应用PCR技术鉴定猪源隐秘杆菌的感染

３２　中国兽医杂志２０１３年（第４９卷）第９期　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　应用ＰＣＲ技术鉴定猪源隐秘杆菌的感染　榻雄标　。，李　军　，胡　帅　。，陈泽祥　，杨　威　，许力千　。，玉华琳。　踮卯　∞∞　（１．广西兽医研究所，广西南宁５３０００１；２．广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁５３０００１；　∞　蛇　弘　３．玉林博白县三元动保服务部，广西玉林５３７６００）　中图分类号：￥８５２．６　文献标识码：Ｂ　文章编号：０５２９—６００５（２０１３）０９—００３２—０２　６　０　６　Ｏ　Ｏ　０　Ｏ　隐秘杆菌（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ａ．ｐｙｏ　ｇｅｎｅｓ），又名化脓放线杆菌，是一种多形态、无运动　收稿日期：２０１２　０８　０１　基金项目：广西科技攻关项目（桂科攻０９９３００９—１）　作者简介：榻雄标（１９７８一），男，助理研究员，硕士，主要从事预防　兽医学研究，Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｕａｎ　Ｘｉ。ｎｇｂｉａ０＠１６３．ｃｏｍ　通讯作者：陈泽祥，Ｅ　ｍａｉｌ：ｘｊｓｚｅｘｉａｎｇ＠１６３．ｃｏｒｎ　性的革兰阳性杆菌。Ｒａｍｏｓ　ｌ１］根据１６Ｓ　ｒＲＮＡ基　因进行系统进化分析后将其分类到隐秘杆菌属。该　菌常导致牛ｌ２］、羊¨３　和猪发病　］，表现为肺炎、关节　炎［　。　等。近年来，猪场发病的病因及病原致病机理　钾　呈复杂趋势，尤其断奶仔猪肺炎和腿部疾病也越来　越明显，不但影响猪的生长性能，而且降低肉猪的商　品价值。２０１１年７月～２Ｏ１２年３月，广西兽医研究　１８３．５７、１４５．５３、１２７．８０，中、低剂量癸氧喹酯组均为　２．３抗球虫效果各组抗球虫指数（ＡＣＩ）见表４，　癸氧喹酯高、中、低３个剂量组的抗球虫指数分别是　低效，而高剂量为高效，药物对照组为无效。　表４各组抗球虫指数（ＡＣＩ）　组别　Ｉ　Ⅱ　相对增重率（　）　存活率（　）　病变值　０　ＯＰＧ（１０ｅ）　０　卵囊值　ＡＣ１　３４　８　１０　１．４ｌ　０．２　Ⅲ　Ⅳ　Ｖ　２．４１　２．４６　１．３６　１８　１５　Ⅵ　３讨论　预防由柔嫩艾美耳球虫引起的球虫病，使用剂量应　不低于５４．４　ｍｇ／ｋｇ体重。　本试验对照药物地克珠利抗球虫指数仅为　８９．５Ｏ，处于无效范围内，可能是试验虫株对其产生　本次试验用柔嫩艾美耳球虫洛阳分离株进行感　染，红对照组（ＩＩ组）相对增重率为４６．７７　，存活率　为６６．６７　，抗球虫指数为６９．５Ｏ，而白对照组（Ｉ　组）在整个试验期间未见异常，说明所用虫株对试验　鸡有很强的致病力。　了抗药性，洛阳地区应用该药进行鸡球虫病的预防　控制时应当特别谨慎。　参考文献：　［１］王天奇，张玲，董发明，等．鸡球虫的耐药性及解决措施ＥＪ］．云　南畜牧兽医，２００１，４：１７．　［２］索勋，李国清．鸡球虫病学［Ｍ］．中国农业大学出版社，１９９８：　８：３０６－３０７．　癸氧喹酯推荐拌料浓度为２７．２　ｍｇ／ｋｇ体重，　本试验以５４．４　ｍｇ／ｋｇ、２７．２　ｍｇ／ｋｇ、１３．６　ｍｇ／ｋｇ体　重三个浓度按饲料比拌料给药，结果除高剂量组为　高效外，中、低剂量组均为低效作用。索勋等　（２００２）Ｅ８］研究了癸氧喹酯抗柔嫩艾美耳球虫豪顿株　效果，发现以２０　ｍｇ／ｋｇ、３０　ｍｇ／ｋｇ、４０　ｍｇ／ｋｇ体重　ｒ３］　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｒ　Ｂ．Ｔｒａｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ　ｏｆ　ｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ＣＯＣ一　三种浓度拌料给药，其抗球虫指数均为１８０以上，且　试验鸡盲肠中未发现卵囊，当时认为该药为高效抗　球虫药物　］。