微小RNA调控心肌纤维化研究进展

•综 述.

微小RNA调控心肌纤维化研究进展

吴艳，刘婷婷，冯凯，许昊男，汤依群

(中国药科大学，江苏南京211198)

摘要：心肌纤维化（cardiac fibrosis)是临床多种心脏疾病，如心力衰竭、心律失常、糖尿病心肌病等共同拥有的 一种病理过程。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类由16〜22个核苷酸组成，能够调控基因表达，在多种生物学 过程中发挥重要作用的非编码RNA。近年来大量研究表明微小RNA在心肌纤维化过程中发挥重要作用，本文主 要就近几年部分微小RNA参与调控心肌纤维化的研究进展做一综述。

关键词：微小RNA;心肌纤维化；调控机制中图分类号：R542.2+3文献标识码：Adoi：10.13506/j.cnki.jpr.2018.05.009

文章编号:2095-5375(2018)05-0278-005

Research progress of microRNAs regulating cardiac fibrosis

WU YanLIU TinglingFENG Kai,XU HaonanTANG Yiqun

(China Pharmaceutical University ,Nanjing 211198 ,China)

, , ,

Abstract ： Cardiac fibrosis is a common pathological process in many clinical heart diseases such as heart failure, ar­rhythmia and diabetic cardiomyopathy. MicroRNAs (miRNA) are a group of non-coding RNA composed of 16 〜22 nucleo­tides that regulate gene expression and play important roles in many biological processes.In recent years, a large number of studies have shown that miRNA plays an important role in the process of cardiac fibrosis.In this review,we mainly summa­rized the research progress of some microRNAs involved in the regulation of cardiac fibrosis.

Key words: MicroRNA; Cardiac fibrosis; Regulatory mechanism

心肌纤维化主要是由心肌成纤维细胞的异常增殖分化， 以及细胞外基质的各种成分合成和降解的比例失衡，导致心 脏顺应性降低，心脏机械强度和电传导功能改变，是多种心 脏疾病如心房颤动、心肌缺血、心力衰竭等的共同病理过程。 最近研究发现微小RNA( miRNA)可以通过直接或间接作用 参与心肌纤维化的发生与发展，在心肌纤维化的产生过程中 发挥重要作用。1 miRNA

miRNA是由16~ 22个核苷酸组成的内源性非编码蛋白 质的小分子RNA。由Lee等[1]在研究果蝇时第一个发现，并 将其第一■个发现的miRNA命名为Lin-4。此后，miRNAs逐 渐成为生命科学研究的热点。miRbase数据库最新数据显示 编码人类基因的成熟miRNA约2 000种。

miRNA的基因有70% ~90%位于基因编码序列的基因 间隔区，其余位于内含子序列，极少数存在于蛋白质编码区。

miRNA的生物合成过程较复杂，由多个步骤共同完成，在细 胞核内，miRNA在RNA聚合酶n的作用下转录形成初级 miRNA(pri-miRNA)，长度约为1 kb或更长（见图1)。初级 miRNA能够自身折叠形成双链发夹结构，然后在RNA核酸 内切酶n:Drosha和Dicer酶的作用下切割形成前体miRNA (约60 ~ 70个核苷酸），之后与受体输出蛋白-5 ( Exportin 5) 结合后在Ran-GTP的作用下，从细胞核内转运到细胞质[2]。 再经过核糖核酸内切酶H:即Dicer酶的剪切和修饰形成双 链miRNA复合物，最终在解螺旋酶的作用下形成miRNA的 两条链，与Argonaute(AG01-4)蛋白结合形成RNA诱导沉 默复合物，最终形成新的成熟miRNA，发挥转录后调控 作用[3]。

2 miRNA与心肌纤维化

心肌纤维化（cardiac fibrosis)是由细胞外基质蛋白（ex­tracellular matrix，ECM) 的大量堆积导致心脏组织结构的改

基金项目：国家新药创新重大专项（No.2011ZX09401-021);江苏省研究生科研创新项目（No.KYCX1Z0725)作者简介：吴艳，女，研究方向：心肌纤维化相关研究，E-mail:1979332686@ qq.com

