK相比，P < 0.05：差异显著(*)，P < 0.01：差异极显著(**)，与10%E相比，P < 0.05：差异显著(#)，P < 0.01：差异极显著(##)。
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活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
Fig.3.3. Effects of ethanol concentration on the membrane integrity of S.cerevisiae cells. Cell were grown in YPD medium until mid-log phase and treated with water, 5% ethanol, 10% ethanol or 20% ethanol for 1h. Cells were stained with PI for 10 min in the dark.. Fluorescent micrographs of the cells were taken under a fluorescence microscope (A). The relative fluorescence intensity were measured by a microplate reader (B). Each rectangle represents the mean ±SE of three replicates (n=3). Compared with CK, differences were significant at P < 0.05 (*) and P < 0.01 (**) and compared with 10%E, differences were significant at P < 0.05 (#) and P < 0.01 (##), according to t-test.
为了探明乙醇是否对细胞膜造成损伤，本实验采用荧光酶标仪检测了碘化丙啶
（Propidium, PI）染色细胞样品的荧光强度。PI不能穿过完整的活细胞的细胞膜，而受损或坏死的细胞由于失去细胞膜的完整性，PI可进入到细胞内与其内DNA结合，发出波长为617 nm左右的红色荧光。基于这个原因，PI被广泛用于细胞膜完整性的检测。即荧光值越高代表膜完整性受损越严重。由图3.3A可知，酿酒酵母细胞分别用不同浓度乙醇处理1 h之后，进行PI染色发现，酿酒酵母细胞膜完整性与添加的乙醇浓度呈负相关，与对照相比，随着乙醇浓度的增加，PI染色的细胞发出的红色荧光也随着增强，呈浓度依赖性。用荧光酶标仪测定其荧光强度也表明，乙醇可以明显提高PI染色细胞的荧光强度，5%的乙醇处理组的荧光强度几乎是对照的两倍，10%和20%两处理组荧光强度几乎一样，都接近对照的三倍（图3.3B）。结果表明乙醇可以明显降低膜的完整性，且具有浓度依赖性。
3.3 GSH、Met和NAC对乙醇胁迫酿酒酵母的影响
3.3.1对乙醇胁迫酿酒菌落形态的影响
谷胱甘肽是最重要的抗氧化剂之一，广泛存在于原核和真核生物体内。GSH不仅可以清除活性氧，而且可以调节基因表达，氧化还原信号和酶活性等[35]。研究表明GSH在氧化胁迫，重金属胁迫，等各种压力下都有重要作用。NAC是细胞内GSH的还原型谷胱甘肽的前体，能快速穿过细胞膜，是一种生物学研究中广泛使用的抗氧化剂。甲硫氨酸（Met）在生物体内的活性形式是腺苷蛋氨酸（S-Adenosylmethionine, SAM）。SAM是细胞正常功能和生存的重要分子之一，是最重要的甲基供体，作为使用最广泛的辅助因子仅次于ATP[36]。Hu H等人研究表明添加L-Met可以提高过表达Methionine adenosyltransferase (MAT)重组毕赤酵母中SAM的水平[37]。为了探明这三种化合物是否在乙醇胁迫中起作用，分别将GSH，Met和NAC加入含有10%乙醇的YPD培养基中，处理1 h。由图3.4A中的结果可知，GSH，Met和NAC均可对10%乙醇胁迫后变小的
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菌落有一定的恢复作用，进一步用平板计数法验证发现，这三种化合物均可恢复由乙醇引起的酵母存活率降低。结果表明GSH，Met 和 NAC对乙醇胁迫的酵母可能具有恢复作用。
图3.4 GSH，Met和NAC对乙醇胁迫的酿酒酵母生长的恢复作用。A) 取经过不同化合物处理1h后的对数期酿酒酵母，按10倍梯度稀释过后，各取2μl点在YPD固体培养基上，将点有不同浓度梯度酵母细胞的YPD固体平板于30°C下孵育72 h后拍照。B)平板梯度稀释法测定细胞存活率。 取经不同化合物处理1h后的对数期酿酒酵母，涂有不同浓度梯度酵母细胞的YPD固体平板于30°C下孵育72 h，记菌落数。使用SPSS进行T检验，所有值均为三次平行实验的平均值±标准误（n=3）。与CK相比，P < 0.05：差异显著(*)，P < 0.01：差异极显著(**) 。与10%E相比，P < 0.05：差异显著(#)，P < 0.01：差异极显著(##)。
Fig.3.3. Effects of GSH、Met and NAC on the growth of S.cerevisiae cells. A) Cell were grown in YPD medium until mid-log phase and treated with indicated reagents for 1h. Each dilute sample (2 μl) was spotted onto YPD agar medium. Photographs were taken after 72h incubation at 30℃. B) Cells viability was estimated by cfu counts. CK: control, 10% E: 10% ethanol, 10%E+GSH: 10% ethanol and 2.5 mM GSH, 10%E+Met: 10% ethanol and 6 mM Met, 10%E+NAC: 10% ethanol and 10 mM NAC. Each rectangle represents the mean ±SE of three replicates (n=3). Compared with CK, differences were significant at P < 0.05 (*) and P < 0.01 (**) and compared with 10%E, differences were significant at P < 0.05 (#) and P < 0.01 (##), according to t-test.
