农杆菌介导的ZmHSD1基因转化玉米自交系

农杆菌介导的ZmHSD基因转化玉米自交系

糖皮质激素是一类动物激素， 参与糖、 脂肪和蛋白质的生物 合成和代谢等过程，还具有抗炎的作用[1]。11B -羟基类固醇脱 氢酶(11 B -hydroxysteroid dehydrogenase , 11 B -HSD)是调 节糖皮质激素的关键酶， 它促进活性糖皮质激素与非活性激素之 间的相互转换 [2，3]。虽然目前在植物中还没有鉴定出 11B -HSD， 但是随着拟南芥基因组测序工作的完成，

发现了八个类似HSD的

基因。最先鉴定出的是一种油菜籽 HSD它在利用ABA类似物抑 制种子萌发的过程中过量表达 [4] ；Jolivet 等[5] 证实在芝麻和 油料作物中只存在微量的 HSD这些HSD编码的蛋白表现出与 NADP所依赖的11 B -HSD 17 B -HSD/17 B -类固醇脱氢酶相同的 性能⑹。AtHSD1基因包括6个外显子和5个内含子，它编码的 蛋白由389个氨基酸组成，李凤玲等[7]将AtHSD1的cDNA连接 到35S启动子后整合到拟南芥中，发现转基因植株明显比野生株 粗壮，其分支和长角果的数量也明显增多，转

AtHSD1基因植株

的表型与过量产生BR或过量表达BR受体基因BRI1的表型一致 [8〜10];同时发现转基因植株的抗盐性比野生植株高 [7]。因此， 该基因在改善农作物植株生长、提高产量方面有很大的潜力。

本研究利用农杆菌介导的遗传转化方法，尝试将 ZmHSD基 因转入玉米自交系品种， 以期获得转基因玉米植株， 拓宽玉米种 质的遗传背景，为高产稳产玉米品种的选育服务。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料玉米( Zea maysL. )自交系 18-599 、齐 319 和昌 7-2 。

1.1.2目的基因、载体、菌株 ZmHSD表达载体由山东农业 大学生命科学学院基因工程实验室构建。 表达载体中， 目的基因 为ZmHSD,其启动子为Ubi ;筛选标记基因为 NPTI，其启动子 为CaMV35(图1)。本研究所用质粒为 PZP211,大肠杆菌菌株 为DH5况，农杆菌菌株为 LBA4404

1.2 试验方法

1.2.1培养基在N6改良培养基[11]的基础上，添加 0.25

mg/L Na2MnO3 0.025 mg/L CuSO4 • 5H2O 和 0.025 mg/L

CoCl2 • 6H2O

1.2.2 幼胚愈伤组织受体系统参照孙庆泉等 [11] 的方法，取 幼胚接种于诱导培养基上，24〜25 C暗培养，

继代，选择诱口型 愈伤组织为转化受体。

1.2.3 农杆菌介导的遗传转化

①

将低温保存的农杆菌菌种

农杆菌的培养与活化：LBA4404

接种到添加25 mg/L Spe的YEB固体培养基平板上，挑取单菌落 接种于含 25 mg/L Spe 的 YEB 液体培养基中，置于摇床上预活 化(28C, 200 r/min )，取预活化的菌液培养至对数生长期备 用。

② 愈伤组织浸染： 浸染前将新培养的菌液离心沉淀菌体， 用 液体N6培养基重悬，并稀释到所需0D值。将□

型愈伤组织分离 成米粒大小的小块， 投放到稀释好的菌液中浸染。 用灭菌的滤纸 吸干愈伤表面的菌液， 并将其摆放到共培养培养基上暗培养 3 d， 用头孢水洗菌。将洗好的愈伤放到恢复培养基上恢复培养。

③ 抗性愈伤的筛选、 分化和再生： 恢复培养后的愈伤组织依 次转移到 1次、2次、3 次筛选培养基上，进行抗

性筛选，筛选 剂为巴龙霉素。将筛选后存活的愈伤转到分化培养基上分化成 苗。分化苗苗高4〜5 cm时转到生根壮苗培养基上。当苗适度生 根后转到基质（基质：蛭石=1 ： 1）中。成活植株转到大田隔离 区。