通信作者：汤依群，女，博士研究生，副教授，研究方向：心血管相关疾病,Tel:025- 83271070,E-mail:tyq@ cpu.edu.cn

药学研究• Journal of Pharmaceutical Research 2018 Vol.37,No.5• 279 •

心功能较单纯的植入间充质干细胞明显增强，心肌纤维化程 度降低。进一步研究发现miR-133a可以通过靶向调控促凋 亡基因Apaf-1的表达抑制间充质干细胞的凋亡，这将为临 床心肌梗死后，通过移植间充质干细胞治疗心肌纤维化提供 新的方向。主动脉狭窄诱导的心肌重构，心肌细胞外基质明 显增多，进而导致心肌纤维化，由miR-133a转录后调控的血 清效应因子（serum response factor，SRF)、结缔组织生长因子 (connective tissue growth factor，CTGF)以及 I 型胶原是这一- 过程中造成心肌纤维化的关键因素。基于这一点，Renaud 等[8]研究发现，小鼠动脉狭窄术后，I型和n型组蛋白脱乙

律失常和炎性心肌病等的共同病理过程[4]。在心脏疾病过 酰酶活性增加，miRNA-133a的表达降低，给予I型和n型组 程中，成纤维细胞过度增殖分化，导致细胞外ECM，主要是胶 原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白以及纤维蛋白等的分泌大量增 加，进而引起纤维化。此外，细胞基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP)能通过降解细胞外的基质蛋白，抑制 基质蛋白的堆积在心肌纤维化的过程中具有重要作用。心 肌损伤后，转化生长因子 P( transforming growth factor-P，TGF -P)和血小板衍生因子（platelet derived growth factor，PDGF) 等促纤维介质能够促使成纤维细胞分化形成具有分泌效应 的肌成纤维细胞，进一步促进纤维化的生成。

根据有无心肌细胞缺失、坏死和瘢痕形成可将心肌纤维 化分为两类，即修复性纤维化(reparative fibrosis)和反应性纤 维化(reactive fibrosis)，修复性纤维化主要发生在心肌细胞 受损后，用于填充组织并维持心脏结构的完整性，常伴随受 损部位瘢痕的形成;反应性纤维化是在过度的心肌负荷或炎 症下引起的纤维化反应，表现为细胞外基质在心肌间质或者 血管周围的大量堆积，导致的肌束扩张，在心脏受损后两种 纤维化反应常相伴发生，共同促进心肌纤维化的发生与 发展。

目前研究表明，数千种miRNA在人体心脏中表达，其中 约60%〜70%的miRNA的生物功能与多种临床心脏疾病中 纤维化的发生发展密切相关[5]。miRNA能通过与目的基因 mRNA的3'UTR靶向结合，通过抑制mRNA的转录后翻译或 降解过程发挥转录后调控作用，参与细胞的增殖、分化、凋亡 等多种生物学过程[6]。因此，在心脏纤维化疾病中，miRNA 被认为是参与心脏纤维化相关疾病调控的关键调节因子。 下面将逐一介绍近几年部分miRNA参与调控心肌纤维化的 相关调控机制。

2.1 miRNA-133 在脊椎动物中，miRNA-133普遍来源于 双顺反子的转录过程，并且仅仅在包括心肌细胞在内的肌细 胞中表达。通过靶向作用于HAND2、SPF、MEF2A、CCND2 等基因调控心肌细胞的增殖。miR-133a是心肌中丰富表达 的miRNA，在心肌梗死及心肌肥大模型中表达下调，研究表 明miR-133a能够调控纤维化。最近的临床前和临床研究表 明间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC)是心肌成形术 潜在的可用细胞类型。然而，干细胞移植的存活率较低是目 前临床上心肌梗死的主要限制因素。就这一点而言， Dakhlallah等[7]研究发现大鼠心肌梗死后，植入间充质干细 胞并同时给予miR-133a后，间充质干细胞的存活能力以及