3.3.2对乙醇胁迫酿酒酵母细胞膜完整性的影响
细胞膜是一道防止细胞外物质自由进入细胞的天然屏障，主要功能是保证细胞内环境的相对稳定，从而使各种生化反应能够有序良好运行。将培养至对数期的酵母分别在含H2O、10% ethanol、10% ethanol+2.5 mM GSH、10% ethanol+6 mM Met、10% ethanol+10 mM NAC的YPD培养基中生长一定时间。通过PI染色检验GSH，Met和NAC对乙醇胁迫酿酒酵母细胞膜完整性的恢复作用。红色荧光越弱，荧光强度越低，表示细胞完整性越高。
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图3.5 GSH、Met和NAC对乙醇胁迫的酿酒酵母细胞膜完整性的影响。培养至对数期的酵母分别在含H2O、10% ethanol、10% ethanol + 2.5 mM GSH、10% ethanol a+6 mM Met、10% ethanol + 10 mM NAC的YPD培养基中生长一定时间，PI染色检测其荧光值。荧光显微镜下拍照，A：15 min，B：30 min，C：60 min。荧光酶标仪所测荧光强度(D)，所有值均为三次平行实验的平均值±标准误（n=3）。使用SPSS进行T检验，与CK相比，P < 0.05：差异显著(*)，P < 0.01：差异极显著(**) 。
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与10% E相比，P < 0.05：差异显著(#)，P < 0.01：差异极显著(##)。
Fig.3.5. Effects of GSH、Met and NAC on the membrane integrity of S.cerevisiae cells under ethanol stress. Cell were grown in YPD medium until mid-log phase and treated with indicated reagents for given times. CK: control, 10% E: 10% ethanol, 10% E+GSH: 10% ethanol and 2.5 mM GSH, 10% E+Met: 10% ethanol and 6 mM Met, 10% E+NAC: 10% ethanol and 10 mM NAC. Cells were stained with PI, fluorescent micrographs of the cells were taken under a fluorescence microscope. the cells were treated for 15 min (A), 30 min (B), 60 min(C). The relative fluorescence intensity were measured by a microplate reader(D). Each rectangle represents the mean ±SE of three replicates (n=3). Compared with CK. differences were significant at P < 0.05 (*) and P < 0.01 (**) and compared with 10% E, differences were significant at P < 0.05 (#) and P < 0.01 (##), according to t-test.
由图3.5A的荧光图片可知，与对照相比，10%乙醇处理15 min后的酿酒酵母细胞的红色荧光即有明显增强，随着处理时间的延长，其增加更为显著。在乙醇存在时，同时加入GSH、Met和NAC处理15 min后，前两种物质并没使乙醇导致增加的红色荧光有明显变化，而NAC明显降低了红色荧光的强度。分别处理30 min时，三者都出现了红色荧光不同程度降低的现象，其中GSH和NAC极其显著地降低了由乙醇引起的荧光强度增加，各组处理1 h后结果发现，与乙醇处理的酵母细胞相比，GSH、Met和NAC三者都极其显著地降低了荧光强度。以上结果表明GSH、Met和NAC都可以提高乙醇胁迫下酿酒酵母细胞膜完整性，但是各自起作用的时间各不相同，作用强度也不尽相同（图3.5）。
3.3.3对乙醇胁迫酿酒酵母线粒体膜电位的影响
罗丹明123是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，是一种线粒体跨膜电位的指示剂。Rh123可透过细胞膜且在活细胞的线粒体内聚集，并发出黄绿色荧光，当线粒体膜电位降低时，Rh123被重新释放出线粒体导致荧光降低。在此基础上，采用Rh123检测酿酒酵母线粒体膜电位的变化。由图可知，10%的乙醇可以极其明显地降低Rh123的荧光强度，加入GSH、Met和NAC时发现，三者都可以极其有效地提高乙醇降低的荧光强度，结果表明，GSH、Met和NAC可以恢复乙醇导致的线粒体膜电位下降（图3.6）。
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活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
图3.6 GSH、Met和NAC对乙醇胁迫酿酒酵母线粒体膜电位的影响。培养至对数期的酵母分别在含H2O、10% ethanol、10% ethanol + 2.5 mM GSH、10% ethanol a+6 mM Met、10% ethanol + 10 mM NAC的YPD培养基中生长1h，Rh123染色30 min检测其荧光值。荧光显微镜下拍照（A），荧光酶标仪所测荧光强度(B)，所有值均为三次平行实验的平均值±标准误（n=3）。使用SPSS进行T检验，与CK相比，P < 0.05：差异显著(*)，P < 0.01：差异极显著(**) 。与10%E相比，P < 0.05：差异显著(#)，P < 0.01：差异极显著(##)。 Fig.3.6. Effects of GSH、Met and NAC on the Mitochondrial Membrane Potential of S.cerevisiae cells under ethanol stress. Cell were grown in YPD medium until mid-log phase and treated with indicated reagents for given times. CK: control, 10%E: 10% ethanol, 10%E+GSH: 10% ethanol and 2.5 mM GSH, 10%E+Met: 10% ethanol and 6 mM Met, 10%E+NAC: 10% ethanol and 10 mM NAC. Cells were stained with Rh123 for 30 min, fluorescent micrographs of the cells were taken under a fluorescence microscope. the cells were treated for 60 min (A), the relative fluorescence intensity were measured by a microplate reader(B). Each rectangle represents the mean ±SE of three replicates (n=3). Compared with CK. differences were significant at P < 0.05 (*) and P < 0.01 (**) and compared with 10%E, differences were significant at P < 0.05 (#) and P < 0.01 (##), according to t-test.