1.2.4转基因植株的PCR佥测CTAB法提取基因组DNA对转 化植株、阳性对照（质粒）和阴性对照（未转化植株）进行 PCR 检测，检测对象为目的基因 ZmHSD和标记基因NPTI。根据已 知的ZmHSD基因序列，利用primer premier 5.0软件设计ZmHSDI 的引物，上游引物在启动子内部，下游引物在编码区内，

S：

CACGATTCTTCCTCGGCTC， CTAC：T TGCTACTCCTTCCTTTCCTG；GCT 标记基因 NPTI 的弓I物为 S: GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTG AGCTCTTCAGCAATATCACGGG引物由上海生工生物工程公司合 成。用25卩l PCF反应体系。扩增反应程序：94C预变性5 min;

94C变性1 min , 59C退火50 s , 72C延伸50 s , 35个循环； 72C终延伸10 min ; 4C保存。1%琼脂糖凝胶、1%TBEt泳缓冲

液电泳，溴化乙锭染色，紫外分析，拍照。

2 结果与分析

2.1 转基因植株的获得

将玉米幼胚（授粉后10〜15 d ）接种于诱导培养基上，诱 导出胚性愈伤组织（图 2-1 ，2-2 ，2-3 ）；将经农杆菌浸染后的 愈伤（图 2-4 ），恢复培养 1 周，愈伤组织生长状态有所改善， 转入筛选培养基筛选， 1 轮后有些愈伤开始变褐， 3 轮后大部分 未转化愈伤褐化死亡， 愈伤组织上出现的小块鲜活愈伤组织突起 基本上为抗性愈伤，抗性愈伤在筛选培养基上生长正常

（图

2-5 ） ；将经过 3轮筛选的愈伤转到分化培养基上光照培养， 25 d 后愈伤表面开始出现绿色芽点， 之后绿色芽点逐渐分化成巴龙抗 性苗（图 2-6 ）；将幼苗转到生根壮苗培养基上（图 2-7），使 苗生根，期间有少量白化苗出现； 待苗长出 2〜 3条根、高约 10〜 15 cm时，打开封口膜，炼苗 5 d后移栽花盆 （图2-8） ; 3周 后移栽转基因隔离区，开花期进行人工自交结实（图 2-9 ）；最 终获得转基因种子（图 2-10 ）。

2.2 转基因植株分子检

测

221目的基因ZmHSD的PCR检测利用ZmHSDl物对抗性 苗基因组DNA进行PCR检测，有33株抗性苗出现与阳性对照一 致的 444 bp 的特异性扩增条带（图 3），表明该 33 株转基因植 株已将外源基因整合到基因组中。

2.2.2标记基因NPTH的PCR检测对已知阳性转基因植株的 基因组DNA进行标记基因NPT □的PCR扩增，均得到与阳性对 照一致的 650 bp 的特异性扩增条带（图 4），表明目的基因 PCR 检测的阳性株也全为标记基因阳性株。 对标记基因的检测可以排 除玉米基因组中ZmHSD基因的干扰。

3 结论

3个供试玉米自交系 18-599 、齐319和昌 7-2 的幼胚都能诱 导产生H型愈伤组织，其中18-599所获愈伤组织质量好、数量 多，适于大量转化；齐 319 和昌 7-2 愈伤颗粒松散、质量不高， 尤其是昌 7-2 ，胚性愈伤数量较少。

经农杆菌转化共得到899株转化株，通过PCR佥测初步证明 有 33株为阳性转化植株， 其中 18-599 有 686株转化株， 阳性株 21 株，转化效率为 3.06%；齐 319有 183 株转化株，阳性株 10 株，转化率为 5.46%；昌 7-2 有 30株转化株，阳性株 2 株，转 化率为 6.67%。

最终获得ZmHSD转基因玉米T1代种子，为玉米优良品种的 选育奠定了基础。