植物细胞减数分裂

一、实验目的

(1)掌握制备植物细胞减数分裂玻片标本的技术和方法。 (2)了解高等植物细胞减数分裂过程，观察染色体的动态变化。 二、实验原理

分裂是生物在形成性细胞过程中的一种特殊方式的细胞分裂，在此过程中先由有性组织(花药或胚珠)中的某些细胞分化为二倍性的小孢子母细胞或大孢子母细胞，这些细胞连续进行两次细胞分裂即减数第一次分裂和减数第二次分裂。结果一个小孢子母细胞形成4个小孢子．一个大孢子母细胞形成一个大孢子，它们都只具有单倍的染色体。

减数分裂在遗传上具有重要意义。性母细胞(2n)经过减数分裂形成染色体数目减半的配子(n)。经过受精作用．雌雄配子融合为合子，染色体数目恢复2n。这样在物种延续的过程中确保了染色体数目的恒定，从而使物种在遗传上具有相对的稳定性。另外在减数分裂过程中包含有同源染色体的配对、交换、分离和非同源染色体的自由组合，这些都是遗传学分离．自由组合和连锁互换规律的细胞学基础。在这些基本规律的作用之下，导致了各种遗传重组的发生，而遗传重组又是生物变异的重要源泉。

在适当的时候采集植物的花蕾制备染色体标本就可在显微镜 下观察到植物细胞的减数分裂。

三、实验材料

蚕豆(Vicia．faba，2n=12)花药、玉米(Zea mays，2n=20)花药、小麦(Triticum spp．2n=42)花药、大葱(Allium fistulosum 2n=16)花药、桔(Citrus sinensis 2n=18)花药、洋葱(Allium cepa 2n =16)花药、番茄(Lycopersicum escuSentum 2n=24)花药。 四、实验器具和药品

1．器具 显微镜、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、大培养皿、酒精灯、吸水纸。 2．药品 无水乙醇、醋酸洋红染液、石蜡、二甲苯、固定液(甲醇：冰醋酸：3：1)、加拿大树胶、正丁醇或叔丁醇。 五、实验步骤

1．取材 在一朵花的减数分裂的全过程中能观察染色体的时间是很短的，一般在终变期，中期I，后期I。因此，选取刚现蕾的花序是观察花粉母细胞减数分裂的关键步骤,要注意花蕾的形态和大小，适时选材。

(1)玉米 北方的玉米5月份取材，时间以上午8:30为好，夏玉米一般在7月份取材，以上午7:00一8:00为好,在玉米雌穗未抽出前的7—10天手摸植株上部(喇叭口下部)有松软感觉，表明雄花序即将抽出。用刀在顶叶近喇叭口处纵向划一刀，切口长10一15cm，剥出雄花序，顶端花药长3—5mm，花药尚未变黄时取材。

(2)蚕豆：从现蕾开始，上午10:00—11:00可选取2—3mm大小的花莆或一小段花序。蚕豆开花的次序是由下而上，由外而内。

(3)小麦：在植株开始挑旗，旗叶与下一叶片的叶耳间距约为3一4Cm,花药长度大致在1.5—2.0mm,黄绿色时取材最好。如花药为绿色时取材则为时过早,花药为黄色，则已过时。上午7:00一8:00为取材最佳时间。

(4)大葱：在北方地里越冬的大葱，第二年春季3—4月长出花序，待花序长出，颜色呈绿色，花蕾长度在3～4mm，花药长度为1—1.1mm时取材。上午9:00一10:00为最佳取材时机。

(5)洋葱：4—5月长出花序，同上。

(6)番茄：5—9月均可取材，时间以上午8:30—9:30为好，花蕾以3—4mm为宜(番茄花期持续时间长，可随时取材)。

(7)桔：桔花吐蕾时,在上午8:00一12:00取3—9mm的花蕾为宜。

2．固定 通常制作幼小花药压片时，可不经固定，直接放在醋酸洋红染液中，同时进行固定和染色，但是先经固定的材料容易着色、分色及便于保存。固定时将采集的材料置于卡诺氏固定液12—24小时，若不及时制片，可将固定后的材料用70%的乙醇冲洗直至闻不到醋酸味为止，后放入70%乙醇中存于4℃冰箱内，可随时取用。

3．染色制片 用蒸馏水将从固定液或从70％酒精保存液中取出的花蕾冲洗数遍，然后剥开花雷，放在载玻片上，用解剖针及虹膜刀将花药横切成3—4段(或纵切)，加一滴醋酸洋红染液于材料上，用解剖针轻压花药使花粉母细胞从切口出来，静止染色5—10分钟，除去花药壁。加上盖玻片使染液刚好布满载玻片与盖玻片之间成一薄层(不可过多，过多花粉母细胞会逸出盖玻片边缘)，加上盖玻片后，在酒精灯上轻微加热，以利于进一步着色和染色体的分散。在盖玻片上覆以吸水纸用拇指适当加压．把周围的染液吸干(勿使盖片移动)，若细胞质染色过深，可在盖玻片的一边滴加45％的醋酸，在另一边用吸水纸吸，让醋酸从盖玻片下流过，减轻细胞质的着色程度。

4．镜检 在显微镜下查找花粉母细胞，二分体、四分体，花粉粒以及各个时期的细胞。 5．永久片的制作 较好的临时压片，可制成永久玻片标本。

(1)将已制好的玻片浸入副盛有95％乙醇和45 G醋酸各半的培养皿中，有盖玻片的一面朝下，载玻片的一端架在玻片棒上使其倾斜，盖玻片脱落后立即把盖玻片和载玻片转入盛有95％乙醇的培养皿中3—5分钟，再转入盛有95％乙醇和叔丁醇各半的培养皿中3—5分钟，最后纯叔丁醇中3一5分钟进行脱水、透明，脱水后用溶于叔丁醇的加拿大树胶封片。 (2)由于正丁醇价格较便宜，因此也可用正丁醇代替叔丁醇。操作过程是将制好的临时玻片以同样的方法浸入盛有95％乙醇和45X醋酸各半的培养皿中5一6分钟，并滴加几滴正丁醇，依次再移入95%乙醇中1一2分钟；95%乙醇和正丁醇各半的培养皿中2—5分钟；纯正丁醇1—2分钟，最后吸去多余的正丁醇，用溶于正丁醇的加拿大树胶封片。 六、实验结果

细胞的减数分裂包括减数第一次分裂(减数分裂I)和减数第二次分裂(减数分裂Ⅱ)。 1．减数分裂I (1)前期I：

细线期：染色体很细很长，呈细线状在核内交织成网。每一染色体含两个染色单体，但显微镜下看不到双线结构．染色体呈丝状结构。

偶线期：染色体的形态与细线期差别不大，同源染色体配对，形成二价体，每个二价体有两个着丝点，染色丝比细线期粗。

粗线期：染色体螺旋化，进一步缩短变粗，显微镜下可明显看到每个染色体的两个姊妹染色单体。二价体由四个姊妹染色单体和两个着丝粒组成，这时非姊妹染色单体间可能有交换的发生。

双线期：染色体进一步螺旋化，变得更为粗短，更为清晰可见，二价体中的两条同源染色体相互分开出现交叉现象，呈“X”“V”“∞”“O”等形状。

终变期：染色体高度浓缩，染色体均匀分散在核膜附近。此时是检查染色体数的最好时期，这时核内有多少个二价体，说明有多少对同源染色体。 核仁和核膜在前期I始终存在，在终变期时核仁、核膜开始消失。

(2)中期I：核仁、核膜消失，二价体均匀排列在赤道面上，纺缍体形成，从纺缍体的侧面看，一个个二价体就像一列横队排列在细胞中，从纺锤体的极面看，一个个二价体分散在细胞质中。这时也是染色体计数的好时期。

(3)后期I：二价体的两个同源染色体分开，由纺锤丝拉向两极。染色体又变成了染色丝状。

(4)末期I：同源染色体分别到达细胞两极．染色体变成了染色质状，核膜，核仁重新出

现，形成两个子核，每个子核染色体数目减半为n。同时细胞质分开形成两个子细胞叫二分体。

2．减数分裂Ⅱ

(1)前期Ⅱ：染色体呈线状，每个染色体具两个姊妹染色单体，共用一个着丝粒．二者间有明显互斥作用(分开趋势)。前期Ⅱ快结束时核膜消失。

(2)中期Ⅱ：染色体排列在赤道面上，每条染色体有两个染色单体和一个着丝粒。 (3)后期Ⅱ：每个染色体从着丝粒处分裂为二，分别向两极移动。

(4)末期Ⅱ：移到两极的染色体解螺旋，出现核仁、核膜，形成单倍的子核，这时减数分裂I形成的两个单倍核形成四个单倍核，最后形成四个子细胞叫四分体。

理想的植物细胞减数分裂玻片标本在显微镜下可观察到减数分裂各个时期的典型细胞。 七、实验作业

绘制观察到的植物细胞减数分裂不同时期的典型细胞(示染色体动态特征)。

实验二 果蝇的形态和生活史

一、实验目的

(1)了解果蝇生活史中各个阶段的形态特征，观察果蝇的几种常见突变类型。 (2)掌握鉴别雌雄果蝇的方法。

(3)学会果蝇的饲养管理方法和实验处置技术。 二、实验原理

普通果蝇(Drosophila melanogaster)是昆虫纲，双翅目，果蝇属的一个种。具完全变态。果蝇每12天左右可完成一个世代，生活史较短，生长迅速；繁殖能力强，每只受精的雌蝇可产卵400—500个；培养果蝇的材料来源广泛，价格便宜；果蝇的生活要求简单，常温下就可生长繁育，容易饲养；果蝇不同的形态突变类型多达400以上，便于观察分析；并且染色体数目较少(2，l=8)，再加之果蝇唾液腺染色体巨大的特点，因此是遗传学研究中常用的实验材料。

三、实验材料

野生型果蝇(雌、雄)及常见的几种突变型果蝇；雌雄果蝇装片；果蝇卵、蛹装片。 四、实验器具和药品

1．器具：显微镜、双筒解剖镜、放大镜、小镊子、麻醉瓶、麻醉皿、培养瓶、白磁砖(15cm×15cm)、毛笔、酒精、石棉网、黑纸、胶水、牛皮纸。

2．药品： 乙醚、乙醇、琼脂、玉米粉、白糖、酵母、丙酸、香蕉等。 五、实验步骤

1．果蝇生活史的观察 果蝇为完全变态，生活史包括卵、幼虫、蛹、成虫四个时期，各时期持续时间的长短随温度的高低而不同，在20℃条件下从卵到成虫约为8天，蛹期为6天左右，整个生活史15天即可完成，若25 C条件下，从卵到幼虫约5天，蛹期4.2天左右，整个生活史约10天。20—25 C是果蝇生。活的适宜温度，温度过高(30℃以上)，会引起果蝇不孕或死亡，温度过低(10℃条件下)，生活史可长达57天，又会使果蝇生活力降低果蝇一般培养在恒温箱内．盛夏时要注意降温。雌性成体一般能生活4周，雄性成体寿命较短，一对亲蝇能产生几百个后代。