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3.3.4对乙醇胁迫酿酒酵母中ROS的影响
-ROS的种类很多，其中常见的为O2·、H2O2等。活性氧的种类不同，其起作用的方
式也不同，本实验分别以荧光染料DHE和DCFH-DA为探针，测定了不同处理酵母中
-的O2·和H2O2的水平。
图3.7 GSH，Met和NAC对乙醇胁迫酿酒酵母胞内O2-含量的影响。培养至对数期的酵母分别在含H2O、10% ethanol、10% ethanol and 2.5 mM GSH、10% ethanol and 6 mM Met、10% ethanol and 10 mM NAC的YPD培养基中生长1h，DHE染色10 min。荧光显微镜所拍照片(A)。荧光酶标仪所测荧光强度(B)。所有值均为三次平行实验的平均值±标准误（n=3）。使用SPSS进行T检验，与CK相比，t< 0.05：差异显著(*)，t < 0.01：差异极显著(**) ；与10%E相比，t< 0.05：差异显著(#)，t < 0.01：差异极显著(##)。
Fig.3.7. Effects of GSH、Met and NAC on the O2- level of S.cerevisiae cells under ethanol stress. Cells were grown in YPD medium until mid-log phase and treated with indicated reagents for 1h. Cells were stained with DHE, fluorescent micrographs of the cells were taken under a fluorescence microscope(A). The relative fluorescence intensity were measured by a microplate reader(B). CK: control, 10%E: 10% ethanol, 10%E+GSH: 10% ethanol and 2.5 mM GSH, 10%E+Met: 10% ethanol and 6 mM Met, 10%E+NAC: 10% ethanol and 10 mM NAC. Each rectangle represents the mean ±SE of three replicates (n=3). Compared with CK, differences were significant at t < 0.05 (*) and t < 0.01 (**) and compared with
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活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
10%E, differences were significant at t < 0.05 (#) and t< 0.01 (##), according to t-test.
-O2·虽然活性不强，但可以直接与某些蛋白发生反应，造成蛋白损伤；与羟基（-OH）
结合后的产物还会导致细胞DNA损坏，破坏细胞机体功能。由图3.7可知，乙醇可以明显提高DHE染色后细胞的荧光强度，分别加入GSH、Met和NAC后发现三种化合物都可以降低乙醇增加的红色荧光强度，进一步用荧光酶标仪验证，发现GSH、Met 和NAC确实可以非常明显的降低乙醇增加的红色荧光强度，但是仍比对照组的水平要高。
-以上结果表明乙醇处理增加了细胞内O2·的水平，而GSH、Met 和NAC可以恢复乙醇-增加的O2·含量。
图3.8 GSH，Met和NAC对乙醇胁迫酿酒酵母细胞O2-含量的影响。培养至对数期的酵母分别在含H2O、10% ethanol、10% ethanol 和 2.5 mM GSH、10% ethanol和 6 mM Met、10% ethanol 和10 mM NAC的YPD培养基中生长1 h ，NBT染色。光学显微镜所拍照片(A)。酶标仪所测吸光度值(B)。所有值均为三次平行实验的平均值±标准误（n=3）。使用SPSS进行T检验，与CK相比，t < 0.05：差异显著(*)，P < 0.01：差异极显著(**) 。与10%E相比，t < 0.05：差异显著(#)，t < 0.01：差异极显著(##)。
Fig.3.8. Effects of GSH、Met and NAC on the O2- level of S.cerevisiae cells under ethanol stress. Cell were grown in YPD medium until mid-log phase and treated with indicated reagents for 1 h. A）Cells were stained with NBT, micrographs of the cells were taken under a microscope. B) Cells were stained with NBT, the relative intensity were measured by a microplate reader. CK: control, 10%E: 10% ethanol, 10%E+GSH: 10% ethanol and 2.5 mM GSH, 10%E+Met: 10% ethanol and 6 mM Met, 10%E+NAC: 10% ethanol and 10 mM NAC. Each rectangle represents the mean ±SE of three replicates (n=3). Compared with CK, differences were significant at t < 0.05 (*) and t < 0.01 (**) and compared with 10%E, differences were significant at t < 0.05 (#) and t < 0.01 (##), according to t-test.