都良业等（２００８）　研究了癸氧喹酯抗　ＡＡ肉鸡感染柔嫩艾美耳球虫的疗效，５４．４　ｒａｇ／　ｋｇ、２７．２　ｍｇ／ｋｇ、１３．６　ｍｇ／ｋｇ体重三个剂量组的抗　球虫指数分别是１８１．２９、１８２．６５和１８１．２９，且没有　发现有卵囊排出［。］。但本次试验发现高中低剂量组　均有卵囊排出，其原因尚须进一步研究。根据本次　试验结果分析，如果洛阳地区以癸氧喹酯拌料给药　３４　中国兽医杂志２０１３年（第４９卷）第９期　３分析与讨论　近年来，由于养猪模式高度集约化以及一些免　疫抑制因素对免疫系统的侵袭，导致猪场细菌性疾　病仍然很严重，病症和病程也越来越复杂。目前，临　床上能引起猪肺脏纤维渗出物或腿关节肿胀为主要　症状的病原有慢性链球菌病、传染性胸膜肺炎、放线　杆菌病、副猪嗜血杆菌病、猪鼻支原体病＿ｌ。］和葡萄　球菌病等，而化脓放线菌作为猪渗出性肺炎或关节　肿胀的直接发病病原，在国内也逐渐引起关注。猪　化脓放线菌既可由外伤和呼吸道感染引起猪化脓放　线菌既可由外伤感染引起，也可由呼吸道感染引起，　在免疫抑制因素的作用下导致严重的全身并发症。　本次试验共分离到３株病原菌，经染色形态、菌落特　征和ＰＣＲ鉴定，判定为猪源隐秘杆菌。　一般情况下，内源性病原菌能被正常菌群拮抗，　不能大量繁殖，很少表现毒力，但在应激因素、免疫　抑制疾病或缺乏某些维生素导致猪体免疫系统功能　不健全时，内源性病原菌就大量繁殖，毒力增强。本　次试验分离得到的３个菌株在临床初期也表现为关　节炎，而后期导致全身感染，提示这些分离菌株对猪　都有较强致病力，而分离菌株的致病机理也有待进　一步研究阐明。此外，为了解以猪繁殖与呼吸综合　征病毒和猪圆环病毒２型为主导的免疫抑制性疾病　与该菌在流行病学上的关系，本次试验在分离细菌　的同时，检测发病猪样品中猪繁殖与呼吸综合征病　毒和猪圆环病毒２型带毒情况，结果表明，所有分离　出猪源隐秘杆菌的病料均感染猪繁殖与呼吸综合征　病毒和猪圆环病毒２型。这说明猪源隐秘杆菌导致　猪群发病也与猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病　毒２型的感染有密切关联。众所周知，猪繁殖与呼　吸综合征病毒主要侵袭肺泡巨噬细胞，而猪圆环病　毒２型则侵害全身淋巴细胞，若单独或混合感染猪　繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒２型，猪体免　疫机能均急剧下降，猪源隐秘杆菌得以暴发式繁殖，　从而导致猪群发病。结合实验室诊断结果，猪繁殖　与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒２型均为阳性的这　３个猪场，在加强猪繁殖与呼吸综合征病疫苗和猪　圆环病毒２型疫苗免疫的２个月后，猪场生产状况　逐步进入良性循环：母猪繁殖障碍现象、断奶仔猪衰　竭综合征以及肺炎和腿部关节肿大等病症逐渐减　少。这也侧面说明只有加强这两个免疫抑制性疾病　的防控，细菌性疾病才容易解决。　目前。对猪源隐秘杆菌的鉴定主要采用细菌分　离培养，但该菌在血平板上需要３６　ｈ以上才长出明　显菌落，再进行生化和药敏试验等，将花费４～５天　时间，错过用药最佳时机。因此，本试验针对猪源隐　秘杆菌１６Ｓ　ｒＲＮＡ和溶血素（ＰＬＯ）基因合成两对特　异性引物，建立猪源隐秘杆菌ＰＣＲ检测方法，为确　诊该病提供便捷手段。研究证明，溶血素基因　（ＰＬＯ）是猪隐秘杆菌的主要毒力和抗原基因，该基　因可用作猪隐秘杆菌的临床鉴定。溶血素属于胆固　醇依赖性溶细胞素（ＣＤＣ）家族，具有溶解各种动物　血细胞的能力，包括多形核细胞和巨噬细胞。本次　试验分离到的３个菌株，检测溶血素基因（ＰＬｏ）均　为阳性，结合临床发病症状证明，这３个分离菌株都　具有较强致病性。　