lncRNA ASB16-AS1在结直肠癌组织中的表达及对结直肠癌细胞增殖的影响

JOURNAL OF GUIZHOU MEDICAL UNIVERSITY

Vot.49 No. 52210. 5IncRNA ASB16-AS1在结直肠癌组织中的表达及

对结直肠癌细胞增殖的影响*

石峰9,唐青9,魏晓为4…（9.阜宁县人民医院，江苏盐城22/902； 4南京医科大学附属南京医院肿瘤内科，江苏南京012006-［摘 要］目的：探讨IncRNA ASB16-TS1在结直肠癌（CRC）中的表达及其对CRC细胞增殖的影响。方法：采

用逆转录定量PCR（qRTSCR）检测26对CRC及其配对癌旁组织、5株CRC细胞（HTS9、SWS80、SWS24及

LOVO）中IncRNA ASB16-TS1的表达，选择2株IncRNA ASB16-TS1表达最高的CRC转染ASB16-TS1干扰片段

作为干扰组，实验设置对照组（不转染）及阴性对照组（转染阴性对照干扰片段），采用CCKT法检测转染0、24、

48、72及96 h时细胞的增殖情况,qRTTCR法检测转染48 h时细胞miDT85Tp表达;将含有ASB16-TS1野生型

序列或突变序列的质粒与miRT85Cp mimic或阴性对照mimic共转染至223T细胞，转染24 h后采用双荧光素

酶法检测各组细胞的荧光强度，观察IncRNA ASB16-AS1对miRT85C的调控作用。结果：qRTTCR结果显示，

IncRNA ASB16-TS1在CRC组织中的表达水平显著高于癌旁组织（P <0.01）, CRC细胞HTC9及LOVO中 IncRNA ASB1 6-TS 1的表达水平显著高于SWS30及SWC20（P <0.0 1 -;与阴性对照组比较，转染ASB1 6-AS 1干

扰片段的HTS2和LOVO细胞中IncRNA ASB16-TS1的表达水平显著降低（P <0.01）;转染43 h开始，干扰组

HTC2和LOVO细胞的增殖水平显著低于阴性对照组（P<0. 05）；转染43 h时，下调ASB16-TS1后细胞中miR-

185Ty表达水平显著升高（P<0. 05）;双荧光素酶结果显示，野生型ASB16-AS1和miRT85Cp mimic共转染，显

著降低223T细胞中双荧光素酶的活性（P <0. 05） o结论：CRC的发生发展的机制与IncRNA ASB16-TS1上调有 关。［关键词］长链非编码RNA； ASB16-TS1；结直肠癌；细胞；增殖；miRT85Ty；转染；双荧光素酶［中图分类号］R735. 3

［文献标识码］A ［文章编号］1000-5707（2016）10-1167-26DOI：10. 5367/j. cnkl. 1000-5707. 2016.10.010The Expression of IncRNA ASB16-AS in Colorectat Cancro Tissurt and Its Effects on the Proliferotion of Colorectat Cancer CeltsSHI Fecy1, TANG Qing1, WEI Xiaowel2（4. Fuuina Peop-r d Hospital, Yancaertg 224000, Jiangse, China ； 2. Dedartment of Oacolofy, Nanjing Firsi

Hospita- cf Nanjing Medical Universita, Nanjing 210000, Jiangsp, China -［Abstroct ］ Objective: To evalnale the expressios of IncRNA ASB16-TS9 in colorectal cancer（CRC - Ussues and Livestipale the effect of IncRNA ASB16-AS9 ox the ppliFotWa of CRC cePs.

