您的当前位置:首页正文

Red同源重组技术研究进展

2023-05-11 来源:易榕旅网
第23卷第12期

中󰀁国󰀁生󰀁物󰀁工󰀁程󰀁杂󰀁志本页已使用福昕阅读器进行编辑。

CHINABIOTECHNOLOGY2003年12月福昕软件(C)2005-2009,版权所有,

仅供试用。

Red同源重组技术研究进展

韩󰀁聪

1,2

󰀁张惟材

1*

󰀁游󰀁松

2

(1军事医学科学院生物工程研究所󰀁北京󰀁100071󰀁2沈阳药科大学󰀁沈阳󰀁110016)

摘要󰀁伴随着分子生物学的发展,一种基于󰀁噬菌体Red重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究。Red重组系统由三种蛋白组成:Exo蛋白是一种核酸外切酶,结合在双链

DNA的末端,从5󰀁端向3󰀁端降解DNA,产生3󰀁突出端;Beta蛋白结合在单链DNA上,介导互补单链DNA退火;Gam蛋白可与RecBCD酶结合,抑制其降解外源DNA的活性。Red同源重组技术具有同源序列短(40~60bp)、重组效率高的特点。这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行,大大推动功能基因组研究的发展。关键词󰀁Red同源重组󰀁基因打靶󰀁基因工程󰀁󰀁同源重组是基因工程实验中常用的技术手段,在基因打靶和基因克隆方面具有重要作用。常规的基因打靶技术是以RecA同源重组为基础,通常需要数百碱基甚至更长的同源序列,并且重组效率较低,更由于真核基因组中大量重复序列的存在,而导致意外重排现象的发生。BAC、PAC、YAC等克隆载体的构建为基因克隆提供了有力工具,但常规的克隆操作依赖于限制性酶切位点的存在,还需繁琐的连接、纯化步骤,大大限制了对大片段基因功能的研究。近几年来,一种基于󰀁噬菌体Red重组酶作用的同源重组技术逐渐成为基因工程研究的热点之一,并取得了一系列重要进展。

Red同源重组技术的原理是将一段携带与靶基因两翼各有40~60bp同源序列的PCR片段导入宿主菌细胞,利用󰀁噬菌体Red重组酶的作用,使导入细胞的线性DNA片段与染色体(或载体)的特定靶序列进行同源重组,靶基因被标记基因置换下来(如图1所示)。PCR引物由两部分组成,靠近5󰀁端的区域为与靶基因同源的序列(约40bp),靠近3󰀁端的区域(约20bp)与模板DNA互补。这种重组技术是最近发展起来的一项可在染色体水平上进行遗传操作的新技术,只需较短的同源序列,

收稿日期:2003󰀁08󰀁05󰀁修回日期:2003󰀁11󰀁03*通讯作者,电子信箱zhangweicai@hotmail.com

而不需要特定的限制性酶切位点,即可在生物体内完成重组过程,省去了体外DNA酶切、连接等步骤。这样,在靶基因两翼序列已知的条件下就可以

通过Red重组技术对该基因进行敲除、敲入、点突变等操作,还可在靶基因的上下游加入适当的启动子和终止子序列以调节基因的表达。将含有ori复制序列的线性载体片段导入细胞,也可将靶基因克隆于载体上。实验证明,这种基因打靶技术是基因功能研究和新菌株构建的有力工具。

1󰀁Red同源重组机制

Red同源重组系统由󰀁噬菌体exo、bet、gam三个基因组成,它们分别编码Exo、Beta、Gam三种蛋白质。Exo蛋白是一种核酸外切酶,单亚基的分子量为24kD,这种蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子,中间有一中空的通道,通道的一端可容纳

[1,2]

双链DNA分子,另一端只可容纳单链DNA。Exo蛋白可结合在双链DNA的末端,从DNA双链的5󰀁端向3󰀁端降解DNA,产生3󰀁突出端。Beta蛋白是一种退火蛋白,单亚基的分子量为25󰀁8kD。在溶液中,Beta蛋白自发地形成环状结构,紧紧地结合在单链DNA3󰀁突出端,防止DNA被单链核酸酶

[3]