(1)卵：羽化后的雌蝇一般在12小时后开始交配，交配后两天开始产卵，当卵经过子宫时，精子可由卵前端的锥形突出部的小孔或卵孔进入其中，虽然有很多精子进入卵．但一般情况下只有一个精子与卵发生受精作用。其它多余的精子被雌体贮藏起来(所以杂交实验时

必须选取处女蝇，a受精卵被排出体外发育或胚胎早期就在子宫内进行。

用解剖针将附有卵的培养基取少许涂于载玻片上，或用解剖针轻压雌果蝇腹部后部把卵挤在载玻片上，用低倍镜观察。果蝇的卵约0.5mm长，椭圆形，腹面稍扁平，在背面的前端伸出一对触丝，它的作用是使卵附在培养基表面而利于发育。

(2)幼虫：卵孵化成幼虫后要经过两次蜕皮才能从一龄幼虫发育成为三龄幼虫。三龄幼虫体长约5mm，头部稍尖，位于头部的口器为肉眼可见一小黑点，口器后面有一对透明的唾液腺，通过体壁可见到一对生殖腺位于身体后半部的上方两侧，精巢较大，为一明显的黑色斑点，卵巢较小。

(3)蛹：幼虫生活7—8天准备化蛹，化蛹之前从培养基中爬出，附着在干燥的瓶壁或插在培养基的滤纸上逐渐形成一个梭形的蛹，在蛹前部有两个呼吸孔，后部有尾芽，起初蛹壳颜色淡黄柔软，经3—4天后变成深褐色，以示要羽化了。

（4）成虫：幼虫在蛹壳内完成成虫体型和器官的分化，最后从蛹壳前端爬出。刚从蛹壳里羽化出的果蝇，虫体较长大，翅还没有展开，体表也未完全几丁质化，呈半透明乳白色，不久蝇体变为粗短椭圆形，双翅伸展，体色加深，如野生型果蝇由开始的浅灰色转为灰褐色。果蝇成虫分头、胸、腹兰部分。头部有一对大的复眼、三个单眼和一对触角；胸部有三对足、一对翅和一对平衡棒；腹部背面有黑色环纹，腹面有腹片，外生殖器在腹部末端，全身有许多体毛和刚毛。

2．果蝇雌雄性鉴别 利用果蝇做杂交实验时，必须准确地识别性别，雌雄成蝇的区别有计多方面，可用放大镜，显微镜(低倍)、双筒解剖镜或直接从外形上加以辨认。

表5.1 雌雄果蝇的主要区别

雌蝇 体型较大 腹部末端稍尖

腹部背面有五条黑色环纹 无性梳

腹部腹面有6个腹片 外生殖器外观简单

雄蝇 体型较小 腹部末端稍圆

腹部背面有三条黑色环纹 有性梳

腹部腹面有4个腹片

外生殖器外观复杂，在低倍镜下 可看到生殖孤、肛上板、阴基。

3．果蝇几种突变类型的观察 果蝇的突变性状一般情况下用肉眼观察或用放大镜在培养瓶外观察或在解剖镜下观察。主要有以下稳定而明显的特征：

表5.2 果蝇常见突变性状特征 突变性状名称 白眼 棒眼 檀黑体 黑体 黄身 残翅 焦刚毛 小翅 4．果蝇的麻醉 对于成蝇和果蝇突变性状的观察以及果蝇的杂交实验分析，都必须先将果蝇麻醉使其处于静止状态后方可进行。在一软木塞上钉一图钉，在图钉上缠上脱脂棉，将此软木塞盖在一200ml的广口瓶上，即做成了麻醉瓶。再用一培养皿，在皿的底部粘上一条滤纸即做成麻醉用的麻醉皿。麻醉时，首先将培养瓶倒置，让果蝇向瓶底部运动，然后打开麻醉瓶和培养瓶塞，迅速将培养瓶和麻醉瓶口相接(麻醉瓶在下，培养瓶在上)，左手紧握两。瓶接口稍倾斜，然后轻拍培养瓶瓶壁使果蝇落入麻醉瓶内，迅速盖好两个瓶塞，或者在培养瓶与麻醉瓶对口相接后翻转位置，使培养瓶在下，麻醉瓶在上，用黑纸遮住培养瓶，果蝇因趋光向麻醉瓶运动，达到一定数量后分别盖好两个瓶塞。把乙醚滴在麻醉瓶软木塞上的脱脂棉上，盖上塞子，倒置麻醉瓶。一分钟后果蝇即处于昏迷状态，将其倾倒在用酒精擦过的白磁砖上，用毛笔轻轻拨动进行观察。当在白磁砖上的果蝇即将苏醒时，可在麻醉皿的滤纸上滴加乙醚，扣在白磁砖上进行第二次麻醉,麻醉的程度随实验需要而定。麻醉后果蝇翅外展与身体呈45℃角时，表示已麻醉过度，不能复苏。把不需要的果蝇倒入盛有酒精的瓶中。 六、实验作业 (1)绘果蝇的生活史图。 (2)绘雌雄果蝇第一对足外形图(示性梳)。 (3)野生型(十)、檀黑体(e)、残翅(vg)、白眼(w)、小翅(m)、焦刚毛(sn)，等突变类型进行观察，将观察结果填入下表： 基因符 W B E B Y Vg Sn m 性状特征 复眼白色 复眼横条形 体呈乌木色，黑亮 体呈深色 体吴浅橙黄色 所在染色体 X X ⅢR ⅡL X 翅退休，部分残留不能飞 ⅡR 刚毛卷曲如烧焦状 翅较短 X X 类型 特征 体色 眼色 翅形 刚毛形态 野生型 （十） 残翅 （vg） 檀黑体 （c） 小翅 （m） 白眼 （w） 焦刚毛 （sn） 实验三 果蝇唾液腺染色体观察

一、实验目的

(1)练习剖取果蝇三龄幼虫唾液腺的方法。 (2)掌握制作果蝇唾液腺染色体标本的技术。 (3)观察果蝇唾液腺染色体的形态特征。 二、实验原理

1881年意大利的细胞学家巴尔比尼(Balbiani)在双翅目昆虫摇蚊(chironmus)幼虫的唾液腺细胞间期核中发现了一种巨大染色体，由于存在于唾液腺细胞。所以又称为唾液腺染色体。1933年美国学者贝特恩(Painter)等又在果蝇和其它双翅目昆虫的幼虫唾液腺细胞间期核中发现了巨大染色体。

果蝇三龄幼虫的唾液腺细胞处于永久早期，染色体解旋呈伸展状态。在幼虫发育过程中细胞核中的DNA多次复制，但细胞、细胞核不分裂、复制后的染色单体DNA也不分开，这种现象叫做核内有丝分裂，从而形成了多线染色体。加之唾液腺细胞中同源染色体互相靠拢在一起呈现一种联会状态，而使其比一般体细胞中的染色体粗1000--2000倍，长100—200倍。

由于在唾液腺细胞中8条染色体之间以着丝粒互相连结在一起形成染色盘或异染中心和同源染色体之间的假联会，经碱性染料染色后，可以观察到一个染色较深的染色盘和以染色盘为中心向外辐射出的5条染色体臂。在这些染色体臂上可以看到染色深浅不同，被称做明带、暗带的横纹，这些横纹的位置，宽窄、数目都具有物种的特异性，不同物种，不同染色体的不同部位形态位置是固定的，因此根据染色体各条臂带纹特征和各条臂端部带纹特征能准确识别各条染色体。在染色体臂上还可看到某些带纹通过染色体的解旋、膨大形成的疏松区和巴尔比尼氏环，其富含转录出来的RNA，因此不着色，是基因活动的区域。在个体发育的不同阶段，疏松区或巴尔比尼氏环在染色体上出现的部位不同，据此可以研究基因的表达，开展各种染色体变异的研究等等。 三、实验材料

普通果蝇(Drosophila melanogaster)的三龄幼虫。 四、实验器具和药品

1．器具 双筒解剖镜、显微镜、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、滤纸、培养皿、酒精灯。

2．药品 醋酸洋红染液、生理盐水(O.7％NaCl)蒸馏水、固定液(冰醋酸：乙醇=3:1)、1m01／L HCl、乙醇(100％、95％)、二甲苯、加拿大树胶。 五、实验步骤

1．材料准备 发育充足、肥大的三龄幼虫，唾液腺和唾液腺细胞发育良好。利用这样的唾液腺细胞才能制备出理想的染色体玻片标本。因此要求培养基营养丰富，含水量较高，比较松软，发酵良好。

将果蝇放人培养瓶(果蝇不应过多，半磅牛奶瓶10对左右)，于15一l6℃的稍低温度条件下培养，接种1 2小时后，将成虫移出，控制成虫的排卵持续时间．以免产生过多的卵(要求每cm。培养基表面20～40只幼虫)，一龄幼虫出现后，每天在培养基表面滴加2％一4.5％的酵母液(或鲜酵母)。2—3龄幼虫期应滴加10％左右的酵母液，滴加的量以复盖在培养基表面薄薄一层为宜。待三龄幼虫大量爬出培养基时，也可将培养瓶移至3一5℃中放置12或24小时，进行低温处理，以获得染色体分散良好的制片。

2．剥离唾液腺 在一干净载玻片上滴一滴生理盐水，选择行 动迟缓、肥大、爬在管壁上即将化蛹的三龄幼虫，或者选择经低温处理的果蝇三龄幼虫置于载玻片上。由于果蝇的唾液腺位于幼虫体前1／3—1／4处，所以在解剖镜下左手持解剖针按压住幼虫后端1／3处，固定幼虫，右手持解剖针扎住幼虫头部口器处，适当用力向后拉，把头部与身体拉开，唾液腺腺体随之而出。把载玻片移到显微镜下查找唾液腺。果蝇的唾液腺是位于口器后端神经节两侧的一对透明而微白的类似香蕉形的长形小囊，由单层细胞构成，细胞大，细胞核大，细胞轮廓清晰。用解剖针先将含有腺体的一团组织与其它组织分开，然后再将腺体与脂肪等组织分开。剖离腺体也可在解剖镜下进行。

3．解离 将唾液腺在载玻片上滴一滴1mol／L HCl，让唾液腺在1mol／L HCl中解离2—3分钟，以松软组织，利于染色体分散。

4．染色 解离后的腺体可用水冲洗2—3次后滴加醋酸洋红染液染色1 5—20分钟(解剖和染色过程勿使腺体干燥)。在酒精灯上加热以增强染色效果。可以不经解离一步而直接染色，也可以在将幼虫头部与身体拉开后马上加染液染色，然后慢慢剖离腺体。

5．滴片 当腺体被染成红色后，用滤纸擦去染液周围一圈的黑色沉淀物，然后加上盖玻片，在盖玻片上方再覆盖一层滤纸，用镊子在盖玻片上轻轻敲击几下，再用拇指按住盖玻片用力下压，把腺体细胞压破，把染色体压散开。压片时放载玻片的桌面要平，不要使盖片滑动。制好的玻片标本用蜡封住盖玻片四周以防干燥。经低温冷冻处理的材料经解离，染色，加盖片后不必敲击，镜检即可看到分散良好的染色体。