目前，对猪隐秘杆菌的防治仍以药物治疗为主。　３个分离菌株经过ＰＣＲ鉴定、药物敏感试验，根据　各场分离菌株对药物敏感差异性，选择阿奇霉素、左　氧氟沙星和头孢噻呋等进行防治，实施药物保健２０　ｄ后，３个猪场的肺炎和关节炎等症状逐渐减轻。但　是，仍有部分严重关节炎症状的病猪对药物治疗效　果不理想，究其原因可能是药物很难进入关节腔以　达到有效杀菌浓度，或由于脓肿特性阻止抗菌药物　对细菌杀灭，最终仍影响商品猪的经济价值。抗生　素的使用虽然能治疗细菌病，但抗生素的选择和使　用方法不对也直接影响疫病的治疗，导致细菌多重　耐药性不断增强。希望猪场能确切诊断出病原才采　取保健方案，切忌滥用、盲目用药，延误时间也容易　产生病原耐药性。　参考文献：　［１］　Ｒａｍｏｓ　Ｃ　Ｐ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｇ，Ｃｏｌｌｉｎｓ　Ｍ　Ｄ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｕｓ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　１　６Ｓ　ｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：　ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｈｏｃａｅ　ｓｐ　ｎｏｖ　Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉ—　ｌｔｌＹｔ　ｂｅｒｎａｒｄｉａｅ　ｃｏｍｂ　ｎｏｖ　ａｎｄ　Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　ｃｏｍｂ　ｎｏｖＥＪ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｓｙｓｔ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９７，４７：４６—５３．　［２］王居海，张海波，周玉龙，等．犊牛化脓隐秘杆菌性肺炎的病原　鉴定［Ｊ］．畜牧与兽医，２０１０，４２（９）：８５—８７．　Ｅ３］陈泽祥，许力干，潘艳，等．山羊肺炎病原的分离与鉴定［Ｊ］．畜　牧与兽医，２００５，３７（１２）：４１—４２．　［４３叶健毅，赵学峰，兰邹然，等．规模化猪场母猪子宫内膜炎致病　菌的分离鉴定［Ｊ］．畜牧兽医杂志，２０１１，３０（１）：５　７．　Ｅ５］鲁杏华，何世成，谈志祥，等．猪化脓隐秘杆菌的分离与鉴定　［Ｊ］．中国畜牧兽医，２００９，３６（５）：１４９—１　５１．　Ｅ６］张玉玉，吴家强，任素芳，等．仔猪多发性关节炎病原菌的分离　鉴定及耐药性研究［Ｊ］．西南农业学报，２０１２，２５（２）：６８０—６８５．　Ｅ７］荣光，王东劲，周汉林，等．１　６Ｓｒ　ＲＮＡ在兽医病原菌分类鉴定　中的应用［Ｊ］．热带农业科学，２００９，２９（１Ｏ）：４５—４９．　［８］尹秀风，姜平，邓雨修，等．副猪嗜血杆菌的分离和鉴定［Ｊ］．畜　牧与兽医，２００４，３６（７）：６－８．　［９］　王密．牛化脓隐秘杆菌性肺炎的病原分离鉴定和诊断方法的　研究［Ｄ］．大庆：黑龙江八一农垦大学，２０１０（５）：１８．　［１Ｏ］冯峰．山羊化脓隐秘杆菌的分离鉴定及其对小鼠的致病性试　验［Ｄ］．成都：四川Ｉ农业大学，２０１０（６）：２８．　［１１］郝晓芳，周艳君，田志军，等．高致病性猪繁殖与呼吸综合征病　毒ＲＴ—ＰＣＲ鉴别诊断方法的建立［Ｊ］．中国预防兽医学报，　２００７，２９（９）：７０４—７０９．　［１２］芦银华，谈国蓄，陈德胜，等．秘圆环病毒复合检测方法的建立　及初步应用［Ｊ］．农业生物技术学报，２００２，１０（４）：４１５－４１６．　［ｉｓ］榻雄标，胡帅，李军，等．应用ＰＣＲ技术鉴定猪鼻支原体的感染　［Ｊ１．黑龙江畜牧兽医，２０１１，１１（２）：１０２—１０３．