蛋白脱乙酰酶抑制剂SAHA后能下调CTGF蛋白的表达，抑 制胶原的分泌，且这一效果与从临床扩张型心肌病患者心脏 分离得到的成纤维细胞中效果一致，表明乙酰化作用可以通 过调控miR-133a的表达调控压力负荷诱导的心肌纤维化。 此外，Habibi等[9]的研究发现糖尿病大鼠卵巢切除后能通 过下调miRNA-133以及BCL-2等的表达减轻糖尿病诱导 的心肌纤维化。

此外，miR-133也被证实能通过作用于心肌细胞调控心 肌纤维化。Matkovich等[10]研究表明促使心肌细胞miR-133 过表达能减弱压力负荷诱导的纤维化和心肌细胞的凋亡。 Liu等[11]通过敲除小鼠miR-133a基因的实验表明miR- 133a完全丧失会导致胚胎致死性，这与心肌细胞增殖的增加 和凋亡的减少有关。并且极少数miR-133a敲除仍然存活的 小鼠出现扩张性心肌症和心肌纤维化症状。相关机制可能 涉及心肌细胞和成纤维细胞之间的相互作用，因为体外研究 发现miR-133在心肌细胞中可以直接通过作用于CTGF促 使纤维化的发生。然而，在miR-133的转基因小鼠中并没有 发现CTGF的下调，说明在这个模型中CTGF的下调与对抗 心肌纤维化的保护作用没有关系，其潜在的机制仍需进一步 探讨。

2.2 miR-29 在心肌纤维化过程中研究较多的另一个miRNA 是 miR-29, miR-29 家族包含 miR-29a、miR-29b、 miR-29c 3个成员，研究表明，他们在小鼠心肌梗死后的损伤 区域的表达均下调，与对应的靶基因结合后通过调控TGF-P 信号通路在心肌梗死后的纤维化进程中发挥重要作用。小 鼠尾静脉注射miR-29的抑制剂可促使纤维化相关基因的表 达显著降低，进一步说明其与ECM的表达密切相关。Panizo 等[12]的研究表明，miR-29b可以通过负向调控Collagen I、 MMP-2以及CTGF的表达，调控心肌纤维化。同时，Liu 等[13]也发现在异丙肾上腺素（isoprenaline，ISO)诱导的心肌 纤维化小鼠中，miR-29c的表达较正常组显著降低，胶原蛋 白及纤连蛋白等相关纤维化蛋白表达升高，给予三七皂苷治 疗后，miR-29c的表达增加，说明miR-29c在小鼠心肌纤维 化过程中发挥重要作用。此外，Xiao等[14]的研究表明间歇 性有氧运动可以通过上调miR-29a和miR-101a的表达抑 制TGF-P1通路的活化，减少心肌梗死后的纤维化和疤痕形 成。这些研究表明miR-29能够为心肌纤维化的治疗提供新

• 280 •

的治疗方式。许多研究也试图通过增加miR-29的表达阻断 ECM的堆积，但是miR-29在纤维化相关疾病中的相关机制 仍需进一步探讨。

2.3 miR-208 miR-208a是在心脏压力负荷过大的情况下 调控肌球蛋白重链（m5r〇sin heavy chain，MHC)向P-MHC转化 的心肌特异性miRNA，miR-208a敲除的小鼠不受心肌重构不 良反应的影响，说明miR-208对心脏氧化应激是必需的[15]。 Montgomery等[16]对髙盐饮食诱导的心脏疾病模型的研究表 明，miR-208a能通过阻断P-MHC，延迟心功能不全的发生， 阻断心肌肥大以及心肌纤维化的发生。此外，由于miRNA的 心肌特异性，miR-208a可以通过间接作用影响心肌纤维化， 药学研究• Journal of Pharmaceutical Research 2018 Vol.37，No.5 新的思路。