6．观察 将制好的片子先用低倍显微镜观察，找到好的染色体图像于视野中心，再用高倍镜观察之。如果制片理想，可做成永久制片，即先剔除封蜡，将玻片放入固定液(冰蜡酸：乙醇=3:1)中待盖片脱落后，再经

5分钟5分钟5分钟5分钟70%395%乙醇3100%乙醇(1)3100%乙醇(2)3 5分钟5分钟二甲苯(1)3二甲苯(2)3加拿大树胶封片等程序。

六、实验结果

一般实验用的普通果蝇(Drosophila melanogaster 2n=8)，其中一对为性染色体(XY或XX)，XX染色体为端着丝粒染色体，呈杆状，Y染色体为“J”形；第二对、第三对染色体均为中央着丝粒染色体，呈“V”形；第四对染色体短小，为端着丝粒染色体，呈点状，附在染色盘边缘。由于唾液腺染色体的假联会，X染色体的一端在异染中心上，另一端游离；而第二，第三对染色体着丝粒在中央，可以从异染中心呈“V”字形向外伸展出四条臀(2L、2R、3L、3R)，Y染色体着丝粒附近的异染色质参与了染色中心的形成，所以理想的片子，不管雌雄果蝇的唾液腺细胞在显微镜下均可见五条长臂(X、2L、2R、3L、3R)和一条短臂(第四条染色体臂不易观察)。雄果蝇唾液腺细胞。中的X染色体臂比雌果蝇的稍细。在染色体臂上可观察到许多明暗相间的带。 七、实验作业

绘制你所观察到的果蝇唾液腺染色体图，示各臂末端5—10条带纹，并注明是第几条染色体和臂的左右。

实验四 粗糙链孢霉杂交 一、实验目的 (1)学习和掌握粗糙链孢霉的培养方法和杂交技术。 (2)验证遗传学的分离定律和连锁互换定律。 二、实验原理 粗糙链孢霉(Neurospore crassa)属于真菌类，它的营养体由单倍性的(n=7)多核菌丝组成，无性繁殖是菌丝片断或分生孢子经有丝分裂直接发育成菌丝体，有性繁殖有两种方式：一种是两种不同接合型的营养体相互接受对方的分生孢子发生杂交，形成合子；另一种是不同接合型的菌丝相互靠在一起，细胞融合形成异核体。两种有性生殖方式形成的二倍性合子都可以经减数分裂形成4个子细胞，每个子细胞又经一次有丝分裂形成8个子细胞，进一步发育形成8个子囊孢子。粗糙链孢霉形成的8个子囊孢子有顺序的直线排列在子囊中。不同接合型的子囊孢子具有黑色、白色两种类型，在子囊中8个子囊孢子常呈4黑4白的排列方式，因此可以在显微镜下直接观察基因的分离现象。当基因发生了互换时8个子囊孢子又会排列成2黑2白2黑2白或排列成2黑4白2黑和2白4黑2白，因此在显微镜下也可以观察基因的连锁互换现象。 赖氨酸缺陷型(Lys-)的子囊孢子成熟的较晚，所以在一定时期呈现灰白色。野生型(Lys-)的子囊孢子成熟的较早，在一定时期呈现黑色。让以上两种接合型的粗糙链孢霉杂交，在适当时期观察子囊孢子可以看到六种子囊类型。黑色子囊孢子以“+号”表示，白色子囊孢子以“-”号表示。 非交换型子囊：+ + + + - - - - - - - - + + + + 交换型子囊： + + - - + + - - + + - - - - + + - - + + + + - - 交换型子囊的出现是由于基因Lys-或Lys+与着丝粒之间发生了交换，所以，通过计算交换型子囊的百分数可以算出Lys+基因与着丝粒间的相对距离。 重组值交换型子囊数1100% 交换型子囊数非交换型子囊数2 三、实验材料

野生型粗糙链孢霉(Lys+)和赖氨酸缺陷型粗糙链孢霉(Lys-)。 四、实验器具和药品

1．器具 培养箱、显微镜、镊子、解剖针、接种环、载玻片、盖玻片、试管、酒精灯、滤纸、白的确凉布(10cm×lOcm)、灭菌锅。

2．药品 基本培养基、补充培养基、杂交培养基见附录11。 五、实验步骤

1．菌种活化 从冰箱中取出保存的野生型和赖氨酸缺陷型的原种，在无菌操作条件下把野生型接种在基本培养基上，赖氨酸缺陷型的接种在含赖氨酸的补充培养基上，把接种好的试管放在23℃恒温培养箱内培养5—6天，直至在试管中长成许多菌丝，并且在菌丝上部有许多分生孢子时表明菌种活化成功。

2．杂交 用接种环挑取已活化好的Lys+和Lys-菌丝或分生孢子共同接种于同一杂交培养基上，并在培养基的琼脂斜面中部插一折叠的滤纸。在盛杂交培养基的试管上贴上标签，注明杂交组合、杂交日期、操作者姓名等。把试管放入25℃恒温培养箱中培养2—3周，直至在试管里的菌丝上有棕黑色的、用镊子或解剖针触摸时有坚实感的子囊果出现。 3．挑取子囊果 在培养过程中可以用解剖针挑出几个子囊果进行制片观察，若子囊中的8个子囊孢子都是灰白色的，说明培养物还未到最佳观察时期，可以继续培养。若8个子囊孢子都是黑色的，说明子囊孢子已老化，已错过了最佳观察时机。实验操作时用解剖针把子礁果从试管中挑出来放在白的确凉布上，用解剖针轻压子囊果，若有坚实感则说明此子囊果发育正常。用解剖针在白的确凉布上来回拨动子囊果以去掉子囊果上的菌丝或培养基。

4．挤出内含物 把子囊果放在载玻片中央，让子囊果的口孔(osti01e)朝向上方，在子囊果上方斜放一盖玻片，见图30.1一a，然后左手食指轻按盖玻片压碎子囊果。当听到“叭”一清脆响声时即可看到在子囊果右下角挤出一灰色小米粒1／3—1／4大小的斑点。取下盖玻片，小心把子囊果壳去掉，剩下的斑点就是被挤出来的许多小囊。见图30.1-b、图30.1-c。 5．压片 在载玻片中央剩下的灰色斑点处加少量生理盐水，轻轻盖上盖玻片，让其自然落下，灰色斑点即可散开呈菊花瓣状或扇形结构。

6．观察 把制好的玻片标本放在显微镜下观察子囊孢子在子囊中的排列顺序。若看到一些黑:白=5:3或6:2的子囊，这是由于染色单体转换或半染色单体转换所致。 六、实验结果

将观察的10—15个子囊果中各种类型子囊的数目填入下表中。

七、实验作业

写出实验报告。计算Lys基因与着丝粒间的重组值。

实验五 人类染色体组型分析

一、教学目的：

1.通过对人类染色体组型进行分析,使学生初步学会对染色体进行分析的方法。 2.初步掌握人类染色体的数目和形态特征。 二、实验原理：

染色体核型通常是指生物体所有可测定的表型特征总称，包括染色体的总数、染色体组的数目、组内染色体基数、每条染色体大小、形态。它是物种特有的染色体信息之一，具有很高的稳定性和再现性。染色体组型分析是对染色体进行分组、对核型的各种特征进行定量和定性描述，是研究染色体的基本手段之一，可以用来鉴别真假杂种、对研究染色体结构变异、染色体数目变异、B染色体、物种的起源和植物的遗传进化，基因定位等有很大的参考价值。进行核型分析可以利用有丝分裂染色体或减数分裂染色体，其中最常用的是有丝分裂染色体。 三、实验材料：

人类染色体正常染色体（46，XY）、21三体（47，XY+21）、Klinefelter综合征（47，XXY）和Turner综合征（45，X）的染色体图片。 四、实验步骤：

1.剪取染色体照片 剪取染色体时,要从大到小依次剪取,每个染色体的周围要留出一圈白边,以便于粘贴。

2.染色体配对 进行染色体配对时,先通过目测比较染色体长度和着丝粒的位置,然后进行配对。

3.染色体排列 进行染色体排列时,将已配对的染色体从大到小按长度顺序排列,平放于白纸上。排列的原则是:总臂长度由长到短。凡臂长相等的,短臂长的排列在前,短臂短的排列在后。 4.调整后再编号 染色体编号时,将每对染色体编成一个号,由大到小从1号编至22号。编号时要注意X染色体与6、7号染色体的区别,三者均为亚中着丝粒型,但可以根据X染色体的大小介于6号和7号染色体之间,以及它的着丝粒更接近中部,将X染色体与6、7号染色体区别开来,并从中挑出。Y染色体与21、22号染色体相似但21、22号染色体的长臂常分开,而Y染色体长臂的两条染色单体常并拢,依据此特点,可以将Y染色体挑出。注意将性染色体

单独排列。

5.染色体的分组 染色体分组时,可以根据染色体的形态、大小和着丝粒的位置这两个特点,将染色体分成7组。分组完成后,应在每组染色体的下面用铅笔划一道横线,并注明染色体序号,再在每组的横线中间处,用英文字母(A→G)注明组号。

6.粘贴 粘贴时,同一对染色体应靠拢,两对染色体之间应留出一定距离,而各组染色体之间则应留出较大的距离。 实验注意事项：

1.实验操作过程中,应遵循先排列、再分组、后粘贴的原则,不要边排列边分组边粘贴。否则,发生错误之后,已粘贴上的染色体不容易取下来。

2.粘贴染色体时,操作者不要喘粗气,以免将已经排列好的染色体吹散、丢失。

实验六 微核检测技术

一、实验目的

(1)了解微核检测的原理及其在病理遗传学上的意义。 (2)掌握小鼠骨髓细胞和蚕豆根尖的微核检测技术。 二、实验原理

微核是染色体畸变的另一种表现形式。为有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体片断，在间期细胞的细胞质中形成的一个或多个圆形或杏仁状结构。通过一定制备方法，可以在间期细胞中进行观察和计数。70年代初，Matter和Schmid等首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定怀疑具有诱变活力的化合物，并称之为微核测定法。

许多理化因素，如辐射、化学药剂等作用于分裂细胞而产生微核。在间期细胞中，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小在主核的1／3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具有合成DNA的能力。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的，但是已有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在有丝分裂过程中行动滞后，在分裂末期未能进入主核，便形成了独立于主核之外的核物质块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩形成主核之外的小核，即形成微核。已经证实，微核率同作用因子的剂量呈正相关。所以可用简易的微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排放等都存在污染环境的可能性，欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，需要一套高度灵敏，技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害。在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。目前，国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。华中师范大学生物系自1983年开始，建立了一套蚕豆根尖微核技术(参见附录6)，并首次用于监测水环境污染，经鉴定已列入国家《生物监测技术规范(水环境部分)》。 本实验介绍了小鼠骨髓细胞微核测试。 三、实验材料 成年小鼠(雌雄不限)。 四、实验器具和药品