NBT (p-Nitroblue tetrazolium)可以和O2反应形成蓝紫色的甲瓒，其颜色深浅可以反
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·-
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-映O2·产生的多少。进一步用NBT法验证GSH、Met和NAC对乙醇胁迫的酿酒酵母中-O2·含量的影响，如图3.8所示，与用荧光探针DCFH-DA检测一致，10%乙醇处理60 min-的酿酒酵母中O2·明显提高，但同时分别加入GSH、Met和NAC后，发现只有Met能-有效的降低乙醇提高的O2·含量。两种方法结果不一致，有可能是因为DCFH-DA和NBT-对O2·的敏感性不同造成的。
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活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
图3.9 GSH、Met和NAC对乙醇胁迫酿酒酵母细胞H2O2含量的影响。培养至对数期的酵母分别在含0、10% ethanol、10% ethanol+ 2.5 mM GSH、10% ethanol +6 mM Met、10%ethanol+10 mM NAC的YPD培养基中生长1h，DCFH-DA染色30 min。荧光显微镜下拍照，A：15 min，B：30 min，C：60 min。荧光酶标仪所测荧光强度(D)，所有值均为三次平行实验的平均值±标准误（n=3）。使用SPSS进行T检验，与CK相比，t< 0.05：差异显著(*)，t < 0.01：差异极显著(**) 。与10%E相比，t< 0.05：差异显著(#)，t < 0.01：差异极显著(##)。 Fig.3.9. Effects of GSH、Met and NAC on the H2O2 level of S.cerevisiae cells under ethanol stress. Cell were grown in YPD medium until mid-log phase and treated with indicated reagents for 1 h. Cells were stained with DCFH-DA for 30 min, fluorescent micrographs of the cells were taken under a fluorescence microscope. The cells were treated for 15 min (A), 30 min (B), 60 min (C). The relative fluorescence intensity were measured by a microplate reader(D). CK: control, 10%E: 10% ethanol, 10%E+GSH: 10% ethanol and 2.5 mM GSH, 10%E+Met: 10% ethanol and 6 mM Met, 10%E+NAC: 10% ethanol and 10mM NAC. Each rectangle represents the mean ±SE of three replicates (n=3). Compared with CK, differences were significant at t < 0.05 (*) andt < 0.01 (**) and compared with 10%E, differences were significant at t < 0.05 (#) and t < 0.01 (##), according to t-test.
H2O2本身几乎没有活性，但是可以自由的穿过细胞膜转化成强氧化性的羟自由基。为了检测H2O2浓度，将处理过的细胞用DCFH-DA探针孵育30 min，分别采用荧光显微镜和荧光酶标仪拍摄图片和测定荧光强度。荧光染料DCFH-DA（2’，7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠）可以自由穿过细胞膜进入细胞内，在胞内非特异性脂酶的催化下，变成DCFH (2’，7’-二氢二氯荧光黄)，DCFH-DA本身并不能发出荧光。当细胞内有H2O2存在时，DCFH-DA就会被氧化成DCF (2’，7’-二氯荧光黄)，在激光激发下发出绿色荧光，波长在524 nm左右。其荧光强度可反映H2O2的水平。由图3.9可知，与对照相比，用10%乙醇处理15 min就会导致其荧光强度的增加，说明酿酒酵母细胞内H2O2水平与乙醇处理时间呈正相关。在乙醇存在时分别加GSH，Met和NAC的三组处理在15 min，30 min时荧光强度与单独的乙醇处理组没有明显差别，而在60 min时三者明显降低了荧光强度。结果表明GSH, Met和NAC可以恢复乙醇增加的H2O2含量，但是是在后期起作用（60 min）。
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3.3.5对乙醇胁迫酿酒酵母中MDA含量的影响
酿酒酵母在含有10%乙醇的YPD液体培养基中培养60 min，以细胞中MDA含量的高低代表其细胞膜脂过氧化水平。结果显示，乙醇胁迫下酵母细胞MDA含量显著升高，几乎为对照的三倍，而GSH、Met和NAC可以显著地降低乙醇导致的MDA水平上升，说明GSH、Met和NAC可以恢复乙醇导致的膜脂过氧化水平（图3.10）。
图3.10 GSH，Met和NAC对乙醇胁迫酿酒酵母MDA含量的影响。培养至对数期的酵母分别在含H2O、10% ethanol、10% ethanol 和 2.5 mM GSH、10% ethanol和 6 mM Met、10% ethanol 和10 mM NAC的YPD培养基中生长1 h ，硫代巴比妥法测定MDA含量。所有值均为三次平行实验的平均值±标准误（n=3）。使用SPSS进行T检验，，与CK相比，t < 0.05：差异显著(*)，P < 0.01：差异极显著(**) 。与10% E相比，t < 0.05：差异显著(#)，t < 0.01：差异极显著(##)。 Fig.3.10. Effects of GSH、Met and NAC on the MDA concent of S.cerevisiae cells under ethanol stress. Cell were grown in YPD medium until mid-log phase and treated with indicated reagents for 1 h. CK: control, 10% E: 10% ethanol, 10% E+GSH: 10% ethanol and 2.5 mM GSH, 10% E+Met: 10% ethanol and 6 mM Met, 10% E+NAC: 10% ethanol and 10 mM NAC. Each rectangle represents the mean ±SE of three replicates (n=3). Compared with CK, differences were significant at t < 0.05 (*) and t < 0.01 (**) and compared with 10%E, differences were significant at t < 0.05 (#) and t < 0.01 (##), according to t-test.