Method: The expressios of IncRNA ASB16-TS9 in 26 pairs of CRC and paraplastlc Ussues were

detemiineP Up qRT-ZCR. The expressios of IncRNA ASB16-TS9 in 9 CRC cell lines was also

detecteC. The two IncRNA ASB5平SlSmhsxposspO cells were transfecteX with IncRNA ASB16-TS9 siRNA or NC siRNA, ospectmPy・ Celt poliferatios activities in 9 h, 24 h, 45 h, 72 h or 96 h were examineX Up CCK-S /soy. Dual-Cuciferaso repo/ar /soy was also useX to screes micoRNA response

emmecis of miR-155-Sp in IncRNA ASB16-TS9. The expressios of miR-155-Sp was also detecteC.* ［基金项目］国家自然科学基金面上项目(8573240)；江苏省自然科学基金面上项目(BK22181118)；南京市卫生青年人才第二层次* *通信作者 E-mail：5sww@ 125. com网络出版时间：425 -10 -22 网络出版地址：htta：//4ns. cnki. net/4cms/4etaim42.1 lH. R. 22151022. 2303. 016. h—i1169贵州医科大学学报44卷RcsuIS : The level of IncRNA ASB6胶S1 was significantly incmiP in CRC Ussuvs compared with

paraplastlc tissues (P <0.01). HT-22 and LOVO cells showed the highest level of tncRNA ASB16-AS1 in the 9 CRC cell linp. Transfect with IncRNA ASB16胶S1 siRNA signifUitly inhibited eel­

proliferation in the 2 CRC cells when compared with the NC siRNA transfected cells- The expression of

miR-S75-Sp was significantb up-repulated by the inhibition of IncRNA ASB16胶S1 (P <0. 01). Moreover, dual-Cuciferase repoDvr isay showed that co-transfection with wild Wpv IncRNA ASB16- AS1 and miR-S75-Sp mimlc significantly reduced the relative luciferase acPUtv when compared with

the other gmups. Conclusion: IncRNA ASB16-AS1 is cUsety related tv the occarrenco anddpebpmpt of CRC, IncRNA ASB6胶S1 may be a novel target in the prevenPon and Dextment

oeCRC0[Key woOt] LncRNA； ASB16-CS1; colorectal cancer; cell; proliferation; miR-S75-Sp; transfection;

diluciferase结直肠癌(colorectal cancvr, CRC /是全球最常 性疾病史o在患者签署知情同意书后于术中收集

CRC组织及距离肿瘤边缘5 cm以上的结直肠组

见的消化道恶性肿瘤之一。随着我国生活水平提

高及饮食结构改变，CRC在国内的发病率及死亡 率逐渐上升，位居全部恶性肿瘤的第4位[)05]o随

织作为癌旁样本，取材后迅速置于-85 C冷冻保 存,术后病理检查均诊断为肠腺癌。1.1.2 细胞株 人CRC细胞株(HT钙9、SW钙89、

着医疗技术的发展,大多数CRC患者可以及时的

进行手术治疗，但其平均存活率仍然小于37个 月⑷，因此，深入探索CRC的发病机制并寻找潜在 的治疗靶点具有重要的临床意义。长链非编码 RNA( Un/-2on coding RNA7ncRNA)是一类长度大

SW-222及LOVO)以及T223细胞均购自上海中乔

新舟生物科技有限公司，细胞均培养于含有6%

胎牛血清及1 %双抗的高糖DMEM培养液中，细胞 置于37 C含有5% CO/培养箱中培养，每2 ~3 d 传代1次,取对数生长期的细胞进行后续研究o1.1.3主要试剂 细胞培养液及胎牛血清均购自