降解,同时介导互补单链DNA的退火,双链DNA退火完成后,Beta蛋白从DNA双链上解离下来。Beta蛋白在Red同源重组过程中起着决定性的作18

中󰀁国󰀁生󰀁物󰀁工󰀁程󰀁杂󰀁志第23卷

图2󰀁Red重组机制示意图

且重组效率远高于RecA重组。

2󰀁Red同源重组技术应用策略

图1󰀁Red同源重组技术用于基因打靶

Ha和Hb:同源重组区域;Pa和Pb:引物位点;sm:筛选标记

Red重组技术利用较短的同源序列,即可使外源DNA片段与靶标分子完成重组作用,但通常在靶标分子上留下筛选标记基因,染色体或载体上含有筛选标记,有可能影响其生物功能。Red重组技术与其它基因工程技术结合运用,有效地解决了以上问题。目前利用Red重组技术进行基因工程研究的策略主要有以下4种(如图3所示):(1)一步筛选,中间为筛选标记基因两端为同源序列的线性DNA片段借助同源序列与靶载体发生重组作用,标记基因将靶基因置换下来。线性DNA若为含有ori复制起点序列的载体片段,可通过重组作用,将靶基因克隆于载体上。(2)筛选+反向筛选,在第一轮重组中,线性DNA片段含有筛选标记和反向筛选标记两个基因,通过筛选标记基因将重组分子筛选出来。在第二轮重组中,线性DNA片段中的目的基因将重组分子上的两个筛选标记基因置换,通过反向筛选标记基因将第二轮重组分子筛选出来,常用的反向筛选标记基因有sacB、tetR、rpsL等。(3)筛选+位点特异性重组,筛选标记基因的两侧含有被Cre或FLP位点特异性重组酶识别的特殊位点,经过第一次筛选的重组分子可通过位点特异性重组酶的作用将筛选标记基因删除,但在重组分子上留下34(或36)bp的特殊序列。(4)筛选+限制性酶切反应,在筛选标记基因的两侧存在限制性酶切位点,利用限制性内切酶切割重组分子后,再将其连接。这种技术不仅可将标记基因删除,而且在重组分子上创造出惟一的酶切位点。Red同源[7]

用,它与沙门氏菌P22噬菌体的Erf蛋白、大肠杆菌Rac噬菌体的RecT蛋白、真核生物的Rad52蛋白同属一类重组蛋白家族,都具有介导互补单链DNA退火的功能

[5]

[4]

。Gam蛋白为16kD的多肽分子,可

与RecBCD核酸外切酶结合,抑制其对外源DNA的降解作用。当Beta蛋白与单链DNA3󰀁突出端结合形成丝状体后,重组机制分为两种:若参与重组的另一同源序列为没有断裂的双螺旋DNA链,单链DNA在RecA蛋白的作用下侵入双链DNA,完成重组过程,这一机制称为链侵入(strandinvasion)模型;若另一同源序列为单链DNA,Beta蛋白介导互补单链DNA退火,完成重组过程,这一机制称为单链退火(singlestrandannealing)模型,如图2所示。

由于Rac噬菌体的RecE、RecT蛋白分别具有Exo、Beta蛋白的活性,也可介导重组作用的完成,因此,Red重组又称为ET重组。Muyrers等

[7]

[8]

[6]

ET重组机制进行研究,发现只有当RecE󰀁RecT、Exo󰀁Beta蛋白配对使用时,重组才能进行。尽管RecE、RecT蛋白分别与Exo、Beta蛋白的功能类似,但当它们交叉配对使用时,重组功能无法实现。此外,Zhang等发现当RecT蛋白过量表达时,重组效率明显提高。与大肠杆菌RecA重组机制不同的是,Red同源重组不存在对RecA蛋白的绝对依赖性,避免了RecA蛋白引起的基因重排和随机重组,并[9]

第12期

韩󰀁聪等:Red同源重组技术研究进展

本页已使用福昕阅读器进行编辑。

19

福昕软件(C)2005-2009,版权所有,仅供试用。

图3󰀁Red同源重组技术应用策略

sm:筛选标记;csm:反筛选标记;sg:特定基因;A和B:同源序列

重组技术同其它DNA实验技术的组合使用,大大丰富了基因操作的技术手段。研究人员可灵活的运用这些实验技术,以达到不同的实验目的。

分别由exo、bet基因替代)、pBAD󰀁RedGam(exo、bet基因由PBAD启动子控制,gam基因由EM󰀁7启动子控制),结合Cre󰀁loxP、FLP󰀁FRT位点特异性重组技术,在质粒、BAC、PAC和大肠杆菌染色体上的多个位点完成了基因敲除、敲入、点突变等操作。在实验中,Red重组对基因打靶位点的选择无特异性要求,也没有意外重排现象的发生,这说明这种技术具有较高的适用性和准确性,可广泛应用于大肠杆