2.5 miR-199b miR-199b是另一个在损伤的心脏中表达 增加的miRNA，沉默miR-199b基因能减弱病理条件下的心 肌纤维化反应，且体内注射miR-199b抑制剂能产生相同的 结果。在主动脉狭窄和髙血压诱导的心力衰竭模型中，miR- 199b通过活化calcineurin/NFAT信号通路诱导心肌重构以 及心功能障碍的发生[24]。同时，Duygu等[25]在小鼠心肌梗 死模型中的研究表明，miR-199b在心肌梗死后表达上调，体 内给予miR-199b抑制剂后，心肌梗死后的心功能障碍以及 心肌肥大得到改善。对其机制的进一步研究发现miR-199b 可能通过靶向作用于酪氨酸磷酸调节激酶1A(dual有研究表明，miR-208a可以通过影响机体代谢调控心脏细胞 因子的分泌代谢，同时，Shyu等[17]的研究表明心肌梗死后， miR-208a通过增加内皮糖蛋白的表达，诱导心肌梗死后的纤 维化。给予阿托伐他汀或者缬沙坦等降脂药治疗后，能通过 抑制内皮糖蛋白的表达抑制心肌梗死后的心脏纤维化。因 此，探究分泌机制介导的纤维化作用同样具有重要意义。

此外，Zhou等[18]研究表明，结扎左冠状动脉造成大鼠心 肌梗死后，胶原等相关纤维化指标的表达显著上升，而miR- 208^ 的表达较正常组显著下降，荧光霉素报告基因结果表 明GATA4是miR-208b的靶点，抑制GATA的表达能抑制胶 原等相关纤维化指标的表达，说明miR-208b可以通过调控 GATA4调控心肌梗死后的心肌纤维化。

2.4 miR-21 miR-21在多种心脏细胞中均表达，其中在心 肌成纤维细胞中表达丰富并与心肌纤维化密切相关。研究 发现在小鼠心肌肥大及心力衰竭动物模型中，miR-21的表 达增加约10倍，通过多种方式促使心肌纤维化的发生。有 报道称，miR-21能通过靶向作用于Sproutyf调控细胞外信号 调节激酶/促分裂原活化蛋白（extracellular signal-regulated kinase/mitogen-activated protein kinase，ERK/MAPK)激酶活 性进而调控成纤维细胞的生长和生长因子的分泌。在这样 的情况下，miR-21能诱导心肌纤维化和心肌肥大，并且沉默 miR-21的表达以及给予miR-21的抑制剂均能通过抑制 ERK/MAPK通路的活性抑制心肌纤维化，提髙心脏功能[|9]。 miR-21还可以通过上调WWP-1的表达，抑制TGF-P1/ Smad2信号通路的活性，抑制成纤维细胞的增殖进而抑制心 肌纤维化™

。同时，He等[21]在心肌成纤维细胞的研究表明

miR-21通过靶向作用于Smad7诱导心肌成纤维细胞的增 殖，导致心肌纤维化促使房颤的发生。一项最近的研究表明 在血管紧张素诱导的心肌纤维模型中，Osteopontin可以通过 上调PTEN和Smad7的表达抑制血管紧张素-2诱导的miR- 21 表达的上调进而抑制心肌纤维化[22] 。

众所周知，心脏移植是晚期心力衰竭的唯一治疗方式， 而心肌纤维化是影响临床心脏移植的主要因素，Gupta等[23] 的研究表明miR-21可以通过激活趋化因子促使单核细胞向 成纤维细胞转化，促使心肌纤维化，在心脏移植的同时给予 miR-21的抑制剂能减弱心脏异体移植过程中成纤维细胞的 堆积以及纤维化的发生，为临床心脏移植纤维化的治疗提供

specificity tyrosine phosphorylation - regulated kinase 1A，Dyrk1a)、notch1受体以及他的配体jagged1等靶基因影响心 肌梗死后的心室重构，提示miR-199b可以通过作用于不同 的靶点参与心肌梗死后的心肌纤维化过程。