于220个碱基的非编码RNA,其在细胞增殖、凋 亡、侵袭及转移的过程中起着重要的作用[5-0]o近

期研究显示,LncRNA ASB16-AS1在恶性胶质瘤组 织中表达量显著升高,提示与肿瘤发生发展存

Gibco公司，IncRNA ASB16-CS1干扰片段及阴性

对照干扰片段购自上海吉玛基因公司，Lipo-

fectamino RNAiMAX、Opti 及 Lipofectamino 2200 转

在潜在的关联，但其在CRC中的作用尚未见报道。

本研究首先检测了 LncRNA ASB16-CS1在CRC组

织及其配对的癌旁组织中的表达,再采用特异性干

染试剂购自Invitropen公司；总RNA提取试剂及逆

转录试剂盒购自TaKaRa公司，SYBR Green逆转录 定量 PCR(qRT-PCR) MU 购自 TOYOBO 公司,

CCK-C检测试剂购自碧云天生物技术有限公司，双

扰片段下调了 4株CRC细胞中ASB16-CS1的表

达，比较4株CRC细胞的增殖情况及miR-S85钙p 表达;将含有ASB16-CS1野生型序列或突变序列

荧光素酶检测试剂盒购自Promeya公司。1.2方法1.2.1 qRTCCR 按照试剂盒说明书提取组织及

的质粒与miR-65-5p mimlc或阴性对照mimlc共

转染至223T细胞,采用双荧光素酶法检测转染24

h后细胞的荧光强度，观察IncRNA ASB16-CS1对

细胞总RNA,并逆转录成cDNAo采用SYBR

Green qPCR MU 进行 qRT钙CR 反应，以 GAPHD 作

miR-S55-S的调控作用，探讨ASB16-AS1与CRC

发病的关系。1资料与方法1.1资料1.1.1 患者资料 选取2216年1月-206年12

为AAB6FS1的内参照，以U6作为mff-65-5a的 内参照，采用20(AACW法计算ASB6-FS1及miR-

185-5pmRNA的相对表达量。研究所用引物序列

见表1。1.2.2细胞转染 ASB16-CS1的干扰靶点为5'-

月行手术治疗的CRC患者22例,其中女6例、男

6例，平均年龄(61.0 ±&5)岁；所有患者在手术

GGTTCTGAATC ATTC AGTT二-将此序列 打乱后，选

择不干扰其他基因表达的序列合成阴性对照干扰

前均未经过放化疗，无家族性肠息肉病史、肠道慢

1165序列。将细胞接种于2孔板，待细胞长至85%时,5期石峰等1/cRNA ASB15-TS1在结直肠癌组织中的表达及对结直肠癌细胞增殖的影响1.2.4双荧光素酶实验 分别将含有ASB15-TS1

采用Lipofectamiha 2200转染试剂进行细胞转染o表1 qRTTCR引物序列Tad. 1 P/mar sepnences io qRT-ZCR基因名ASB16-259野生 列和其突变序列的质粒与miRT85T6 mimlc或者阴性对照mimlc共转染至293T细胞,

物列正向 5,- CGGCCCTGAGGCAAACATACC，反向 5-t TGAAACACTGCGCCAACTTCC-正向 4-ZCTGACCTGCGTGTGGACTC-反向 5-t GCTGTGGATGGGGAGGTGTCC-正向 5,-TGAGGAGCCGATCACGTCC-反向 5 - -GTGCCGGTGCAGAGGTT -正向 GCAAGGATGACACGCAAATTCGCGAGCACAGAATTAATACGAC采用双荧光素酶检测试剂检测转染24 h时的荧光

o以荧光素酶的荧光

为内参，分 组荧光素酶的活性。1.2统计学分析GAPDH数据采用SPSS 16. 0软件进行统计分析。计

数资料采

miR285-2p数± （、土 i表示，数据比较采单因素方差分析,两两比较采用t检验,P<0.05

计学意义。U6时认为差异

转染29 h后采用qRTTCR验证转染效率。实验

2结果2.1 LncRNA ASB16-TS1 表达设置对照组（不转染）及阴性对照组（转染阴性对

照干扰片段）1.2.3细胞增殖检测 采用对数生长期的细胞进

如图1A所示，qRT-ZCR检测结果显示, ASB16-TS1在CRC组织中的表达水平显 于配

行实验,将细胞 5 000个/孔的密 种于99板，每 入完全培养液50 pL。分别在细胞

对癌旁组织，差异具 计学意义（P<0.01）o在

4 株 CRC 细胞（HTC2、5WC82、5WS22 及 LOVO）

转染后的0、24、48、4及96 h时，加入CCK-S试剂 5 pL孵育细胞2 h,最后

A

组细胞450 nm处中,ASB5平S1表达水平最高的为HTS2及LOVO

细胞（图IB）,因此选择这2株细胞进行后续实验。B

0.08 -<系W坟S

-SVI9IHSV

S-0.06 -0.04 ■:>

*ygtI¥S«VI9£sv

.o2. 2 ASB16-TS1干扰效率采用ASB16-TS1 ;