3.3.6 GSH、Met和NAC对乙醇产率的影响
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活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
图3.11 GSH，Met和NAC对乙醇胁迫酿酒酵母乙醇产率的影响。培养至对数期的酵母分别在含H2O、2.5 mM GSH、6 mM Met、10 mM NAC的发酵培养基中生长72 h，蒸馏后采用密度瓶法检测酒精浓度。。所有值均为三次平行实验的平均值±标准误（n=3）。使用SPSS进行T检验，与CK相比，t < 0.05：差异显著(*)，t < 0.01：差异极显著(**) 。
Fig.3.11. Effects of GSH、Met and NAC on the ethanol yield of S.cerevisiae cells under ethanol stress. Cell were grown in fermentation medium until mid-log phase and treated with indicated reagents for 72 h. The ethanol yield was dertemined according to GJB772A 97, 401.1 using density bottle methods. CK: control, GSH: 2.5 mM GSH, Met: 6 mM Met, NAC: 10 mM NAC. Each rectangle represents the mean ±SE of three replicates (n=3). Compared with CK, differences were significant at t < 0.05 (*) and t < 0.01 (**) .
为了探明GSH、Met和NAC是否能够提高酿酒酵母的乙醇产率，酿酒酵母在分别含有H2O、2.5 mM GSH、6 mM Met、10 mM NAC的发酵培养基中生长72 h，用密度瓶法测定乙醇产率。结果发现，6 mM Met、10 mM NAC可以提高乙醇的产率，分别为8.62%和8.56%，但是只有10 mM NAC处理达到显著水平。而GSH组只有6.35%。说明GSH、Met 和NAC在乙醇胁迫中起作用的方式有可能不同（图3.11）。
3.4自噬在乙醇胁迫中的作用
乙醇是酿酒酵母发酵过程中的主要发酵产物。而在发酵后期随着乙醇浓度的增加，乙醇反而会对酵母产生胁迫，严重时甚至导致细胞死亡。细胞死亡主要被分为坏死、程序性死亡。坏死是指环境因素导致细胞死亡的病理过程。而程序性死亡包括细胞自噬性死亡（即II型程序性细胞死亡）和细胞凋亡（即I型细胞死亡）。自噬和凋亡是相互联系而又有明显区别的两个过程。自噬通常会影响ROS水平，为了解自噬是否参与了酵母乙醇胁迫过损伤及其机制，我们用自噬抑制剂3-MA和诱导剂Rapamycin处理酿酒酵母细胞，检测了自噬对乙醇胁迫酿酒酵母ROS的影响，同时检测了自噬对酿酒酵母菌落形成及生长和损伤的影响。
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3.4.1自噬对酵母菌落的影响
图3.12 3-MA对酿酒酵母菌落生长的影响。将处于对数生长期的酿酒酵母于以上各组处理中分别孵育15 min、30 min和60 min取样。将各处理组一定时间的对数期酿酒酵母，按10倍梯度稀释过后，各取2 μl点在YPD固体培养基上，将点有不同浓度梯度酵母细胞的YPD固体平板于30°C下孵育72 h后拍照。
Fig.3.12. Effects of 3-MA on the colony size of S.cerevisiae cells under ethanol stress. Cell were grown in YPD medium until mid-log phase and treated with indicated reagents for indicated time. Each dilute sample (2 μl) was spotted onto YPD agar medium. Photographs were taken after 72 h incubation at 30℃. CK: control, 10% E: 5% ethanol, 5% E+3-MA: 5% ethanol and 5 mM 3-MA, 10%E: 10% ethanol, 10% E+3-MA: 10% ethanol and 5 mM 3-MA,
生理条件下，细胞自噬调控通路主要有磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K, Phosphoinositide 3-kinase)通路和TOR（Target Of Rapamycin）通路。很多其他的自噬调控信号通路都直接或间接的通过以上两条通路发挥作用。
本实验中, 为了探明自噬发生是否可以恢复乙醇对酵母菌落形成的抑制作用，在含有10%乙醇的YPD培养中加入3-MA（终浓度5 mM），继续培养一定时间，取样点在YPD固体培养基上培养72 h后观察发现，5%乙醇处理15 min时即可抑制酵母菌落的形成，随着时间的增加，抑制作用没有明显变化。加入3-MA后，乙醇对菌落形成造成的抑制作用有所降低，随着时间的增加，恢复作用没有明显变化。将乙醇含量增加到10%发现，随着时间的增加，对菌落的抑制作用有所增加，加入3MA后，乙醇对菌落形成造成的抑制作用有所降低，随着时间的增加，恢复作用也明显增强（图3.12）。
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活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
图3.13 雷帕霉素对酿酒酵母菌落生长的影响。取不同浓度无水乙醇处理一定时间的对数期酿酒酵母,按10倍梯度稀释过后，各取2 μl点在YPD固体培养基上，将点有不同浓度梯度酵母细胞的YPD固体平板于30°C下孵育72 h后拍照。
Fig.3.13. Effects of rapamycin on the colony size of S.cerevisiae cells under entanol stress. Cell were grown in YPD medium until mid-log phase and treated with indicated reagents for indicated time. Each dilute sample (2 μl) was spotted onto YPD agar medium. Photographs were taken after 72 h incubation at 30℃. CK: control, 5% E: 5% ethanol, 5% E+Rapa: 5% ethanol and 10 mM Rapamycin, 10%E: 10% ethanol, 10% E+Rapa: 10% ethanol and 10 mM Rapamycin.