1．器具 显微镜、刻度离心管、吸管、载玻片、离心机、注射器、烧杯、解剖工具。

2．药品 环磷酰胺(1mg／m1)溶液、生理盐水、小牛血清、甲醇、1／15mol／L磷酸缓冲液(pI-H6.8)、Giemsa原液。 五、实验步骤

1．微核的诱发 按40μg／g体重的剂量对小鼠腹腔注射环磷酰胺溶液，诱发微核(若进行其它因子测定或自然环境测定按下续步骤直接操作)。

2．取股骨处理24—36小时后，采用脱颈椎处死小鼠，迅速剥取两根股骨，剔净肌肉等软组织，并擦净股骨上的血污。

3．冲洗骨髓细胞 剪去股骨两端的骨骺，用注射器吸取2—3ml预温到37℃的生理盐水，然后将针头插入股骨腔，尽量将骨髓细胞冲洗出来，置于10ml试管中，把细胞团块用吸管吹打散。然后将细胞悬液转入离心管内，弃去残渣。

4．洗涤细胞1000rpm离心5分钟，收集细胞．弃去上清液，尽可能不留残液。滴加2—3滴灭活小牛血清，将细胞轻轻吹打均匀。

5．制细胞悬液 1000rpm离心5分钟，收集细胞，弃去上清液，再加1滴灭活小牛血清，用吸管轻轻混匀。

注：以上两步骤的小牛血清也可用1%柠檬酸钠代替，但两步骤须在15分钟内完成。 6．涂片 滴一小滴细胞悬液在洁净的载玻片上，涂成均匀涂片，在空气中干燥。 7．固定 放入甲醇中固定10分钟，取出干燥。

8．染色 用1:10 Giemsa染液染色10分钟，迅速用缓冲液洗片，干燥后即可观察。 六、实验结果

选择细胞密度适中，铺展均匀，染色良好的地方，随机观察计数。骨髓细胞中有核的细胞均出现微核，但是在只有少量胞浆的有核细胞中，微核常很难与正常核叶及核的突出物相鉴别，而在无核的嗜多染红细胞的胞浆中，微核却易于辨认。因为嗜多染红细胞为骨髓细胞中一类主核刚被排出的年幼红细胞，在它完成最后一次有丝分裂后几小时，将主核排出。而由染色体断片形成的微核则保留在细胞中。因此，一般观察计数嗜多染红细胞中的微核。

嗜多染红细胞经Giemsa染液染色呈灰蓝色。成熟红细胞呈桔红色。微核大多数呈圆形或椭圆形。边缘光滑整齐，嗜染性与核质一样．呈紫红色或紫蓝色。每只动物计数1000—2000个嗜多染红细胞。观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率以千分率表示。一个嗜多染红细胞中出现一个以上微核，仍按一个细胞计数。

正常小鼠嗜多染红细胞微核率为2.8‰±0.41，即正常小鼠嗜多染红细胞微核率为5‰以下，超过该值为异常。

七、实验作业

统计你所测定的材料的微核率。综合本班所有同学的测定结果，判断你所测定的物质是否具有诱变能力。

实验七 人类X小体，Y小体检测

一、实验目的

(1)掌握人类X小体，Y小体玻片标本的制作方法。

(2)观察识别X小体，Y小体形态特征及所在部位，鉴定个体的性别。 二、实验原理

1949年巴尔(Barr)等人在研究猫的间期神经细胞时发现雌猫体细胞核膜边缘有一个可被碱性染料染色的小体而雄猫没有。后来有人发现在人类正常女性口腔上皮、阴道上皮、皮肤、结缔组织、子宫颈、羊水等组织中都发现同样的小体，继而又有人进一步发现所有哺乳动物雌体细胞中都有一个这种小体。一般认为这种小体是两个X染色体中的一个在间期时发生异固缩形成的，所以把它叫做x小体。x染色质，又叫巴氏小体。X小体的数目在女性中是性染色体数目减1。如正常女性只有2条X染色体所以仅有一个X小体，具有3条X染色体的不正常女性则有两个X小体。雄性个体只有一条X染色体，则不发生异固缩，因此没有X小体。但性染色体组成为XXY的男性也可以有一个X小体。因此我们可以根据X小体的有无和数目来鉴定胎儿性别和性别畸形。

Y小体是细胞中经荧光染料染色后显示强烈荧光的小体，这种小体是人类男性体细胞中Y染色体的长臂末端显现出的明亮小体，因此被称为Y小体或Y染色质。人们可以根据Y小体的有无来鉴定胎儿的性别和性别畸形。 三、实验材料

(1)口腔粘膜细胞(男、女)。 (2)干净新鲜尿液(女性)。 (3)男性精液。 (4)发根细胞(女性)。 (5)羊水脱屑细胞。 四、实验器具和药品

1．器具 普通显微镜、荧光显微镜、恒温水浴锅、离心机、离心管、荧光灯、温箱、载玻片、盖玻片、镊子、牙签、橡胶水、玻璃棒、滤纸、纱布、烧杯、量简等。

2．药品 蒸馏水、固定液(甲醇：冰醋酸=3:1)、(95％乙醇：乙醚=1:1)、HCl(5mol／L、1mol／L)、75％乙醇、硫堇紫染液、乳酸地衣红染液、醋酸地衣红染液、盐酸阿的平、Mallvaine氏缓冲液(pH5.5—80.4)、石蜡。

五、实验步骤 1．X小体观察 (1)取材：

①口腔粘膜细胞：让受检者用水漱口数次，尽可能除去细菌及杂物，用洁净无菌的牙签从女性口腔两侧颊部刮取粘膜，在原位刮取2—3次，第一次的刮取物弃去，将第二次，第三次的刮取物分别涂在干净载玻片上或者将刮取物装入盛有生理盐水的离心管内。 ②尿中的脱屑细胞：用干净容器接取尿液，然后移入离心管。

③羊水脱屑细胞：按妇科常规穿刺抽取羊水10一15ml(一般先抽的2—3ml弃去。以免误染母体细胞)移入离心管。

④发根细胞：拔取女性带有毛囊的头发(约2cm长)，置于载玻片上。

(2)固定置于离心管中的材料(口腔粘膜细胞，尿中的脱屑细胞，羊水的脱屑细胞)，首先2000rpm离心20分钟，弃上清液，加入新配制的固定液(甲醇：冰醋酸=3:1)混匀后在37℃下静置30分钟，再1000rpm离心15分钟后弃上清液，加入1ml的固定液充分混匀制成细胞悬液。

置于载玻片上的材料待干后滴加固定液(95％乙醇：乙醚=1:1或乙醇)固定1小时左右后放空气中干燥。 (3)染色：制片：

①将制成的细胞悬液用吸管滴一滴于预冷的载玻片上，凉干后置于固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)中固定20分钟，蒸馏水中漂洗2—3分钟．然后用1mol／L HCl在37℃水浴中水解20分钟，蒸馏水冲洗，用硫堇紫染液染色20分钟，蒸馏水漂洗凉干待镜检。

②直接涂片制成的标本滴加1—2滴乳酸地衣红在室温下染色20—30分钟(勿使干燥)，加上盖玻片，垫上滤纸，用手指轻度加压后进行镜检，若不立即镜检，待干后立即放入95％乙醇中30分钟以上，取出后编号，置冰箱中保存。

③发根细胞的染色可直接将材料上加一滴醋酸地衣红染料，拔掉毛囊、弃发干，再加一滴染液后盖上盖玻片，然后用文火微热，静置5分钟后盖一滤纸压片。或者在材料上滴一滴45％醋酸(或5mol／L HCl)解离5分钟后吸掉多余醋酸，用净针头或镊子将软化的毛囊剥下，去毛干，用针头将剥下的组织均匀分散，待干后将玻片放入硫堇紫染液内染色20分钟。取出玻片移入75％乙醇0.5分钟，轻轻摇动，然后取出玻片凉干待镜检。

(4)镜检 在低倍显微镜下计算100个核膜完全、细胞不重叠、无核固缩的细胞。细胞堆中的细胞不能计算，不规则的细胞不能计算，在高倍或油镜下进一步观察。

2．Y小体的观察

(1)取材：④口腔粘膜细胞：与“x小体观察”相同。⑤精液细胞：取年龄为33—40岁的正常男人的新鲜精液，直接涂布于干净的载玻片上。 (2)固定、染色、制片：

①将新鲜的正常男性口腔粘膜细胞涂片放入固定液(乙醇：乙醚=1:1)内固定15分钟至12小时(可达几周)，后将标本移入95％乙醇内30分钟，用0.5％的盐酸阿的平水溶液染色10分钟，用自来水冲洗1分钟；在标本上加1—2滴Mcllvaine氏缓冲液(pH5.5—8.4)，覆以盖玻片，用橡胶水或蜡封片。

②凉干后的精液细胞涂片。放入固定液(甲醇：冰醋酸=3:1)中静置30分钟后，空气干燥，用0.5％盐酸阿的平水溶液染色15分钟，立即用自来水冲洗1分钟左右，凉干后滴加1—2滴Moilvaine氏缓冲液(pH5.5—8.0)，盖上盖玻片待镜检。

(3)用荧光显微镜检查，先用低倍镜，再用高倍油镜观察，整个细胞发出荧光亮者不算。 六、实验结果

1．X小体 显微镜下观察可见X小体的形态表现为一结构致密的浓染小体，轮廓清楚，大约1μm左右，常附着于核膜边缘或靠近内侧，其形态有微凸形、三角形、卵形。正常女性间期细胞核中X小体的比例约30％一50％，(由于口腔粘膜涂片比其它类型的标本更难看到细胞核，所以在口腔粘膜涂片中凡不处于边缘的X小体不予计数，所以X小体约在30％一50％之间)。男性中则偶尔可见(2％)且不典型。

2．Y小体 用荧光显微镜观察可见细胞核中有发亮的荧光小体，直径约0.5一0.3μm，正常情况下，Y小体的显现率25％一50%，正常女性无。性异常患者，如核型为47，XYY染色体的个体可见两个Y小体。 七、实验作业

(1)统计x小体的频率，绘4—5个典型细胞，示x小体的形态部位。 (2)计算显示Y小体细胞的频率。

实验八 小白鼠骨髓细胞染色体标本制备

一、实验目的

(1)掌握动物骨髓细胞染色体玻片标本的制备方法。

(2)观察染色体的形态特征，统计小白鼠体细胞中染色体数目。 二、实验原理

骨髓细胞具有高度的分裂增殖能力，动物经过秋水仙素处理后，分裂增殖中的骨髓细胞由于纺锤丝的形成受到抑制，染色体不能正常趋向两极而使大部分细胞处于分裂中期。同时染色体适当缩短，轮廓比较清晰。把收获的细胞进行低渗、固定等处理，使其处于高度膨胀状态，再利用一定方法把细胞悬液滴在载玻片上，从而把细胞破碎，染色体分散开，再进行染色后即可观察到染色体。骨髓细胞染色体制片方法简便易行，不需无菌条件，设备简单，取材容易，在一般实验室即可进行。 三、实验材料