2.6 miR-125b miR-125b在纤维化心脏中表达上调，在小 鼠心肌纤维化模型中，TGF-P诱导心肌成纤维细胞转化成肌 成纤维细胞，体内敲除miR-125b能抵抗AngH诱导的血管 以及间质纤维化。进一步研究表明，miR-125通过两种独立 机制诱导纤维化，一种是直接抑制p53的表达抑制成纤维细 胞的增殖，另外一种通过与靶基因Apelin 3fUTR结合抑制成 纤维细胞向肌成纤维细胞的转化[26]。

其他能够减弱损伤心脏纤维化效应的miRNA还有miR -433、miR-146以及miR154等，Lichan等[27]的研究表明小 鼠心肌梗死后，腺病毒诱导miR-433过表达能够通过直接靶 向作用于AZIN1和JNK1，抑制TGF-P信号通路的活化，?烕 弱心肌纤维化。Wang等[28]通过对非阵发性房颤患者左心 房中10种miRNA表达情况的研究发现，仅miR-146b-5p的 表达较正常人上调，且TIMP-4的表达显著下调，胶原含量 显著增加，荧光霉素报告基因显示TIMP-4是miR-146b-5p 的靶基因。体外心肌成纤维细胞孵育miR-146b-5p及其抑 制剂可以通过影响胶原的合成与分泌过程，影响心房纤维化 的进程。Sun等[29]的研究表明miR-154可以通过直接抑制 阻黑体相关蛋白 2(dickkopf-related protein 2，DKK2)激活 Wnt信号通路活化心肌成纤维细胞，导致SMA的表达以及 胶原的合成和分泌增加。3

总结与展望

近年来，大量的临床前试验研究表明miRNA在多种心 肌纤维化疾病，如房颤、心力衰竭、糖尿病心肌病的发生发展 中发挥重要作用。miRNA在心肌纤维化中作用的研究进展 不仅让我们对心肌纤维化的发病机理有了更加深人的了解， 同时也为临床心肌纤维化的介人治疗提供新的思路。由于 目前临床上尚无治疗心肌纤维化的直接方案，因此，miRNA 对氧化应激，炎性因子以及细胞外基质蛋白等多种纤维化信 号通路的调节作用能为临床预防和逆转心肌纤维化提供新 的治疗方向。但是目前对miRNA的认识仍然比较局限，对 于如何克服miRNA的多靶点调控作用，怎样安全髙效的定 向干预特定的靶点的表达等问题仍需进一步探讨。

药学研究• Journal qf Pharmaceutical Research 2018 Vol.37，No.5参考文献：

[1] LEE R C,FEINBAUM R L,AMBROS V.The C.elegans het­

erochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell, 1993,75(5) ：843-854.[2]

LUND E, GUTTINGER S, CALADO A, et al. Nuclear export of microRNA precursors [ J ]. Science, 2004, 303 (5654) ：95-98.

[3] HUANG Y,SHEN X J,ZOU Q,et al.Biological functions

of microRNAs ： a review [ J ]. J Physiol Biochem ,2011,67 (1)：129-139.

[4] YUE L,XIE J,NATTEL S.Molecular deter^ninants of car­

(11):1831-1840.

* 281 *

[13] LIU L,NING B,CUI J,et al.miR-29c is implicated in the

cardioprotective activity of Panax notoginseng saponins a­gainst isoproterenol-induced myocardial fibrogenesis[ J] .J Ethnopharmacol ,2017( 198):1-4.

[14] XIAO L, HE H, MA L, et al.Effects of miR-29a and miR-

101a Expression on Myocardial Interstitial Collagen Gen­eration After Aerobic Exercise in Myocardial - infarcted Rats[ J] .Arch Med Res,2017,48( 1) ：27-34.

[15] VAN ROOIJ E,SUTHERLAND L B,QI X,et al.Control of

stress-dependent cardiac growth and gene expression by a diac fibroblast electrical function and therapeutic implica­tions for atrial fibrillation [ J ]. Cardiovasc Res, 2011,89 (4) ：744-753.

