(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 108402471 A(43)申请公布日 2018.08.17
(21)申请号 201810294362.4(22)申请日 2018.04.04
(71)申请人 吉林大学
地址 130012 吉林省长春市前进大街2699
号(72)发明人 毕景硕 王昕 周亚军
(74)专利代理机构 长春吉大专利代理有限责任
公司 22201
代理人 朱世林 张晶(51)Int.Cl.
A23L 33/165(2016.01)A23L 33/18(2016.01)A23J 3/34(2006.01)
权利要求书3页 说明书6页 附图1页
(54)发明名称
一种畜禽骨胶原多肽螯合钙的制备方法(57)摘要
本发明属于功能性食品加工领域，涉及一种畜禽骨胶原多肽螯合钙的制备方法，包括以下步骤：步骤一：使用蛋白酶酶解畜禽骨粉，得到含胶原多肽的畜禽骨粉酶解液；步骤二：使用步骤一所得畜禽骨粉酶解液与氯化钙溶液混合，进行螯合反应；步骤三：将步骤二所得螯合反应产物用截留分子量为500Da的滤膜透析24h，反应产物冷冻干燥，得畜禽骨胶原多肽螯合钙粉；或将步骤二所得螯合反应产物冷冻干燥，50倍重量的无水乙醇洗涤，离心，收集沉淀，无水乙醇溶液洗涤，再次收集沉淀冷冻干燥，得畜禽骨胶原多肽螯合钙粉；本发明的积极效果在于，可同时补充氨基酸和钙营养元素；促进解决新型钙营养强化剂短缺的问题；开发了高附加值的畜禽骨骼产品。
CN 108402471 ACN 108402471 A
权 利 要 求 书
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1.一种畜禽骨胶原多肽螯合钙的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：使用一种或一种以上蛋白酶酶解畜禽骨粉，得到含胶原多肽的畜禽骨粉酶解液；
步骤二：使用步骤一所得含胶原多肽的畜禽骨粉酶解液与氯化钙溶液混合，进行螯合反应；
步骤三：将步骤二所得螯合反应产物用截留分子量为500Da的滤膜透析，透析时间为24h，以去除反应体系中的游离钙离子，将反应产物冷冻干燥，得畜禽骨胶原多肽螯合钙粉；
或者，将步骤二所得螯合反应产物冷冻干燥得反应产物冻干粉，使用50倍重量的无水乙醇溶液洗涤反应产物冻干粉，离心，收集沉淀，再次使用无水乙醇溶液洗涤，收集相同条件下离心所得沉淀冷冻干燥，得畜禽骨胶原多肽螯合钙粉。
2.根据权利要求1所述的一种畜禽骨胶原多肽螯合钙的制备方法，其特征在于：步骤一中运用蛋白酶酶解畜禽骨粉的最优工艺条件，以获得最优的酶解效果；蛋白酶酶解畜禽骨粉的最优工艺条件：影响蛋白酶酶解的主要因素包括：酶浓度、反应温度、底物浓度、反应时间和反应pH值；通过单因素试验和试验优化设计的方法，以蛋白酶酶解的水解度和蛋白酶酶解液的钙结合活性为指标，确定酶解畜禽骨粉最适的酶浓度、反应温度、底物浓度、反应时间、反应pH值；
水解度的测定：甲醛滴定法，样品中总蛋白质的含量用凯氏定氮法测定；钙结合活性分析：将蛋白酶酶解反应所得的蛋白酶酶解液冷冻干燥，得蛋白酶酶解冻干粉；500mg/L的蛋白酶酶解冻干粉与5mM CaCl2和20mM磷酸钠缓冲液进行混合，调节混合物pH值为7.8，在22℃条件下搅拌30min，反应结束后，使用0.45μm的微孔滤膜过滤去不溶性磷酸钙盐后，上清液中的钙含量用火焰原子吸收光谱法测定；钙结合活性用每克蛋白质结合钙离子的毫摩尔数表示，单位为mmol钙/g蛋白质。
步骤二中运用螯合反应的最优反应条件，以获得最优的螯合反应效果；螯合反应的最优反应条件：
将蛋白酶酶解反应所得的蛋白酶酶解液冷冻干燥，得蛋白酶酶解冻干粉；影响螯合反应的主要因素包括：蛋白酶酶解冻干粉浓度、钙离子浓度、反应体系pH值、反应温度和反应时间五个因素；通过单因素试验和试验优化设计的方法，以螯合率和肽结合钙量为指标，确定最适的蛋白酶酶解冻干粉浓度、钙离子浓度、反应体系pH值、反应温度和反应时间；
肽结合钙量和螯合率两个指标参照如下公式计算：
Cb＝(ωt-ωf)/ωpt······················(1-1)Cb：肽结合钙量，单位：mmol/g；ωt：总钙质量，单位：g；ωf：游离钙质量，单位：g；ωpt：蛋白酶酶解冻干粉质量；
Cr＝(ωt-ωf)/ωt×100％················(1-2)Cr：螯合率(％)；ωt：总钙质量，单位：g；
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权 利 要 求 书
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ωf：游离钙质量，单位：g。
3.根据权利要求1所述的一种畜禽骨胶原多肽螯合钙的制备方法，其特征在于：
步骤一中蛋白酶酶解反应体系pH值和步骤二中螯合反应体系pH值所用的酸碱缓冲溶液为HCl和NaOH缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述的一种畜禽骨胶原多肽螯合钙的制备方法，其特征在于：步骤一中所述畜禽骨粉的制备方法为：1)鲜畜禽骨初粉碎为5cm-10cm的小块；2)去除筋、皮、骨髓和上面少量的肉；3)洗净沥干；