健康小自鼠(Mus musculus) 四、实验器具和药品

1．器具 注射器(1ml、5ml各一支)、5号针头、解剖盘、解剖剪、镊子、玻离吸管、10ml刻度离心管、离心机、载玻片、盖玻片、显微镜、滤纸、擦镜纸、白纱布小块、量筒、玻离板。

2．药品 0.02％秋水仙素(低温避光保存)、0.075mol／L KCl、固定液(甲醇：冰醋酸=3:1)、Giemsa染液、0.01mol／L磷酸缓冲液(pH6.8)、2％柠檬酸钠溶液、0.85％生理盐水。

五、实验步骤

1．预处理 实验前3—4小时，取健康小白鼠一只按每克体重2一μg秋水仙素的量由腹腔注射秋水仙素溶液(切勿损伤内脏)。

2．取股骨 用左手拇指和食指按住小白鼠头部。右手拇指和食指掐住小白鼠颈部并用劲向后拉断其脊髓或用力掐断其脊髓。处死后立即用剪刀剪开后腿上的皮毛，取出小白鼠的股骨，剔掉股骨上的肌肉，并将一小块白纱布包在股骨上用手反复搓动，以除净股骨上肌肉碎渣和结缔组织。

3．取骨髓细胞 用剪刀剪开股骨的两端使骨髓露出。将装有2％柠檬酸钠溶液的5ml注射器插入股骨的上端，缓慢注射冲洗骨髓腔，冲洗的溶液一滴滴从股骨下端渗入到离心管中，反复冲洗直至股骨变灰白色。经1000rpm离心10分钟后弃去上清液。

4．低渗 在离心管中加入0.075mol／L KCI溶液5ml，用吸管将骨髓细胞吹打成细胞悬液，37℃恒温水浴锅中低渗30分钟。1000rpm离心10分钟后弃去上清液。在离心前加入1ml固定液并用吸管吹匀进行预固定。

5．固定I 沿离心管管壁慢慢加入固定液5ml，用吸管吹打成细胞悬液后在室温下静置30分钟。1000rpm离心10分钟后弃去上清液。

6．固定Ⅱ 重复第5步。离心弃去上清液后沿离心管壁加入0.3一0.5ml新配制的固定液，用吸管轻轻吹打成细胞悬液。

7．滴片 用镊子从冰水中取出预冷的载玻片，甩掉载玻片的冰水后迅速用吸管吸取细胞悬液滴在载玻片上2—3滴(滴片的高度30—35cm，滴面不要重复)，立即用嘴向同一方向吹，使细胞染色体散开。然后置于酒精灯上微微加热干燥或放在玻片架上室漏下凉干。 8．染色 将凉干的玻片放在玻片板上，将Giemsa染液(O.5ml Giemsa原液加9.5ml的0.01mol／L磷酸缓冲液)滴加在玻片上染色20—30分钟，用蒸馏水或自来水冲去玻片上的染液。滤纸吸干或凉干后待镜检。

9．镜检将制备好的玻片置于显微镜下，首先用低倍镜寻找细胞和中期分裂相，然后用中倍镜和油镜观察染色体的形态，统计染色体的数目。好的标本可制成永久片。 六、实验结果

制备好的玻片标本应是细胞多，中期分裂相多，细胞核染色体被染成微紫红色。细胞、染色体分散均匀，染色体形态清晰。小白鼠(Mus musculus)的染色体数目2n=40，性染色体组成为XX、XY，染色体的类型全部为近端着丝粒染色体，显微镜下观察大多为“V”形，染色体的大小区别不明显，雄性小白鼠有3条最短的染色体(19号染色体和Y染色体)．而雌性小鼠只有2条最短的染色体。 七、实验作业

(1)绘小白鼠骨髓细胞染色体核型图。 (2)每人交两张制作好的染色体玻片标本。

实验九 植物有性杂交

一、实验目的

(1)理解有性杂交的原理。

(2)了解几种植物花器构造和开花生物学特性。 (3)掌握几种植物的有性杂交技术。 二、实验原理

植物有性杂交是利用遗传性状不同的亲本进行交配，以组合两个或多个亲本的优良性状于杂种体中，并经过基因的分离和重组。产生各种性状的变异类型，从中选择出最需要的基因型，进而创造出对人类有利的优良品种。根据杂交亲本间亲缘关系的远近，有性杂交又分为近缘杂交和远缘杂交两大类。前者是指同一植物种内的不同品种之间的杂交，后者指在不同植物种或属间进行的杂交，也包括野生种和栽培种之间的杂交。品种间杂交为近缘杂交，由于品种间亲缘关系较近，具有相同的遗传物质基础，因此品种间杂交易获成功。通过正确选择亲本，能在较短时间内选育出具有双亲优良性状的新品种，但在品种间杂交时，因有利经济性状的遗传潜力具有一定限度，往往存在品种之间在某些性状上不能互相弥补的缺点。而远缘杂交可以扩大栽培植物的种植库，能把许多有益基因或基因片断组合到新种中，以使产生新的有益性状，从而丰富各类植物的基因型。通过远缘杂交，还可获得雄性不育系，扩大杂种优势的利用。但远缘杂交交配结实率低，而且不易成功，完全不育，杂种夭亡；杂种后代出现强烈分离，中间类型表现不稳定，因而增加了远缘杂交的复杂性租困难，限制了远缘杂交在育种实践上的应用。 三、实验材料

小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、棉花(Gossypium hirsutum)。 四、实验器具和药品

1.器具 镊子、小剪刀、玻璃纸袋、羊皮纸袋、牛皮纸袋、大头针或曲别针、纸牌、广口瓶、广口暖水瓶、麦管、酒盅、铅笔、记录本。 2.药品 50％以上浓度的酒精溶液、酒精棉球。 五、实验步骤 1．小麦有性杂交

(1)选穗：根据已确定的杂交组合，在杂交亲本中选择母本性状典型、健壮无病的单株作为母本，一般以主茎穗或大分蘖穗为好。被选中的小麦穗应该是刚抽出叶鞘还未开花，麦

穗茎部距旗叶叶鞘间距离为半寸左右，花药呈绿色，柱头还未羽毛状分叉。

(2)整穗：将选好的穗子先用镊子去掉麦穗下部发育较迟的小穗，仅留中部5—6个小穗，再用镊子取掉小穗上中间的几朵小花，一般每个小穗只留基部两朵发育最好的小花,最后用小剪刀剪去外颖上的芒。

(3)去雄：将整好的麦穗去雄，一般采用以下两种方法：

①分颖去雄法：将整过的麦穗夹在左手拇指和中指中间，用食指逐个轻压外颖的顶部，使内外颖分开，然后用镊子插入小花内外颖的合缝内，轻轻把三枚花药取出．最好一次去净，注意勿伤柱头，同时不要将花药夹破。如果夹破了花药，应摘掉此朵小花，并用酒精棉球擦洗镊子顶端，以杀死其上附着的花粉,以免发生自交。去雄时先从穗的一侧开始，自上而下逐个进行，去完一侧再去另一侧，不要遗漏。去雄后立即将麦穗套上玻璃纸袋，用大头针或曲别针将纸袋别好(注意不要损坏旗叶)并挂上纸牌，用铅笔注明母本品种名称、去雄日期和操作者姓名。

②剪颖去雄法：用剪刀把整好的麦穗上留的每朵小花的护颖及内外颖剪去1／3—2／5，以不剪破花药为准。然后用镊子从剪口处把花药取出。此法也要自上而下逐朵小花进行，去完一侧再去另一侧，不能遗漏，也不能损伤柱头。如发现个别小花已散粉，应立即摘掉散粉小花。去雄后套上纸袋并别好，挂上纸牌，注明母本名称。去雄日期和操作者姓名。 (4)授粉：一般去雄后2—3天，花朵的柱头呈羽毛状分叉，并带有光泽。此时标志柱头已发育成熟，可以进行授粉。但由于品种抽穗期早晚和当时的气温不同，柱头成熟的速度也不一致。一般早抽穗的品种，柱头成熟的时间较长些，晚抽穗的品种，特别是在高温条件下，去雄后1—2天柱头即可成熟．有的甚至边去雄柱头就已经成熟．因此应抓紧时机，适时授粉．以提高杂交结实率。每天上午8—11时，下午3_-5时是最佳授粉时机。

①采粉授粉法：授粉前先采集父本花粉，于上午7—10时开花最盛时进行。如果父本穗子数量多，可直接采收花粉。方法是：选择麦穗中部有几朵小花已开花的穗子，将此穗子自上而下轻轻抹几遍促使其开花，几分钟后就可看颖壳逐渐张开，花药逐渐伸出，此时将穗子斜置于容器上方，用镊子轻轻敲打麦穗，花药即可落入容器之中。另外，如果父本穗子数量少，可选当天有几朵小花开花的穗子(花药呈金黄色)，用镊子撑开小花的内外颖，取出金黄色的花药放入酒盅中。花粉采集后，马上取下麦穗上的纸袋，用小毛笔蘸取少量花粉或用镊子夹2—3个花药依次放入已去雄的小花柱头上，也要按从上而下，授完一侧再授另一侧的顺序进行。为使柱头授粉良好，应使花粉在柱头上轻擦几下，全穗授粉完毕后，仍套上纸袋，用大头针别好，挂上纸牌，注明父本名称及授粉日期。

②采穗授粉法：此法配合剪颖法去雄。选择当天将要开花的父本穗为供粉穗，将穗子剪下，随即把顶部和基部发育不好的小穗去掉，留下中间两侧的小穗，然后将颖壳斜剪1／3，以不伤花药为准，在阳光照射下约2—3分钟后，花药即可伸出颖外，将母本纸袋上部剪开，向内吹气使纸袋充分张开，轻轻拿起即将散粉的父本穗子，倒置插入母本纸袋。在袋内捻转几下，花粉就自然落在柱头上。授粉完毕后，父本穗取出，仍旧套上纸袋，用大头针别好纸袋口，在纸牌上注明父本名称及授粉日期。(详见图12.1)

(5)检查受精情况：授粉后1—2小时花粉粒就在柱头上萌发，40多小时后完成受精。授粉后3—4天打开纸袋检查杂交成功率。若子房已膨大，内外颖合拢．柱头萎缩，失去光泽说明已受精，否则未受精。若在一穗大部分小花都没受精，则进行第二次授粉。检查完毕后仍然套上纸袋。

(6)收获：六月初小麦成熟后，把同一种杂交组合的杂交穗子剪下收集在一起，脱粒后

装在一个纸袋里，并在纸袋上注明杂交组合，种子粒数、收获日期，上交实验室。(小麦花器构造和开花习性详见附录1) 2．玉米有性杂交

(1)选穗：根据育种目标和实验设计，选择健壮优良、无病、苞叶露出而没有吐丝的植株。

(2)隔离：用透光防水的硫酸纸袋套住母本的雌穗，同时也套住选作父本的雄穗，以防外来花粉的侵入。保证实验的准确性。套袋时将袋口插在茎秆和雌穗之间，以防吹落。另外种植时也应考虑父、母本间在种植时间和空间的隔离。