[13]

菌基因工程研究。Zhang等利用Red重组技术,使载体DNA片段(两端为同源序列,中间含有ori复制起点序列和筛选标记基因)与靶基因两侧同源区域重组,将靶基因克隆于载体上,克隆的基因无突变发生。靶基因可存在于质粒、BAC和大肠杆菌染色体上,也可是来源于酵母菌或小鼠ES细胞的基因组DNA。虽然来源于真核生物的靶基因重组效率较低,但这大大拓宽了Red重组技术的应用范围,使之成为基因克隆和亚克隆的有力工具。Yu等将部分󰀁噬菌体基因整合至大肠杆菌染色体上(如图4所示),控制exo、bet、gam三个基因的PL启动子受到CI857阻遏蛋白的抑制作用。经42󰀁热诱导后,CI857阻遏蛋白失活,PL启动子才能启动Red基因表达。这种Red重组系统的优点在于Red基因稳定地存在于染色体上,并受到严格的表达调控,避免了意外重组现象发生。尽管染[14]

3󰀁Red同源重组技术的研究进展

近年来,国内外有数个研究小组开展对Red同

[10]

源重组技术的研究,取得了一定的成果。Murphy较早利用质粒pTP223(Red基因由lac启动子控制)表达Red重组酶,使线性DNA片段与染色体发生重组,而后构建的大肠杆菌基因缺陷株KM22(󰀁recBCD::Plac󰀁betexo)重组效率大大提高,但在重组过程中需要长达数百碱基的同源序列。Zhang[9]

等筛选到大肠杆菌sbcA突变株JC9604,sbcA突变株可启动Rac原噬菌体recE󰀁recT操纵子表达,而具有RecET重组的功能。他们将一段两端与靶基因两翼同源的序列(各有42bp)、中间为药物抗性基因的线性DNA片段和含有靶基因的载体同时电转入JC9604菌株细胞,抗性基因成功地将靶基因置换下来。为在各种大肠杆菌中都能运用Red同源重组技术并且提高重组效率,Muyrers等

构建了质粒pBAD󰀁ET󰀁(recE基因置于由阿拉伯糖诱导的PBAD启动子控制下,recT基因由组成型强启动子EM󰀁7控制,gam基因由组成型Tn5启动子控制)、pBAD󰀁󰀁󰀂 (质粒pBAD󰀁ET󰀁的recE、recT基因[9,11,12]

20

中󰀁国󰀁生󰀁物󰀁工󰀁程󰀁杂󰀁志第23卷

色体上的基因是单拷贝的,但由于Red基因在PL启动子控制下表达水平较高,仍能满足重组过程的需要。利用这种Red重组系统,Yu等将大肠杆菌染色体和质粒上多个靶基因敲除。Lee等结合FLP󰀁FRT位点特异性重组技术,将Cre基因敲入BAC284H12上的Eno2基因,并利用pBR322载体从BAC上克隆长达80kb的DNA片段。更重要的是,Ellis等在研究中发现,单链DNA可与染色体上的同源序列(40~70bases)发生重组。与双链DNA重组机制不同,这种单链DNA的重组只需要Beta蛋白的作用,无需Exo和Gam蛋白参与。研究表明,单链DNA的重组效率与重组区域DNA的复制方向有关,在发生重组的区域,与DNA复制过程

[16]

[15]

中随从链序列一致的单链DNA重组效率明显高于与前导链序列一致的单链DNA,其具体机制还需进一步研究

[16,17]

。利用单链DNA重组技术,可在染

色体和BAC上进行基因敲入、置换、点突变的操

[16]

作。Ellis等在将单链DNA(70bases)与染色体DNA重组的实验中,修复galKtyr145am琥珀突变和删除3󰀁3kb长的基因片段获得了同样高的重组效率。Swaminathan等应用单链DNA重组技术修饰BAC也获得了成功。由于体外合成寡核苷酸的技术已经相当成熟,单链DNA重组技术使得染色体上的基因操作更简便易行,为进行基因工程研究提供了有利条件。

[18]