为了进一步验证，自噬参与了乙醇胁迫，并且可以降低乙醇对酿酒酵母的胁迫作用。本实验加入自噬诱导剂从另一方面进行了验证。TOR是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，对细胞自噬起负调控的作用。正常条件下，处于激活状态的TOR抑制了细胞自噬；当细胞处于饥饿、雷帕霉素或其他外源刺激时，TOR就会处于抑制状态从而导致细胞自噬增强。雷帕霉素是最常用的自噬抑制剂。如图3.13所示，在5%和10%乙醇处理早期，雷帕霉素进一步加剧了乙醇对酿酒酵母菌落形成的抑制作用。以上研究结果表明，自噬参与了乙醇胁迫导致的细胞生长抑制。
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3.4.2自噬对膜完整性的影响
Relative Fluorescence IntisityRelative Fluorescence Intisity25020015010050025020015010050015min30min60min15min30min60min****##**#CK5%E5%E+3-MACK10%E10%E+3-MA
Relative Fluorescence Intisity25002000150010005000CK5%E15min30min60min######**5%E+Rapa
图3.14 自噬对乙醇胁迫的酿酒酵母细胞膜完整性的影响。培养至对数期的酵母分别在含H2O、5% ethanol、5% ethanol+5 mM 3-MA、5% ethanol+10 mM Rapamycin、10% ethanol、10% ethanol +5 mM 3-MA、10% ethanol+10 mM Rapamycin的YPD培养基中生长一定时间，PI染色。利用荧光酶标仪测定其荧光强度。。所有值均为三次平行实验的平均值±标准误（n=3）。使用SPSS进行T检验，与CK相比，t < 0.05：差异显著(*)，t < 0.01：差异极显著(**) 。与5%E或10%E相比，t < 0.05：差异显著(#)，t< 0.01：差异极显著(##)。
Fig.3.14. Effect of autophagy on the membrane integrity of S.cerevisiae cells under ethanol stress. Cell were grown in YPD medium until mid-log phase and treated with indicated reagents for given times. A）Cells were stained with PI, fluorescent micrographs of the cells were taken under a fluorescence microscope. B) Cells were stained with PI, the relative fluorescence intensity were measured by a microplate reader. CK: control, 10%E: 10% ethanol, 10% E+3-MA: 10% ethanol and 5 mM 3-MA, 10% E+Rapa: 10% ethanol and 10 mM Rapamycin, 10% E: 10% ethanol, 10% E+3-MA: 10% ethanol and 5 mM 3-MA, 10% E+Rapa: 10% ethanol and 10 mM Rapamycin. Each rectangle represents the mean ±SE of three replicates (n=3). Compared with CK, differences were significant at t < 0.05 (*) and t< 0.01 (**) and compared with 5% E (or 10% E), differences were significant at t < 0.05 (#) and t < 0.01 (##), according to t-test.
由图3.14可知，与对照组相比，处于对数期的酿酒酵母用5%乙醇处理60 min，用荧光酶标仪测的PI荧光强度增加极其显著，同时加入3MA后共处理60 min发现荧光强度明显降低。而同时加入雷帕霉素共处理时，15 min、30 min和60 min的荧光强度与5%乙醇组相比增加都极其显著。将乙醇浓度增大到10%发现，在15 min时PI的荧光强度就有明显增加，同时加入3-MA后，只有60 min处理组荧光强度显著降低。而同时加入雷帕霉素共处理时，15 min、30 min和60 min的荧光强度与10%乙醇组相比增加都极其显著。以上结果表明乙醇浓度越大，膜完整性受损时间越早，受损越严重。结合
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活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
乙醇对酿酒酵母菌落形态的影响，说明自噬参与了乙醇胁迫过程并起促进细胞死亡的作用。
3.4.3自噬对ROS的影响
很多研究表明自噬和ROS有密切关系。为了探明自噬是否在乙醇胁迫中影响ROS的产生，以及在乙醇胁迫中自噬扰动的是哪种活性氧，我们在乙醇存在的情况下，分别添加或不添加3-MA和添加或不添加雷帕霉素，分别在15 min，30 min和60 min时间点取样，分别以荧光染料DHE和DCFH-DA为探针，测定了不同处理酵母中的超氧阴离子和H2O2的水平。
-如图3.15所示，5%乙醇在15 min就可以促进酵母中O2·的产生，30 min时与对照-没有明显变化，处理时间增加到60 min时O2·的水平又有明显提高，加入3-MA后，15 --min时可以降低O2·的水平，而30 min以后又明显增加了O2·的水平，这些结果说明早--期时自噬可能还没被激活，因而导致O2·的水平有所增加，随着自噬的激活，细胞的O2·-的水平恢复到对照水平，这与加入3-MA共处理30 min导致O2·的水平明显增加结果一-致。随着乙醇胁迫时间的增加，自噬调控水平相对降低导致O2·的水平再次上升。10 mM -的雷帕霉素可以诱导自噬的产生，导致乙醇增加O2·的水平进一步上升，这有可能是雷-帕霉素浓度过大，导致自噬过度，从而明显提高了O2·的水平。将乙醇浓度增大到10%-发现， 在15 min时，10%乙醇极其显著地提高了O2·的水平，而3-MA在30 min时才--明显地抑制了O2·的水平，而雷帕霉素也是在30 min时也非常明显地进一步提高了O2·-的水平。说明10%乙醇处理可以通过诱导自噬发生，从而引起O2·的水平的明显上升。
为了探明自噬在乙醇胁迫酵母过程中是否可以调控H2O2的水平，通过添加自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂雷帕霉素，采用荧光酶标仪测定DCFH-DA的荧光强度反映H2O2的水平高低。如图3.16所示，与对照相比，5%乙醇在处理30 min以前随着时间的增加，H2O2水平也明显增加，当到60 min时H2O2水平非常明显地降低，而加入自噬抑制剂3MA后，处理15 min即可导致H2O2水平急剧上升，而加入自噬诱导剂雷帕霉素也是极其明显的提高了H2O2的水平。结果表明，在5%乙醇胁迫过程中自噬在后期（60 min）可以有效的降低H2O2的水平，而10 mM 的雷帕霉素可以诱导自噬的产生，导致乙醇增加H2O2的水平进一步上升，这有可能是雷帕霉素浓度过大，导致自噬过度，从而明显提高了H2O2的水平。将乙醇浓度增大到10%发现，10%乙醇从早期开始就可以