(3)整穗：当雌穗花丝伸长出苞叶一寸左右时，表明雌花发育成熟。由于各朵花吐丝时间不同，苞叶外的花丝可能长短不齐，取下透明纸袋把花丝修剪成一寸左右，然后继续套上透明纸袋。

(4)授粉：整穗后应马上进行授粉。上午9一10时将已开始开花散粉的父本雄穗轻轻弯曲抖动，使花粉落在透明纸袋内，然后取下纸袋，折叠袋口。授粉者应头戴草帽，迅速到授粉植株处，用草帽沿遮住雌穗上方，轻取下雌穗套袋，将装有花粉的透明纸袋口向下倾斜，使花粉均匀倒在母本花丝上，然后立即套上原雌穗套袋，用大头针连同苞叶一块别好，用小绳将纸袋轻拴在茎上，并在玉米茎上系上纸牌，注明杂交组合、授粉日期及操作者姓名。 每做完一个杂交组合，即用酒精擦手，杀死花粉，以免造成人为授粉混杂。另外授粉时动作要敏捷，取袋、套袋要迅速，尽量缩短花丝暴露的时间，不要用手触摸花丝，并用草帽和身体挡住外来花粉，以免落在母本花丝上，造成混杂。

(5)检查受精情况：授粉4—5天后，打开纸袋检查，若大部分花丝已萎缩，没有光泽说明受精情况正常。

(6)收获：将成熟的玉米杂交果穗连同植株上的纸牌一起收交实验室。(玉米花器构造和开花习性见附录2。) 3．棉花有性杂交

(1)选择亲本：在棉花开花的前一天下午4时以后，在拟定组合的母本行中选择具有母本典型性状的生长健壮、无病优良的植株。注意第二天早晨必开的花的外观是：花冠呈螺旋形折叠，但花瓣已经长大露出苞叶。

(2)去雄：A．徒手去雄：去雄的花应选3—6果枝靠近主茎的第1—2节位花朵。去雄时用手拨开苞叶。用右手的大拇指甲，从花萼管外面切入，将花冠和整个雄蕊管完全剥净，只留下雌蕊和苞叶，露出花柱、柱头和子房，并将该果枝打去边心。去雄时，注意不要碰破花

药或触伤花柱、柱头和子房。如果碰破花药，应立即用酒精棉球擦手．杀死粘在指甲上的花粉，以免影响杂交质量。去雄后，立即用一端开口另一端有节密闭的麦管从柱头顶端轻轻套下，一直达到子房上端，麦管套入后须高出柱头1—2cm，即可避免外来花粉授粉，又可避免花柱伸长时被碰伤。然后挂上纸牌，注明母本名称、去雄日期和操作者姓名。B．麦管切雄：用剪刀或手剥去花冠上部，露出柱头和部分花药，再用4cm长的粗壮麦管，一端折封，另一端从柱头套下．并轻轻转动向下压，将雄蕊的花丝切断，花药脱落。去雄完毕后，麦管仍套在柱头上，以防止花药传入。然后挂上纸牌，注明母本名称、去雄日期和操作者姓名。C．手术去雄：用剪刀将花冠纵面剪裂，或从侧面剪去花冠的三分之一，成一个三角形的切口；也可将花冠全部剪去，使雄蕊外露，再用剪刀或镊子轻轻除去花药，把花药全部摘净后，再在柱头上套上麦管，进行隔离。这种方法比较麻烦费工，但花器受损伤小，结铃率高。 (3)父本隔离：在母本去雄的同时，选父本植株上次日可以开花的花蕾，用线或回形针或塑料管隔离，注意用线扎花冠顶端时不要太松，以免次日花冠上张开的小孔让昆虫进入。使父本花粉混杂；也不要过紧，以免扎破花冠和扎住柱头。

(4)授粉：一般在去雄后次日上午9～10时进行，这时的柱头和花粉生活力较强，结实率高。授粉时先将隔离的父本花朵摘下来，剪去花冠，并将母本柱头上的隔离麦管取下，用干净毛笔蘸父本花粉轻轻涂抹在母本柱头上，或把花粉轻轻抖落在母本柱头上。授粉后仍旧套上麦管进行隔离。并在纸牌上注明父本名称、授粉日 期。

(5)检查受精情况：授粉后3--4天，若子房膨大，柱头失去光泽说明杂交成功。 (6)收获：杂交棉吐絮后，进行单铃收获，脱粒后，把种子收放在种子袋中，注明杂交组合、种子粒数，收获日期等，上交实验室。 4.棉花自交

棉花属常异花授粉作物，天然异变率可达20%以上，为了防止生物学混杂，保持品种的遗传特性，常采用自交方法。

自交在开花前花冠露出苞叶1.5cm以上为好。选择典型、健壮、无病优良植株中部靠近主茎的花蕾，其方法有：

(1)扎线法：用21～24cm长的棉线，一端系在准备自交花朵的花柄上，另一端不松不紧地绕缠在花冠顶部，待花冠脱落后，棉线仍保持在果柄上，做自交记号。 (2)回形针法：用回形针夹住花冠顶部，并在花柄上用线或漆做记号。 (3)塑料管法：用特制的塑料管套在花冠上，并在花柄上做标记。

(4)胶粘法：在尚未开放的花冠上涂胶粘剂，使花冠不能张开，并在花柄上做标记。(棉

花的花器构造和开花习性详见附录3。) 5．水稻有性杂交

(1)选穗：根据已确定的杂交组合，逸取植株生长健壮、无病虫害、具有该品种典型性状、稻穗已露出叶鞘3／4，穗尖已开过几朵颖花的母本稻穗供去雄之用。

(2)去雄：A．温汤杀雄：利用水稻的雌雄蕊对温度的适应能力不同的特性，在水稻自然开花前半小时时，将暖水瓶中的温水调节到45℃，把选好的母本稻穗与暖水瓶相对倾斜，将稻穗全部浸入温水中，注意勿折断穗茎和穗秆。5—8分钟后取出稻穗凉干，(若水温降至42—44℃，则处理8—10分钟)。取出后20分钟左右即可开颖，不开的全部剪掉。(注意防止剪伤开放的颖花及穗枝梗)，随即套上透明纸袋．以防串粉。系上纸牌注明母本名称、去雄日期和操作者姓名(见图12.2)。B.剪颖去雄：在杂交前一天下午4—5时后，或杂交当天早晨7—8时进行。选取露出叶鞘一半或2／3的母本穗子，剥开叶鞘，进行整穗疏花，将上部已开的花和下部过嫩的花全部剪去，留下中部预计次日能开的颖花(可将颖花在阳光下透视．当颖花内雄蕊伸长已达颖壳的1／2以上时，即为次日要开的颖花)20--30朵，用剪刀横剪去颖壳的1／4或1／3(不要剪破花药)，再斜剪外颖一侧，然后用镊子将6枚雄蕊轻轻夹去。去雄后，立即套上透明纸袋，挂上纸牌，注明母本名称、去雄日期和操作者姓名。

(3)授粉：温汤去雄后，可以随即授粉；如用剪颖去雄，开花当天剪颖去雄的，以当天授粉效果最好，也可以次日上午授粉，授粉方法主要有：A.弹花授粉法：在水稻自然开花时，轻轻剪下正在开花的父本稻穗，并置于已去雄的母本稻穗上方，用手轻轻抖动父本稻穗，使花粉落在母本柱头上，连续进行2--3次。如父母本相邻种植，则不必剪穗，可就近授粉；若母本已去雄而父本尚未开花时，则可用黑纸袋罩住父本穗子，约10分钟后，揭开纸袋即可开花授粉。B.授入花药法：在水稻自然开花时，用镊子夹住父本成熟的花药，(刚开花而未散粉的花药或未开花但雄蕊伸长颖壳达2／3以上的颖花的花药)在已去雄的母本颖壳上轻轻磨擦，使花药破裂，花粉散落在柱头上，但注意不要损伤母本的花器。如果母本颖壳已经关闭，可将2--3个花药塞进颖内，让其自然开裂散粉。授粉后，母本穗仍旧套上透明纸袋，用回形针别好，并在纸牌上注明父本名称，授粉日期。

(4)检查授精情况：可在授粉3天后检查杂交是否成功，其标志要看子房是否膨大，膨大者表示已受精，可以长成稻粒，此时可以把袋摘下。

(5)收获：杂交后20天左右即可收获稻穗，连同纸牌一块交实验室。(水稻的花器构造和开花习性参见附录4。) 六、实验作业

根据上述小麦、玉米、棉花、水稻各自的杂交方法，每种作物在各自的开花盛期杂交3--5个，收获后将杂交穗子或籽粒交实验室。

实验十 植物多倍体的诱发与鉴定 一、实验目的 (1)了解人工诱发多倍体植物的原理、方法及其在植物育种上的意义。 (2)初步掌握用秋水仙素诱发多倍体的实验技术和多倍体的鉴定方法。 二、实验原理 多倍体广泛地存在于植物界，目前已知被子植物中有三分之一以上的物种是多倍体，如普通小麦是异源六倍体，棉花是四倍体，此外还有烟草等，这些部是自然界存在的多倍体。多倍体产生的途径除自然发生外。也可以采用高温、低温、嫁接、切断和射线处理等物理方法和化学药剂处理方法，在这些方法中以化学药剂处理最为有效，如秋水仙素，萘嵌戊烷、异生长素、植物激素、富民隆等，都可诱发多倍体，其中应用最广泛、效果最好的是秋水仙素。 秋水仙素是由百合科秋水仙属的秋种番红花一一秋水仙素(Colchicum autumnale)的种子和器官中提炼出来的一种生物碱。化学分子式为C22H25NO61H2O。它具有麻醉作用，对植物的种子、幼芽、花蕾、花粉、嫩枝等可产生诱变作用，它的作用机理是抑制细胞分裂时纺缍体的形成，使复制后的染色体不能拉向两极，细胞不能继续分裂形成两个子细胞，从而导致染色体加倍，形成多倍体细胞，在此基础上进一步发育成多倍体植物，多倍体植物可以通过有性繁殖进行繁殖下去。用人工方法诱导的多倍体，可以得到一般二倍体没有的优良性状，如大粒、大穗、内含物量增加、抗病性强等。人工培育的三倍体西瓜、三倍体甜菜、八倍体小黑麦已在生严上厂泛应用。 对多倍体的鉴定，除了检查染色体数目变化外，形态特征的变异也是一个重要方面。多倍体植物的气孔、花器、花粉粒、种子、果实等部分明显变大，气孔数目减少而密度变稀，同源多倍体育性有一定的降低，所以同源多倍体中有部分畸形的不育花粉粒。 三、实验材料 (1)洋葱(Allium cepa 2n=16)、大麦(Hordeum spp. 2n=14)、大蒜(Allium sativum 2n=16)、西瓜(Citrullus vulgaris 2n=22)、玉米(Zea mays 2n=20)、蚕豆(Vicia faba 2n=12)等的种子、鳞茎。 (2)葡萄植株、插条或其它果树植株。 四、实验器具和药品 1. 器具 显微镜、剪刀、培养皿、载玻片、盖玻片、吸水纸、培养箱、镊子、纱布、12脱脂棉、酒精灯、测微尺。