图4󰀁大肠杆菌染色体上的缺陷型󰀁原噬菌体

󰀁󰀁Datsenko等将gam、bet、exo基因置于受阿拉伯糖诱导的ParaB启动子的控制下,构建了具有高效重组功能的低拷贝质粒pKD46,加入一定浓度的阿拉伯糖,诱导质粒pKD46表达出Exo、Beta、Gam三种蛋白质,将含有抗性基因的PCR片段电转入含有质粒pKD46的大肠杆菌,在Red重组酶的作用下,PCR片段借助两端与靶基因两翼同源的序列与染色体上对应区域发生重组,染色体上的靶基因被抗性基因所替代。这种重组系统的优点在于质粒pKD46具有温敏型复制子,在高温条件下无法复制,重组完成后可升高宿主菌培养温度将pKD46从菌株中消除,以便于进一步研究靶基因的突变效应。王恒等将质粒pKD46转入痢疾杆菌福氏2a2457T中,敲除染色体上的asd基因,说明质粒pKD46的Red重组功能在其他类型宿主菌中也可发挥作用。

目前Red同源重组技术的研究主要在大肠杆菌进行,类似的基因打靶技术也可应用于酿酒酵[21][22]

母和Ashbyagossypii的基因敲除研究,在这些微生物中可能存在着类似Red重组酶的蛋白。

[17]

Zhang等构建含有red󰀁(bet)基因的载体pcDNA󰀁red󰀁󰀁PGK󰀁neo,将其转入小鼠ES细胞,电转入两侧各含28个碱基同源序列的单链DNA,成功地将neo基因突变修复,这说明单链DNA重组技术在真核生物细胞中也可以实现。随着研究的深入,Red同源重组技术也将应用于高等生物基因组研究,从而*[20]

[19]

在后基因组时代,大大推动功能基因组学研究的发[23]

展。

4󰀁结󰀁语

30年前,限制性内切酶的发现给分子生物学带来革命性的变化并导致现代基因工程的诞生。随着基因工程研究的不断深入,酶切位点的依赖、繁琐的实验操作、较低的重组效率极大限制了功能基因组研究的发展。Red同源重组技术是一种新型的基因打靶技术,具有同源序列短、重组效率高、适用范围广和操作策略灵活的特点,它的诞生是遗传工程领域的一场革命,为研究基因结构与功能、表达与调控、转基因及基因治疗等提供有力的工具。

参考文献

󰀁[1]CarterDM,RaddingCM.Theroleofexonucleaseand󰀁proteinof

phage󰀁ingeneticrecombination.󰀁.Substratespecificityandthemodeofactionoflambdaexonuclease.JBiolChem,1971,246(8):2502~2512

󰀁[2]KovallR,MatthewsBW.Toroidalstructureoflambda󰀁exonuclease.Science,1997,277(5333):1824~1827

󰀁[3]MuniyappaK,RaddingCM.Thehomologousrecombinationsystem

ofphage󰀁.Pairingactivitiesof󰀁protein.JBiolChem,1986,261(16):7472~7478

󰀁[4]PassySI,YuX,LiZ,etal.Ringsandfilamentsof󰀁proteinfrombacteriophage󰀁suggestasuperfamilyofrecombinationproteins.ProcNatlAcadSciUSA,1999,96(8):4279~4284

󰀁[5]KaruAE,SakakiY,EcholsH,etal.Thegammaproteinspecified

bybacteriophage󰀁.StructureandinhibitoryactivityfortheRecBCenzymeofEscherichiacoli.JBiolChem,1975,250(18):7377~第12期

7387

韩󰀁聪等:Red同源重组技术研究进展

21

󰀁[15]LeeEC,YuD,VelascoJM,etal.AhighlyefficientEscherichia

coli󰀁basedchromosomeengineeringsystemadaptedforrecombinogenictargetingandsubcloingofBACDNA.Genomics,

2001,73(1):56~65

󰀁[16]EllisHM,YuD,DiTizioT,etal.Highefficiencymutagenesis,

repair,andengineeringofchromosomalDNAusingsingle󰀁strandedoligonucleotides.ProcNatlAcadSciUSA,2001,98(12):6742~6746

󰀁[17]ZhangY,MuyrersJP,RientjesJ,etal.Phageannealingproteins

promoteoligonucleotide󰀁directedmutagenesisinEscherichiacoliandmouseEScells.BMCMolBiol,2003,4:1

󰀁[18]SwaminathanS,EllisHM,WatersLS,etal.Rapidengineeringof

bacterialartificialchromosomesusingoligonucleotides.Genesis,2001,29(1):14~21

󰀁[19]DatsenkoKA,WannerBL.One󰀁stepinactivationofchromosomal

genesinEscherichiacoliK󰀁12usingPCRproducts.ProcNatlAcadSciUSA,2000,97(12):6640~6645