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极其显著的增加H2O2的水平，而自噬抑制剂3MA在早期就可以极其有效的降低乙醇导致的H2O2的水平增加。
Relative Fluorescence IntisityRelative Fluorescence Intisity300250200150100500CK5%E5%E+3MA15min30min60min####15min300250200150100500CK10%E10%E+3MA30min60min*******###
Relative Fluorescence Intisity15min30min60min##Relative Fluorescence Intisity
9008007006005004003002001000##15min30min60min##7006005004003002001000####*******CK5%E5%E+Rapa 图3.15 自噬对乙醇胁迫的酿酒酵母O2的影响。培养至对数期的酵母分别在含H2O、5% ethanol、5% ethanol+5 mM 3-MA、5% ethanol+10 mM Rapamycin、10% ethanol、10% ethanol +5 mM 3-MA、10% ethanol+10 mM Rapamycin的YPD培养基中生长一定时间，DHE染色10 min。利用荧光酶标仪测其荧光强度。所有值均为三次平行实验的平均值±标准误（n=3）。使用SPSS进行T检验，与CK相比，t < 0.05：差异显著(*)，t < 0.01：差异极显著(**) 。与5% E或10% E相比，t< 0.05：差异显著(#)，t < 0.01：差异极显著(##)。
-Fig.3.15. Effect of autophagy on the O2· concent of S.cerevisiae cells under ethanol stress. Cell were grown in YPD medium until mid-log phase and treated with indicated reagents for given times. A）Cells were stained with DHE, fluorescent micrographs of the cells were taken under a fluorescence microscope. B) Cells were stained with PI, the relative fluorescence intensity were measured by a microplate reader. CK: control, 10% E: 10% ethanol, 10% E+3-MA: 10% ethanol and 5 mM 3-MA, 10% E+Rapa: 10% ethanol and 10 mM Rapamycin, 10% E: 10% ethanol, 10% E+3-MA: 10% ethanol and 5 mM 3-MA, 10%E+Rapa: 10% ethanol and 10 mM Rapamycin. Each rectangle represents the mean ±SE of three replicates (n=3). Compared with CK, differences were significant at t< 0.05 (*) and t < 0.01 (**) and compared with 5% E(or 10% E), differences were significant at t < 0.05 (#) and t < 0.01 (##), according to t-test.
·-15min30min60minCK10%E10%E+RapaRelative Fluorescence IntisityRelative Fluorescence Intisity##160140120100806040200CK5%E5%E+3-MA15min30min60min##******180160140120100806040200CK******######10%E10%E+3-MA 34
活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
15min30min60minRelative Fluorescence Intisity200150100500CK##******## #图3.16自噬对乙醇胁迫酿酒酵母H2O2的影响。培养至对数期的酵母分别在含H2O、5% ethanol、5% ethanol+5 mM 3-MA、5% ethanol+10 mM Rapamycin、10% ethanol、10% ethanol +5 mM 3-MA、10% ethanol+10 mM Rapamycin、的YPD培养基中生长一定时间，DCFH-DA染色30 min后，利用荧光酶标仪测定其荧光强度。所有值均为三次平行实验的平均值±标准误（n=3）。使用SPSS进行T检验，与CK相比，t < 0.05：差异显著(*)，t < 0.01：差异极显著(**) 。与5% E 或10% E相比，t < 0.05：差异显著(#)，t < 0.01：差异极显著(##)。
Fig.3.16. Effects of autophagy on the H2O2 concent of S.cerevisiae cells under ethanol stress. Cell were grown in YPD medium until mid-log phase and treated with indicated reagents for given times. A）Cells were stained with DCFH-DA, fluorescent micrographs of the cells were taken under a fluorescence microscope. CK: control, 10% E: 10% ethanol, 10% E+3-MA: 10% ethanol and 5 mM 3-MA, 10% E+Rapa: 10% ethanol and 10 mM Rapamycin, 10%E: 10% ethanol, 10%E+3-MA: 10% ethanol and 5 mM 3-MA, 10% E+Rapa: 10% ethanol and 10 mM Rapamycin. Each rectangle represents the mean ±SE of three replicates (n=3). Compared with CK, differences were significant at t < 0.05 (*) and t < 0.01 (**) and compared with 5% E(or 10% E), differences were significant at t < 0.05 (#) and t< 0.01 (##), according to t-test.