2. 药品 秋水仙索(0.1％和0.025％)、HCl (mol／L)、硝酸银(O.1％一0.2％)、碘化钾(1％)、固定液、醋酸洋红或卡宝品红染色液。 五、实验步骤

1.植物根尖多倍体的诱发 将玉米、大麦等植物种子洗净后用水浸泡1—2天，然后摆放在铺有湿润滤纸(或纱布)的培养皿中置于25一28℃条件下发芽，当根长到1cm时取出洗净，把水吸干后移到0.01％一0.1％的秋水仙素溶液中，使植物根部浸在药液中，根尖朝下，25℃条件下处理直到根尖明显膨大为止。另外设加入清水的作为对照，然后取出材料洗净，用卡诺氏固定液固定1小时，以备镜检。若用洋葱作材料时，必须先剪去老根，然后置于盛满水的瓶口上。当长出新的不定根后，再用秋水仙素处理。 2．多倍体植物的诱发

(1)处理种子：将植物的种子放在0.1％秋水仙素溶液中浸种24小时，取出种子用自来水冲洗2—3次，然后将种子移到放有被0.025％秋水仙素溶液润湿了的吸水纸的培养皿中，为避免蒸发，加上盖放入20℃培养箱内发芽，一般处理两天就可长出幼苗。对干燥种子比浸过种的种子要多处理1天，种皮厚发芽慢的种子应先催芽后进行处理。用秋水仙素能阻碍根系发育，所以对已发芽的种子应用较低的秋水仙素溶液处理较短的时间。处理后取出幼苗，用自来水缓缓冲洗以免损伤，然后将幼苗移栽到大田或盆钵内，同时播种未经处理的种子幼苗作为对照。

(2)处理幼苗：对于发芽慢的种子在出苗后处理效果更好。以西瓜为例：先将二倍体西瓜籽浸种催芽。当胚根长到1—1.5cm时，将胚根倒置于0.2％一0.4％秋水仙素溶液的培养皿中置25℃温度下浸渍20一24小时，注意处理时需要用湿滤纸将根盖好，避免失水。处理后的幼苗，经水洗进行栽种或砂培。另外也可以采用田间处理幼苗的方法，即当幼苗子叶展平时。每天早晚用0.25%或0.4％秋水仙素溶液滴浸生长点各一次，每次1—2滴，连续处理4天，遮阴保持湿度。以上两种方法如果成功可获得四倍体西瓜，再用它和二倍体西瓜杂交就可育成三倍体无籽西瓜。

(3)处理芽：选用葡萄植株或插条等果树的顶芽或腋芽生长点进行处理。将芽部固定一个蘸有0.5％一0.7％的秋水仙素棉球(最好外罩一塑料袋防止蒸发)连续处理2—3天后，去掉棉球，反复用清水冲洗生长点。也可将蘸有秋水仙素的棉球涂抹生长点，待进一步生长后，再进行观察和鉴定。 3．多倍体的鉴定

(1)细胞学鉴定：对已经加倍和未加倍(对照)的植株根尖或茎尖制成临时片，观察有丝分裂中期的染色体数目。对收获的可能为同源多倍体的大粒种子发芽制成根尖压片，进行检查染色体数目。 (2)形态鉴定：观察植物多倍体植株，分别比较鉴定二倍体和多倍体在形态上的主要区别。 (3)气孔鉴定：在同源多倍体植物叶片背面中部划一切口用尖头镊子夹住切口部分，撕下一薄层下表皮，放在载玻片上，加一滴蒸馏水铺平，盖上盖玻片，制成表皮装片，用同样方法，制作一张二倍体植物的表皮装片作为对照，镜检比较多倍体和二倍体气孔和保卫细胞的大小，各测定30个计算出平均值。统计气孔数目，各观察10个视野，计算气孔密度。气孔保卫细胞的大小测定用测微尺测量： (m度) 目镜测微尺每格长镜台测微尺格数10 目镜测微尺格数气孔密度测定方法：将叶片表皮制片于显微镜下检查，计算每个视野气孔数，移动制片重复10次，求出平均值。视野面积的计算，用目镜测微尺量出视野直径，按公式Sr求视野面积。得每平方毫米叶面积的气孔数。 (4)保卫细胞内叶绿体数目测定：取叶下表皮于载玻片上，滴加0.1％一0.2％AgNO3溶液数秒后，加盖玻片，在显微镜下观察保卫细胞内的叶绿体数目。 (5)花粉粒的鉴定：从同源多倍体和二倍体植株上采集花粉放入45％醋酸中，用滴管各吸取一滴花粉粒悬浮液分别放到载玻片上，加上碘化钾溶液，盖上盖玻片制成花粉粒制片，然后镜检，观察同源多倍体和二倍体花粉形态大小是否整齐、有无畸形，若大小差异不明显时，可用测微尺各测定30个花粉粒大小，求平均值。 六、实验结果 将镜检结果填入表26.1。 七、实验作业 (1)对实验结果进行分析。 (2)绘制一多倍体植物中期染色体图像。 (3)交1—2张好的多倍体根尖制片。 (4)简述多倍体诱发的基本原理及意义。 2 表26.1 同源多倍体和二倍体性状对照表 项目 结 材料 果 同源多倍 体 二倍体 染色体数目 气孔大小 长×宽 保卫细胞 气孔密度 长×宽 小 态 花粉粒大花粉粒形实验十一 植物细胞核高分子量DNA的快速提取

一、实验目的

学习和掌握用苯酚法和盐溶液法提取DNA的原理和技术。 二、实验原理

DNA是最重要的信息分子，是分子生物学研究工作的主要对象。因而DNA分子的纯化是一项最基本的研究技术。由于DNA结构较不稳定，在较剧烈的物理、化学因素及酶的作用下很容易降解，在制备DNA时应防止过酸、过碱及其它能引起核酸降解的因素的作用。在提取过程中为了防止组织中广泛存在的核酸降解酶的作用，全部过程应在低温下(0℃左右)操作。必要时还需要加入抑制剂以抑制酶的作用。柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸钠、皂土均可抑制DNA酶的活性。如果采用十二烷基磺酸钠或苯酚作蛋白质变性剂来分离核酸，它们同时也可以破坏核酸降解酶，因而常获得较好的效果。

动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液，但在O.14mol／L盐溶液中溶解度很低；而RNA核蛋白则溶于0.14mol／L盐溶液中。利用这个特性即可把RNA核蛋白与DNA核蛋白分开。当核蛋白在氯仿中透析或与氯仿一起震荡时，蛋白质变性并与DNA分开，而DNA则仍留于水相中。当向含有核酸的水相中加入乙醇时，核酸即呈纤维状析出。也可用苯酚法提取DNA。先用特定pH的苯酚溶液处理。然后离心分层，DNA或溶于上层水相中，或存在于中间残留物中，蛋白质变性后停留在苯酚层内。由于苯酚能使蛋白质迅速变性，因而抑制了核酸酶的活性。操作过程比较缓和，可以得到较好的DNA制品，所以现在一般都用苯酚法提取DNA。

本实验采用液氮冷冻后破碎植物细胞壁。在冰冻条件下可部分抑制DNase的活性，以保护DNA不被破坏。破碎的细胞悬浮于裂解液中，其中的SDS使核膜破裂；EDTA螯合二价金属离子，以抑制DNA酶的活性；蛋白酶K除抑制DNase外还使DNA与染色质蛋白质解离，以便分离较纯的DNA；60℃保温也可抑制DNase的活性，同时使溶液粘度下降。再经酚和氯仿／异戊醇抽提裂解物以除去蛋白质。进一步用氯化锂沉淀大分子RNA。并用透析法除去低分子量杂质．即可得到较纯的DNA，其大小适于Southern分析和用入噬菌体构建基因组DNA文库。 三、实验材料

小麦叶片(或其它物种植物叶片)。 四、实验器具和药品

1．器具 高速冷冻离心机、恒温水浴锅、手提式高压消毒器、研钵、普通离心机。 2．药品 5mg／ml蛋白酶K，1mol／LTris，裂解缓冲液(500mmol／LTris—HCl、10mmol／L EDTA、5mmol／L β-巯基乙醇，pH8.0)，O.5％SDS，10mol／LLiCl，泡和酚，氯仿份-异戊醇(氯仿异戊醇=24：1)，无水乙醇，TE缓冲液。 五、实验步骤

(1)取新鲜幼叶5g，于液氮中速冻后．立即在液氮中研磨成粉末，做到尽可能研碎。将粉末放入小烧杯中。

(2)待液氮蒸发后，向烧杯中加入20ml预冷的裂解缓冲液，轻轻搅匀，用1mol／LTris调PH至8.O。加2ml 5mg／ml蛋白酶K，于60 ℃水浴中放置5分钟；再移到37℃水浴中放置过夜。

(3)将上述裂解液移入离心管中，于4℃条件下，1000rpm离心10分钟。用粗头吸管将粘稠的上清液移入三角瓶中。

(4)加等体积饱和酚于三角瓶中，轻轻旋转，使水相与酚充分混合，室温下缓缓摇动30分钟。

(5)将混合液移入离心管中，于4℃条件下，1000rpm离心20分钟。用大滴管将上层水相小心吸出，注意不要吸出中间的蛋白质层。

(6)先用饱和酚一氯仿／异戊醇，再用氯仿／异戊醇按第4、5两步各重复提取一次。最后在室温下4000rpm离心20分钟。如果中间层仍有白色，则再重复抽提一次。

(7)取出水相，加入LiCl使终浓度为2mol／L。0℃放置1小时后于4℃1000rpm离心10分钟，以除去高分子量RNA沉淀。

(8)将上清液转入新的离心管中，加入2倍体积的冷无水乙醇，0℃下放置1小时。4000rpm离心5分钟。得到的沉淀用70％乙醇洗涤二次，离心收回沉淀，并将管底少量的乙醇于室温下挥发干净，但应注意不可使DNA沉淀干燥，否则沉淀不易溶解。 (9)将沉淀溶于TE缓冲液中，保存于4℃下。 六、实验结果

应用这种方法所得的DNA，分子量大于50Kb，可用于酶切和Southern分析。 七、实验作业

(1)根据核酸在细胞内的分布、存在方式及其特性，提取过程中采取了什么样的相应措施?