[5] YANG K C,YAMADA K A,PATEL A Y,et al.Deep RNA

sequencing reveals dynamic regulation of myocardial non­coding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support [ J]. Circulation, 2014, 129(9)： 1009-1021.

[6] LIU X,LUO G,BAI X,et al.Bioinformatic analysis of mi-

croRNA biogenesis and function related proteins in eleven animal genomes [ J ]. J Genet Genomics, 2009, 36 ( 10 )： 591-601.[ 7]

DAKHLALLAH D, ZHANG J, YU L, et al. MicroRNA - 133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell sur^^ival in the infarct heart[ J] .J Cardio­vasc Phar^macol,2015,65( 3) ：241-251.

[8] RENAUD L,HARRIS L G,MANI S K,et al.HDACs Reg­

ulate miR-133a Expression in Pressure Overload-Induced Cardiac Fibrosis [ J ]. Circ Heart Fail, 2015,8 ( 6 ) ： 1094 -1104.

[9] HABIBI P,ALIHEMMATI A,NASIRZADEH M, et al.In­

volvement of microRNA-133 and -29 in cardiac disturb­ances in diabetic ovariectomized rats[ J] .Iran J Basic Med Sci,2016,19( 11)：1177-1185.

[10] MATKOVICH S J, WANG W, TU Y, et al. MicroRNA -

133a protects against myocardial fibrosis and modulates e­lectrical repolarization without affecting hypertrophy in pressure-overloaded adult hearts [ J ] .Circ Res, 2010, 106(I) ： 166-175.

[ 11] LIU N, BEZPROZVANNAYA S, WILLIAMS A H, et al.

microRNA-133a regulates cardiomyocyte proliferation and suppresses smooth muscle gene expression in the heart[J] .Genes Dev,2008,22(23) ：3242-3254.

[12] PANIZO S,CARRILLO-L6PEZ N,NAVES-DfAZ M,et

al.Regulation of miR-29b and miR-30c by vitamin D re­ceptor activators contributes to attenuate uraemia-induced cardiac fibrosis [ J ]. Nephrol Dial Transplant, 2017, 32

microRNA[ J] .Science,2007,316(5824) ：575-579.[ 16] MONTGOMERY R L, HULLINGER T G, SEMUS H M, et

al.Therapeutic Inhibition of miR-208a Improves Cardiac Function and Survival During Heart Failure [ J ] . Circulation,2011,124( 14) ： 1537-1547.

[17] SHYU K G,WANG B W,CHENG W P,et al.MicroRNA-

208a Increases Myocardial Endoglin Expression and Myo­cardial Fibrosis in Acute Myocardial Infarction[ J ] .Can J Cardiol,2015,31(5) ：679-690.

[18] ZHOU C,CUI Q,SU G,et al.MicroRNA-208b Alleviates

Post-Infarction Myocardial Fibrosis in a Rat Model by In­hibiting GATA4 [ J ]. Med Sci Monit, 2016 ( 22 )： 1808 -1816.

[19] THUM T, GROSS C, FIEDLER J, et al. MicroRNA - 21

contributes to myocardial disease by stimulating MAP ki­nase signalling in fibroblasts [ J ]. Nature, 2008, 456 (7224)：980-984.

[20] TAO H, ZHANG M, YANG J J, et al. MicroRNA-21 via

Dysregulation of WW Domain-Containing Protein 1 Regu­late Atrial Fibrosis in Atrial Fibrillation [ J] . Heart Lung Circ,2018,27( 1)：104-113.

[ 21 ] HE X, ZHANG K, GAO X, et al. Rapid atrial pacing

induces myocardial fibrosis by down-regulating Smad7 via microRNA - 21 in rabbit [ J ]. Heart Vessels, 2016, 31(10)： 1696-1708.

[22] LORENZEN J M,SCHAUERTE C,HUBNER A,et al.Os-teopontin is indispensible for AP1 -mediated angiotensin II -related miR-21 transcription during cardiac fibrosis[ J].Eur Heart J,2015,36(32) ：2184-2196.