10%E10%E+Rapa
3.5 讨论
3.5.1 ROS增加是乙醇胁迫抑制酿酒酵母生长的主要原因
在本实验中，用乙醇处理对数生长期的酿酒酵母发现，随着乙醇浓度的升高，酵母细胞数目明显下降，其菌落形态也被抑制。说明乙醇胁迫能够抑制酵母细胞生长甚至导致细胞死亡。大量研究认为乙醇胁迫可以诱导酵母产生氧爆，产生的ROS大量积累，导致细胞内各种大分子受到破坏，造成氧化损伤，使酵母细胞代谢平衡受到严重影响。
为了探明GSH和NAC是否能够恢复乙醇的产率，本实验在添加有乙醇的条件下，分别加入GSH和NAC共培养，通过点菌落实验发现两者确实可以提高酵母的存活率，
-通过使用荧光探针DHE和DCFH-DA，特异性地检测了 O2·和H2O2的水平，发现GSH-和NAC可以有效的降低乙醇增加的O2·和H2O2水平，提高膜的完整性。摇床培养72h
后蒸馏检测馏出液中乙醇含量，发现两者虽然都能清除活性氧使细胞维持正常的生长状态，但与正常组7.3%的乙醇产率相比，只有NAC能够提高乙醇的产率，为 8.56%，而GSH组只有6.35%。说明GSH和NAC在乙醇胁迫中起作用的方式有可能不同。
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3.5.2 Met可以恢复乙醇对酿酒酵母的损伤
Met 在体内主要以有活性的SAM存在，主要功能是参与蛋白质的合成。虽然有关SAM的报道很多，但是有关Met的相关报道并不常见。本文通过在含有乙醇存在条件下加入Met，观察其是否在乙醇胁迫中产生作用。结果发现Met可以提高酵母对乙醇的
-耐受性，提高存活率，有效地降低O2·和H2O2的水平，提高膜完整性和乙醇产率，恢复
乙醇导致的膜脂过氧化水平增加。说明Met可以降低ROS水平，减少氧化胁迫，从而提高酿酒酵母对乙醇的胁迫。
3.5.3 自噬通过减少ROS降低乙醇胁迫损伤
自噬作为一个保守的胞内大分子物质降解途径，在胁迫，饥饿，衰老等过程中都有发生。通过添加自噬抑制剂3-MA和诱导剂雷帕霉素发现，3-MA可以有效的提高酿酒酵母菌落大小，而雷帕霉素却进一步抑制了菌落的形成，说明乙醇诱导了自噬的发生。
为了探明在乙醇胁迫中自噬与ROS之间的联系，检测了添加自噬抑制剂3-MA或
-诱导剂雷帕霉素后ROS的水平。结果表明3-MA可以进一步提高5%乙醇导致的O2·和-H2O2水平增加，说明5%乙醇通过诱导自噬的发生降低了O2·的水平。而10%乙醇由于-浓度过大，导致自噬过度造成O2·和H2O2水平的提高。说明自噬参与了乙醇对酿酒酵母
-的胁迫，其机制有可能是高浓度乙醇诱导自噬产生，引起O2· 和H2O2等ROS水平上升，
导致氧化胁迫，从而造成酵母细胞受到胁迫。
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活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用
第四章 结论
1乙醇胁迫对酿酒酵母造成了损伤。乙醇可以抑制对数生长期酿酒酵母细胞的生长，导致膜完整性受损，线粒体膜电位降低，脂质过氧化物MDA含量增加，细胞存活率下降，说明乙醇对酵母产生了胁迫损伤。
-2 乙醇胁迫通过诱导ROS产生导致酿酒酵母细胞损伤。乙醇导致O2· 和H2O2水-平自己，而ROS清除剂GSH和NAC可以降低O2· 和H2O2水平，提高乙醇胁迫导致的
酿酒酵母细胞存活率下降和菌落形态变小，提高膜完整性和线粒体膜电位，降低膜脂过氧化水平。NAC还可以提高乙醇产率。说明ROS增加是乙醇胁迫对酿酒酵母的损伤机
-制之一，乙醇通过诱导O2· 和H2O2等ROS的产生，导致氧化胁迫，从而造成酵母细胞
受损，生长受到抑制。
3 Met对乙醇胁迫酵母具有恢复作用。Met 可以提高乙醇胁迫导致的酿酒酵母细胞
-存活率下降，菌落形态变小，提高膜完整性，降低O2· 和H2O2水平，提高乙醇产率。
说明Met可以通过清除过量的ROS，降低乙醇胁迫对酵母造成的损伤。
4 自噬参与了乙醇对酿酒酵母的胁迫。自噬抑制剂3-MA可以有效的降低10%乙
-醇对酵母菌落的抑制，提高膜完整性，降低O2· 和H2O2水平，而自噬诱导剂雷帕霉素-进一步加剧了乙醇对菌落生长的抑制，降低膜的完整性，提高O2· 和H2O2水平。说明
自噬参与了乙醇对酿酒酵母的胁迫，其机制有可能是高浓度乙醇诱导自噬产生，引起
-O2· 和H2O2等ROS水平上升，导致氧化胁迫，从而造成酵母细胞受到胁迫。
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