(2)如果欲测定所得DNA的含量和纯度，应该进行哪一些实验?请说明其一般原理和简

要过程。

实验十二 果蝇杂交及X染色体基因定位分析

一、实验目的

(1)通过实验掌握果蝇的杂交技术和统计处理方法。

(2)验证和加深理解遗传的分离规律、自由组合规律和连锁互换规律。 二、实验原理

Gregor Johann Mendel（1822-1884， Gregor是他成为神父时天主教会赐予的名字），奥地利僧侣、遗传学之父。1856年，他开始在奥地利Brunn （今捷克的Brno）城内的奥古斯丁修道院中一块长120英尺宽20英尺的土地上进行了著名的豌豆杂交实验。由于选材得当，方法正确，8年之后，他终于揭示了遗传的基本规律，这就是后人从他的论文中概括的分离定律和自由组合定律。

果蝇是遗传学实验中常用的一种实验材料，应用不同品系的果蝇进行杂交实验可以对三大遗传规律及伴性遗传规律进行验证，同时通过实验还可以确定控制性状的基因的显隐性关系。

长翅和残翅是一对相对性状，它们分别受第二对染色体上显性基因Vg和隐性基因vg控制，残翅的双翅几乎没有，只有翅的残痕,无飞翔能力。长翅对残翅为完全显性，让长翅果蝇(VgVg)与残翅果蝇(vgvg)杂交，F1代都是杂合体长翅(Vgvg)，F1代形成配子时，由于等位基因的分离，雌雄果蝇都是形成1:1的Vg和vg配子类型，F2代有3种基因型：VgVg：Vgvg：vgvg=1:2:1，表现型比例为：长翅:残翅：3:1。

长翅果蝇 × 残翅果蝇

VgVg vgvg ↓ ↓ Vg vg F1 长翅果蝇 Vgvg Gm Vg F2 Vg VgVg长翅 Vgvg长翅 vg Vgvg长翅 Vgvg残翅 vg 通过对F2代中理论值与实际观察值的对比．统计学分析以及x检验(见附表)，即可了解此对相对性状的遗传是否符合分离定律。另外果蝇的灰身与黑身，灰身与檀黑体．灰身与黄身等性状的遗传也都符合分离定律。 当研究多对性状遗传规律时，如果这些性状是由分别位于不同对的染色体上的基因决定时，则表现为等位基因彼此分离，非等位基因自由组合，在杂种第二代就呈9：3：3：1的比例。 果蝇的灰身与檀黑身是一对相对性状，由位于第三对染色体上的等位基因E和e控制，长翅与残翅是一对相对性状，由位于第二对染色体上的等位基因Vg和vg控制。E和e，Vg和vg间为完全显性关系。根据自由组合定律，让灰身残翅(EEvgvg)的果蝇与檀黑身长翅(eeVgVg)果蝇杂交，F1代全为灰身长翅(EeVgvg)。F1代群体自交在F2代中可出现9种基因型，由于每对基因都存在着完全显隐性关系，所以F2代群体可出现四种表现型即灰身长翅，灰身残翅，檀黑身长翅，檀黑身残翅，比例为9:3:3:1。 2

位于同一条染色体上的基因是随染色体一起遗传的，既这些基因是连锁的，在同源染色体上的基因之间会发生一定频度的交换，因此其连锁关系发生改变，子代中出现一定数量的重组型。重组型出现的多少反映出基因间发生交换的频率的高低。基因在染色体上是呈直线排列的，基因间距离越远，其间发生交换的可能性就越大，即交换频率越高。反之则小，交换频率就低。也就是说基因间距离与交换频率有一定对应关系。基因图距就是通过重组值的测定而得到的。如果基因座位相距很近，重组率和交换率的值相等，可以直接根据重组率的大小作为有关基因间的相对距离，把基因按顺序地排列在染色体上，绘制出遗传连锁图。如果基因间距离较远，两个基因间往往发生两次以上的交换，这时如简单的把重组率看作交换率，那么交换率就会被低估，图距就会偏小。这时需要利用实验数据进行校正，以便正确估计图距。

基因在染色体上的相对位置的确定除了进行两个基因间的测交外，更常用的是三点测交法，既同时研究三个基因在染色体上的位置。果蝇的红眼基因W对白眼基因w为显性，正常翅基因M相对小翅基因m为显性，正常刚毛基因Sn相对焦刚毛基因sn为显性。M、Sn、W三个基因是连锁的，它们都在X染色体上，利用三点测交的方法只需通过一次杂交和一

次测交就能同时确定三个基因在染色体上的位置顺序和基因间的相对距离，绘出基因连锁图。

让白眼、小翅、焦刚毛的果蝇雌性个体与相应野生型的雄性个体杂交，F1代雌果蝇是三杂合体，表现型为野生型，F1代雄果蝇表现型为白眼、小翅、焦刚毛。让F1代的雌雄果蝇互交就等于F1代的三杂合体处女蝇与三隐性的雄性亲本测交。因此，通过对F1代雌雄果蝇的互交后代中各种表现型的比例的分析就可以进行W、Sn、M三个基因的定位。 位于性染色体上的基因，其传递方式与位于常染色体上的不同，它的传递方式与雌雄性别有关，因此称为伴性遗传。果蝇的性染色体有X和Y两种，雌蝇的性染色体为XX，是同配性别；雄蝇的性染色体组成为XY，是异配性别。伴性基因主要位于X染色体上，而Y染色体上没有响应的等位基因，所以这类遗传也叫X连锁遗传。同时，伴性遗传的基因传递特点也表现为正反交结果不同。

果蝇的红眼与白眼是一对相对性状，控制果蝇红眼和白眼的基因(W，w)位于果蝇的x染色体上，基因间的关系为完全显性。当红眼雌果蝇与白眼雄果蝇杂交，F1代雌雄果蝇均为红眼，F2代中红眼果蝇：白眼果蝇=3:1，但在雌果蝇中全为红眼的，在雄果蝇中红眼果绳；白眼果蝇=1:1。当反交时，F1代中的雌果绳为红眼，雄果蝇却为白眼。F2代中红眼果蝇：白眼果蝇=1:1，在雌果蝇或雄果蝇中红眼果绳与白眼果蝇的比例均为1:1。 三、实验材料

野生型雌雄果蝇，灰身残翅果蝇，檀黑身长翅果蝇，白眼雌雄果蝇，白眼、小翅、焦刚毛雌果蝇

四、实验器具和药品

1．器具 放大镜、麻醉瓶、培养瓶、白磁砖、毛笔、记录本。 2．药品 玉米粉、琼脂、白糖、苯甲酸、乙醚、培养基、酒精棉球。 五、实验步骤

1.根据所做实验的研究目的，设计并确定杂交组配。

2.根据杂交组配收集相应的处女蝇。供杂交实验用的亲本果蝇应为纯种果蝇，选取适当品系的果蝇接种培养。应在学生杂交实验的前半个月接种，培养度在23.5℃，培养13-14天蛹开始发黑，示果蝇成虫马上就要孵出。选取处女蝇时提前十二小时将培养瓶中的果蝇全部放出，在放出果蝇后的十二小时内挑取的雌蝇全部为处女蝇。

3.接种 将挑选的处女蝇5-10只移入培养瓶中，再按杂交组合将相应的雄果蝇5-10只移入培养瓶中，伴性遗传实验需按正、反交组合分别将处女蝇和相应雄果蝇接种于培养瓶内。贴好标签，注明杂交组合，日期及实验者姓名等。

4.培养、杂交 将接种后的杂交培养瓶置于25℃温度条件下培养。要及时观察培养基有

无霉菌感染及培养基是否干燥，当培养基干燥时需滴加少许水分以使培养基保持湿润，因果蝇幼虫必须在湿润条件下才能生长。 5.亲本蝇接种后的7一8天，在F1代未羽化以前将亲本果蝇放飞或移到死蝇盛留器中，以免亲子代间混杂。 6.观察F1代 培养11～12天后，F1代果蝇羽化出来，观察F1代的个体数量、表形和相应性别，记录在实验报告中。 7.F1自交 将F1代果蝇麻醉后挑选5一l0对雌雄果蝇移入新的培养瓶中，让其自群繁殖(正、反交各做一瓶)，在25℃条件下进行培养。 8.倒去F1代果蝇 F1代接种7—8天后放掉F1代果蝇，以免F1代与F2代果蝇的混杂。 9.观察统计F2代 F1代接种11—12天后，F2代成蝇出现，麻醉后在白磁砖上观察并记录F2代果蝇各不同类型及数目。并观察F2代个体的数量、表形和相应性别，记录在实验报告中，每隔一天统计一次，统计100—200只，每次将统计后的果蝇放飞或移入死蝇盛留器中。 六、结果统计分析 将实验结果汇总后，填入表格，并进行卡方检验，验证实验结果是否与遗传规律相符，如出现异常结果，请分析原因。在果蝇杂交实验中，你所选的品系是什么？请将实验结果记录在下面： （1） 单因子杂交实验（推荐杂交组合为长翅×残翅，灰身×檀黑身） 亲本1： 亲本2： 杂交日期： 统计各种类型果蝇的数目并填写下列表格 观察结果 统计日期 合 计 长翅果蝇 正 交 残翅果蝇 长翅果蝇 反 交 残翅果蝇 （2） 双因子杂交实验（推荐杂交组合为灰身残翅×檀黑身长翅） 亲本1： 亲本2： 杂交日期： 子代（F1）表型： 自交日期： 子代类型 统计日期 总 数 比 例 实验观察数（o） 预期数（c） 离均差（o-c） 灰身长翅 檀黑身长翅 灰身残翅 檀黑身残翅 合 计 灰身长翅 F2 檀黑身长翅 灰身残翅 檀黑身残翅 备 注 残翅果蝇 (oc)2 c自由度=n-1= (oc)2x c2P= （3） 三隐性与野生型果蝇杂交实验 亲本1： 亲本2： 杂交日期： F2代或测交后基因型 代表现型 白眼小翅焦刚毛 红眼长翅直刚毛 白眼长翅直刚毛 红眼小翅焦刚毛 红眼小翅直刚毛 白眼长翅焦刚毛 红眼长翅焦刚毛 白眼小翅直刚毛 总计 重组值 请绘出三基因连锁图。 （4） 果蝇的伴性遗传实验 正交： 反交： w sn m + + + w + + + sn m + sn + w + m + + m w sn + 统计日期 总数 w-sn Sn-m w-m 基因间是否重组 亲本1： 亲本1： 亲本2： 亲本2： 杂交日期： 杂交日期： F1代类型 观察日期 总 数 合 计 F2代类型 观察日期 总 数 合 计 正交 红眼♀×白眼♂ 反交 白眼♀×红眼♂ 备注 正交 红眼♀×白眼♂ 红眼♀ 红眼♂ 反交 白眼♀×红眼♂ 红眼♀ 白眼♂ 备注 红眼♂ 白眼♂ 红眼♀ 白眼♀ 红眼♂ 白眼♂ 红眼♀ 白眼♀ 红眼♂ 实验观察数（o） 理论预期数（c） 离均差（o-c） 红眼♀ 正交组合F2 白眼♂ 白眼♀ 合 计 (oc)2 c自由度=n-1= (oc)2x c2P= 七、实验作业 1. 用卡方检验证明你的实验结果是否正确，并写出P值，P值是否表明了除了机会误差以外还有其它因素影响你的实验结果？如果有，请写出可能的原因。 2.想一想：为什么每一杂交结果统计总数要求达到200-300只果蝇？ 000