LOVO细胞，结果如图2所示，转染24 h时,与阴性

对照组比较，转染ASB16-TS1

和LOVO的细胞中ASB16-TS1表达水平均显著降

（P<0.01）,提示该干扰片段能 显著下调HT-

22和LOVO细胞中ASB16-TS1的表达水平，可以

VNHOUI0.02 -

VNHOUI0.00 -ao

古

注:A为人CRC,B为CRC细胞；（1与癌组织比较,P < 0. 09

图 1 UicRNA ASB16-TS1 的表达（qRT-ZCR）Fig-1The expression of 1/cRNA ASB16-TS12.2干扰ASB16-TS1对CRC细胞增殖的影响转染ASB16-TS1干扰片段后，采用CCKS法

分别转染HTS2和检测对HTS2和LOVO细胞增殖的影响，结果如图

5所示，与阴性对照组比较,ASB5TS5

的HTS248、52及99 h时，HTS9和LOVO细胞的增殖能力均显

，差异

LOVO 的 o计学意义（P<0.21），提示下调ASB16-TS1能够显著抑制CRC细胞株HTS2和

1169贵州医科大学学报44注:A为HT-27细胞,B为LOVO细胞；(1)与阴性对照组比较,P <0. 01

图2 ASB16-CS1的干扰效率验证(转梁24 h)Fig. 2 Veh/cabon of Ubhppi PPUpcy of ASB16-CS11.00.8* ASB16-AS1 干扰组*阴性对照组♦对照组B心* ASB16-AS讦扰组*阴性对照组〒0.8 -♦对照组

0.6§ 0.41(1)尹6⑴0.4・0.20.0-1_r0.2-0.0 J_r0024 48时间(h)

72 962448时间(h)72 96注:A为HT-27细胞,B为LOVO细胞；(1)与同时点阴性对照组比较，P < 0. 01。

图5 干扰ASB16-CS1对HT-29和LOVO细胞增殖的影响(CCK-C法)Fig. 1 The effects of ASB16-CS1 UbhPpco on HT-27 and LOVO cell proliferation酸JTo LucRNA是指 超过220个碱2. 2 干扰ASB16-CS1对miRC85钙表达的影响采 荧光素酶检测ASB16-CS1与miR-175- p在293T细胞中的结合关系，结果如图4所示，含 基的非编码RNA,最近的研 lucRNA在各种病理生理过程中 挥了重要作用[16],其在肿瘤有野生型ASB16-CS1片段的载体和miR-175-ap mimlc共转染的细胞，其荧光素酶的活性显 于 生发展中的作用尤其 关注，其中包括 CRC[I)-12 ] o CRC, 上皮细胞发展为恶性肿瘤的过程涉及多种 生长机制的破坏，包括细胞增、分化及凋亡等[7 ] o异常的细胞 为是其他各组，差异 计学意义(P <0.01),提示转染的HT-ASB16-CS1上存在有miR-175-ap的特异性结合序

列。本研 在ASB10-CS1 -

27 及LOVO细胞中检测了 miR-175-ap的表达，结

肿瘤细胞的 ，因此,3 细胞的 成为抗肿瘤研究的关键，也是研究抗CRC的关键。

lucRNA对CRC增殖的影响正逐渐受到重视,(ncRNA

果如图5所示，下调ASB16-CS1后HT-29及LOVO 细胞中miR-175-ap的表达水平显

miR-175-ap 的表达。，差异有MALAT1[1/]、lucRNA RP4ja、lucRNA SNHG1、lu- cRNA CRNDE[17], LncRNA-CK001655[17]等多个 In­