[23] GUPTA S K,ITAGAKI R, ZHENG X, et al.miR-21 pro­

motes fibrosis in an acute cardiac allograft transplantation model[ J] .Cardiovasc Res,2016,110(2) ：215-226.[24] DA COSTA MARTINS P A,SALIC K,GLADKA M M,et

al.MicroRNA-199b targets the nuclear kinase Dyrk1a in an auto - amplification loop promoting calcineurin/NFAT signalling[J].Nat Cell Biol,2010,12(12): 1220-1227.

(下转第306页）

* 306 *

毕，滤掉不溶物，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析（洗脱剂：乙酸乙 酯-石油醚= 1:5)分离，得油状物24.0g，收率93%。ESI-MS (m^z)：478.1 [M + H] + ；'H-NMR(DMSO-^,，400 MHz) S： 2.86〜3.05(4H，m，CH2CH2)，3.76(3H，s，CH3)，5.06(1H，s， CH)，5.78(1H，s，CH)，6.70(1H，d，J = 10.4 Hz，CH)，6.82 (1H，m，CH)，7.07(1H，/=10.4 Hz，fl，CH)，7.24〜7.75(8H， m，Ph).13C-NMR(DMSO-^6，100 MHz) S：31.6,51.8,52.7, 56.7，70.2, 124.4，124.5，126.4，127. 3，127.6，128.6，128. 8， 129.5，129.6，131.3,131.6,133.5,133.7,135.0,135.3,135.8, 167.5，171.8。

1.6 N-噻吩乙基(2-氯苯甘氨酸酯基）-邻氯苯乙酸甲酯盐 酸盐（6)的合成250 mL反应瓶中加入100 mL丙酮、20.0 g (0.042 mol)N-噻吩乙基(2-氯苯甘氨酸酯基）-邻氯苯乙酸 甲酯，降温至（2.5±2.5)丈，控温滴加4.1 g(0.042 mol)浓盐 酸，滴毕，于(2.5±2.5)T搅拌反应2h，抽滤，烘干，得类白色 固体 20.7 g，收率 96%。mp 345 〜347 丈。ESI-MS(m/z): 478.1 [M+H] + ;iH-NMR(DMSO-<，400 MHz) S:3.26〜3.45 (4H，m，CH2CH2)，3.76(3H，s，CH3)，5.08( 1H，s，CH)，5.80 (1H，s，CH)，6.70(1H，d，J =10.4 Hz，CH)，6.82( 1H，m，CH)， 7.06(1H，J= 10.4 Hz，fl，CH)，7.25~7.76(8H，m，Ph).i3C- NMR(DMSO-^6，100 MHz) S： 30.5,48.6,52.8,56.9,69.5, 124.4,124.6,126.6,127.3,127.6,128.5,128.6,129.4,129.4, 131.2，131.5，133.5，133.6，135.1，135.3，135.8,167.6,171.7。1.7 (2R)-(2-氯苯基）[(2S)-(2-氯苯基）[4,5,6,7-四氢 噻吩并[3,2-C]吡啶-5-基]乙酰氧基]乙酸甲酯（D)的合成100 mL反应瓶中加入15 g(0.029 mol)N-噻吩乙基（2-氯 苯甘氨酸酯基）-邻氯苯乙酸甲酯盐酸盐，11.8 g(0.15 mol) 37%工业甲醛，搅拌至完全溶解后，加热至（57.5±2.5)丈反应 3 h，TLC(展开剂：乙酸乙酯-石油醚=1:5)显示反应完毕，加 入30 mL二氯甲烷，30 mL纯化水萃取，将有机相用无水硫酸 钠干燥，减压浓缩蒸除溶剂，然后硅胶柱层析（乙酸乙酯-石 油醚=1:5)分离，得油状物12.8 g，收率90%，纯度：99.3% [HPLC 归一化法:色谱柱 Inertsil ODS-3 心8柱（4.6 mmx250 mm，5 pm)，流动相为0.96 g . LM戊烷磺酸钠-乙腈（20:

药学研究• Journal of Pharmaceutical Research 2018 Vol.37，No.580)，检测波长215 nm，柱温30丈，流速1.0 mL . min-i，相对 保留时间 1.74]。ESI-MS(m/z)：490.1 [M + H] + ;iH-NMR (DMSO-<，400 MHz) S：2.89〜3.07(4H，m，CH2CH2)，3.58〜 3.70(2H，m，CH2)，3.76( 3H，s，CH3)，5.10( 1H，s，CH)，6.50 (1H，fl，J=10.4 Hz，CH)，6.65 〜6.70(1H，m，Ph)，7.07( 1H，J = 6.4 Hz，d，Ph)，7.24〜7.32(4H，m，Ph)，7.35〜7.40(3H，m， Ph)，7.67〜7.75(1H，m，Ph).i3C-NMR(DMSO-<，100 MHz) S：21.8,52.0,52.3,54.6,70.2,77.9，124.4，124.5，126.5，127.3, 127.5,128.8,128.9,129.6,129.9,131.3,131.5,133.5,133.7, 135.0，135.3，135.9，167.6，171.6。2

结果与讨论

以右旋邻氯苯甘氨酸为原料，经六步反应得到硫酸氢氯 吡格雷杂质D，尚未见文献报道。路线总收率约为54%，产 品纯度可达99%以上，可用作硫酸氢氯吡格雷杂质研究对 照品。参考文献：[1 ]

SCHROR K. The basic phar^nacolog^^ of ticlopidine and clopidogrel[ J] .Platelets, 1993,4(5) ：252-261.

[2]

朱海彦，孙杰，张曼红.硫酸氢氯吡格雷的临床应用进 展[J].齐鲁药事，2010,29(11):674-676.

[3]

李欣，邢雪敏，颜红.硫酸氢氯吡格雷阿司匹林片的处 方工艺研究[J].药学研究，2015,34(10):584-587.

[4]

邹江，迟晓巍，王龙山，等.硫酸氢氯吡格雷位置异构 体的合成[J].中国医药工业杂志，2010,41(1):6-8.

[5]

蒋晨，李子清，陈小勇，等.硫酸氢氯吡格雷中有关物 质的合成[J].中国医药工业杂志，2010,41(5):331 -335.

[6]

梁美好，沈正荣.（+)-氯吡格雷的合成工艺改进[J]. 中国药物化学杂志，2007，17(3):163-165.

[7]

陈子明，杜玉民，鲍春和，等.氯吡格雷合成路线图解 [J].中国医药工业杂志，2002,33(4):206-208.

[8]

HENNING P，KAI G，ROLAND P，et al.New carboxylic acid amides，the preparation thereof and their use as me­dicaments ：US20050203078 [ P ] .2005-09-15.

(上接第281页）

[25] DUYGU B，POELS E M，JUNI R，et al.miR-199b-5p is

a regulator of left ventricular remodeling follow-ing myocar­dial infarction[ J] .Non-coding RNA Research，2017(2)： 18-26.

[26] NAGPAL V，RAI R，PLACE A T，et al.miR-125b is Crit­

ical for Fibroblast - to - Myofibroblast Transition and Cardiac Fibrosis[ J] .Circulation，2015,133( 3):291-301.[27] TAO L，BEI Y，CHEN P，et al.Crucial Role of miR-433

in Regulating Cardiac Fibrosis [ J ]. Theranostics，2016，6

(12) ：2068-2083.

[28] WANG J，WANG Y，HAN J，et al. Integrated analysis of

microRNA and mRNA expressionprofiles in the left atrium of patients with nonvalvular paroxysmal atrialfibrillation ： Role of miR - 146b - 5p in atrial fibrosis [ J ] . Heart Rhythm，2015，12( 5)： 1018-1026.

[29] SUN L Y，BIE Z D，ZHANG C H，et al.miR-154 directly

suppresses DKK2 to activate Wnt signaling pathway and enhance activation of cardiac fibroblasts [ J ]. Cell Biol Int，2016,40(12)：1271-1279.