󰀁[20]王恒,冯尔玲,史兆兴,等.用Red系统快速敲除痢疾杆菌

asd基因.军事医学科学院院刊,2002,26(3):161~164󰀁[21]LorenzMC,MuirRS,LimE,etal.GenedisruptionwithPCR

productsinSaccharomycescerevisiae.Gene,1995,158(1):113~117

󰀁[22]WendlandJ,Ayad󰀁DurieuxY,KnechtleP,etal.PCR󰀁basedgene

targetinginthefilamentousfungusAshbyagossypii.Gene,2000,

242(1~2):381~391

󰀁[23]CopelandNG,JenkinsNA,CourtDL.Recombineering:A

powerfulnewtoolformousefunctionalgenomics.NatRevGenet,2001,2(10):769~779

󰀁[6]PoteeteAR.Whatmakesthebacteriophage󰀁Redsystemusefulfor

geneticengineering:Molecularmechanismandbiologicalfunction.FEMSMicrobiolLett,2001,201(1):9~14

󰀁[7]MuyrersJP,ZhangY,StewartAF.Techniques:Recombinogenicengineering󰀁newoptionsforcloningandmanipulatingDNA.TrendsBiochemSci,2001,26(5):325~331

󰀁[8]MuyrersJP,ZhangY,BuchholzF,etal.RecE󰀁RecTandRed󰀁󰀁

Red󰀁initiatedouble󰀁strandedbreakrepairbyspecifically

interactingwiththeirrespectivepartners.Genes&Dev,2000,14

(15):1971~1982

󰀁[9]ZhangY,BuchholzF,MuyrersJP,etal.AnewlogicforDNA

engineeringusingrecombinationinEscherichiacoli.NatGenet,1998,20(2):123~127

󰀁[10]MurphyKC.Useofbacteriophage󰀁recombinationfunctionsto

promotegenereplacementinEscherichiacoli.JBacteriol,1998,180(8):2063~2071

󰀁[11]MuyrersJP,ZhangY,TesdaG,etal.Rapidmodificationof

bacterialartificialchromosomesbyET󰀁recombination.NucleicAcidsRes,1999,27(6):1555~1557

󰀁[12]MuyrersJP,ZhangY,BenesV,etal.Pointmutationofbacterial

artificialchromosomesbyETrecombination.EMBOReports,2000,1(3):239~243

󰀁[13]ZhangY,MuyrersJP,TesdaG,etal.DNAcloningbyhomologous

recombinationinEscherichiacoli.NatBiotechnol,2000,18(12):1314~1317

󰀁[14]YuD,EllisMH,LeeEC,etal.Anefficientrecombinationsystem

forchromosomeengineeringinEscherichiacoli.ProcNatlAcadSci

USA,2000,97(11):5978~5983

AdvancesintheRed󰀁mediatedRecombination

HanCong

1,2

󰀁ZhangWeicai󰀁YouSong

12

(1InstituteofBiotechnology󰀁Beijing󰀁100071󰀁2ShenyangPharmaceuticalUniversity󰀁Shenyang󰀁110016)

Abstract󰀁Withthedevelopmentofmolecularbiology,anefficientbacteriophage󰀁󰀁basedEscherichiacolihomologousrecombinationsystemhasbeendevelopedforgeneticengineering.ThesystemtermedRedconsistsofthreeproteins:Exoprotein,whichbindstoadsDNAendandprocessivelydegradeslineardsDNAina5󰀁to3󰀁direction;Betaprotein,whichbindstossDNAandpromotesstrandannealing;andGamprotein,whichbindstothebacterialRecBCDenzymeandinhibitsitsactivities.TheseRedproteinsenabletherecombinationeventsbetweenDNAspecieswithaslittleas40~60bpofsharedsequencestooccurathighefficiency.TheRed󰀁mediatedrecombinationcanbeusedtoinsert,deleteorsubstituteDNAsequencesatanydesiredpositiononatargetmoleculewithouttheneedforrestrictionenzymesorDNAligases.Furthermore,thenewformofrecombinogenicengineeringisapplicabletodirectsubcloningandcloningofDNAsequencesfromcomplexmixtures,includingbacterialartificialchromosomesandgenomicDNApreparations.TheRedrecombineeringfacilitatesmanykindsofgenomicexperimentsthathavebeendifficulttocarryoutandwillimprovefunctionalgenomicstudiesbyprovidingnewavenuesforDNAmanipulationingeneral.

Keywords󰀁Redhomologousrecombination󰀁Genetargeting󰀁Geneticengineering

因篇幅问题不能全部显示,请点此查看更多更全内容