统计学意义(P<0.01)，提示ASB16-CS1能够调控

cRNA 在CRC的病理性增殖过程中发挥了 lucRNA ASB16-CS1，下调ASB16-CS1能够抑了重要作用o本研究也

3讨论研究发现，人类大多数基因组被转录成非编码在CRC组织中表达

制CRC细胞HT-22和LOVO的增殖及miRC85-5o

的表达，并且ASB16-CS1上具有miR-175-ap的特5期石峰等IncRNA ASB16-TS9在结直肠癌组织中的表达及对结直肠癌细胞增殖的影响A

.o⑴工

⑴工

■

野生型+NC mimic oon

突变型+NC mimic

野生型 +miR-185-5p 突变型 +miR-185-5pB 野生型 ASB16-AS1miR-185-5p突变型 ASB16-AS15ZccucccuugGACUCUCUCUCCc3Z5ZI II lllllll3,5'aguccuugaCGGAAAGAGAGGuccucccuugGACUCCTGTAITc3'注:A为双荧光素酶结果,B为2种ASB16-TS1与miRT85Cp结合关系；5与野生型ASB16-TS1 +

miR-185Cp mimic 组比较,P <0. 01。图4 ASB16TS9与miD-155-s在293T细胞中的结合关系(双荧光素酶法)Fig- 2 Combinatios of ASB5-TSland miD-S55-p in 223T cellsA

B

6

幣盖*蛊

dsls4

oo2

注:A为HTC2细胞,B为LOVO细胞；45与阴性对照组比较,P < 0. 01。

图5 下调ASB16-TS9后HTS9及LOVO细胞中miRT85Cy的表达水平(qRT-ZCR)Fig. 8 The expressios leveis of miR-155-Sp in HTS2 and LOVO cells after down repulatios of ASB16-TS9异性结合位点。这些结 ，高表达的ASB15-下游靶基因的表达［01-20］o本研究的结果也显示

ASB16-TS9上具有miRT85Ch的结合位点，下调 ASB16-TS9 后，2 株 CRC 细胞中 miRT85Cy 的表

I—Hyu!o

AS9可能促进了 CRC细胞的 ,ASB16-TS9可

作为CRC潜在的预后生物 物以及治疗靶点。

张德龙等［2］在胶质瘤细胞中的研 ，IncRNAASB15-TS9显 进了细胞的 、迁移及侵袭。

达显 o 林等［25］的研究也证实与癌旁组结合本研究结果，推测IncRNA ASB16-TS9可能是

一个促肿瘤的IncRNAoLncRNA的作用机制十分 ，他们可以与 DNA、蛋白、mRNA或者miDNA结合，调控它们的

织相比,miRT85Cp在CRC组织中表达显 低,并且其在 结转移组织中的表达水 于无淋结转移的组织。此外，上调miRT85Cy能 I 制CRC细胞的 并且减少myc、3ycUnD9等促肿瘤基因的表达44。结合本研究结果，提示抑制

ASB16-TS9 能够释放 miRT85Cy 进

表达J4如。更进一步的研 IncRNA可以与miDNA的特异性位点结合、竞争性的调节miDNA肿瘤基因的表达2 挥抗CRC的作用。159贵州医科大学学报44综上，本研究结果表明IncRNA ASB16-CS1在

CRC组织中表达升高，下调IncRNA ASB16-CS1可

显著抑制CRC细胞的增殖。IncRNA ASB16-CS1

上具有miR-65Cp的调控位点，抑制IncRNA

ASB16-CS1 能够上调 miR-185Cp 的水平。IncRNA ASB16-CS1可能是治疗CRC的潜在靶点。4参考文献［1］

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中文编辑：吴昌学；英文编辑：丁廷森