4)高压锅或高压反应釜中在大于80kPa下高压蒸煮1h；5)去除蒸煮液，凉水冲洗除脂，沥干；6)60℃热风干燥
7)超微粉碎机粉碎；或将两种、两种以上畜禽骨粉混合，制备混合骨粉。
5.根据权利要求1所述的一种畜禽骨胶原多肽螯合钙的制备方法，其特征在于：步骤一中蛋白酶酶解所使用的蛋白酶包括水解蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、碱性水解蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一种或几种，采用分步酶解法或混合酶解法进行酶水解。
6.根据权利要求2所述的一种畜禽骨胶原多肽螯合钙的制备方法，其特征在于：使用复合蛋白酶酶解鹿骨粉，最优酶解条件为：底物浓度5％，酶与底物的重量比为8/1000，使用1mol/L HCl溶液调节反应体系pH值为6.5，反应温度55℃，酶解时间为4h；
最优酶解条件下，得到含鹿骨胶原多肽的鹿骨粉酶解液，将其与氯化钙溶液混合进行螯合反应；
最优螯合反应条件为：将鹿骨粉酶解液、蒸馏水和0.1mol/L CaCl2溶液配制成体积比为20：17：3的反应溶液，调节反应体系pH值为7.0，在40℃下反应15min。
7.根据权利要求2所述的一种畜禽骨胶原多肽螯合钙的制备方法，其特征在于：使用风味蛋白酶和水解蛋白酶双酶酶解牛骨粉，最优酶解条件为：使用风味蛋白酶，在底物浓度5％，酶与底物的重量比为8/1000，使用1mol/L HCl和1mol/L NaOH溶液调节反应体系pH值为7.5，反应温度50℃，酶解时间为2.5h下酶解牛骨粉，100℃下灭酶10min，使用1mol/L HCl和1mol/L NaOH溶液调节反应体系pH值为9.0，按酶与牛骨粉的重量比为8/1000加入水解蛋白酶，在反应温度55℃，酶解时间为2h下进行水解蛋白酶的酶解，酶解反应结束后，100℃下灭酶10min；
最优酶解条件下，得到含牛骨胶原多肽的酶解液，将其与氯化钙溶液混合进行螯合反应；
最优螯合反应条件为：将牛骨粉酶解液、蒸馏水和0.1mol/L CaCl2溶液配制成体积比为6：3：1的反应溶液，调节反应体系pH值为8.0，在50℃下反应20min。
8.根据权利要求2所述的一种畜禽骨胶原多肽螯合钙的制备方法，其特征在于：使用木瓜蛋白酶酶解混合骨粉，最优酶解条件为：底物浓度4％，酶与底物的重量比为
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权 利 要 求 书
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1/100，使用1mol/L HCl和1mol/L NaOH溶液调节反应体系pH值为6.5，反应温度45℃，酶解时间为3h；
最优酶解条件下，得到含混合骨胶原多肽的酶解液，将其与氯化钙溶液混合进行螯合反应；
最优螯合反应条件为：将混合骨粉酶解液、蒸馏水和0.1mol/L CaCl2溶液配制成体积比为5：4：1的反应溶液，调节反应体系pH值为8.0，在45℃下反应20min。
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说 明 书
一种畜禽骨胶原多肽螯合钙的制备方法
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技术领域
[0001]本发明属于功能性食品加工领域，涉及一种畜禽骨胶原多肽螯合钙的制备方法。背景技术
[0002]中国是畜产大国，每年所养殖的畜禽产品大量销往国内外，而随着环保低碳的理念日渐加深，畜禽产品的综合利用也成为我国食品产业需要关注的一个重大问题。典型的畜禽骨所占各自总体重的比例是:猪12％—20％，牛15％—20％，羊8％—17％。以平均每年我国肉类总产量约9000万吨计算，每年约有1530万吨的畜禽骨骼没有得到充分的利用。因此，发展科技附加值高，可以提高经济效益的畜禽骨骼副产品是产品开发的重点之一。[0003]多肽螯合钙是钙离子与多肽结合形成的具有环状结构的络合物，其稳定常数比氨基酸螯合钙大，钙离子可以螯合物的形式被完整地转运吸收并有效释放。已有体内钙吸收和骨特性实验表明，多肽螯合钙的补钙效率优于碳酸钙，多肽与Ca2+螯合的反应产物可以在胃肠道环境中稳定，并可促进体内钙的吸收。肽钙螯合物可能成为一种新型的提高人体骨骼健康的营养强化剂。[0004]目前，利用畜禽骨骼开发钙营养强化剂或相关补钙产品的专利主要有三类：一类是提取畜禽骨胶原蛋白和胶原多肽，已有研究证实，骨胶原蛋白可增加骨的韧性，并可与钙结合，避免骨钙的流失，促进钙的吸收和固定，适当摄入骨胶原蛋白有缓解骨质疏松的功效；二类是畜禽骨钙类，即提取出畜禽骨中的天然钙，与其他有助于钙吸收的原料，如维生素D等共同干燥制粉，混合压片或制备为肠溶性胶囊，制成一种钙含量高的补钙产品；三类是利用畜禽骨骼，如耗牛骨、猪骨等开发骨胶原多肽螯合钙，但其在产品开发过程中存在一定缺陷，且制备工艺繁琐，不适于工业生产。发明内容
[0005]本发明所要解决的技术问题是克服了现有技术存在的胶原多肽螯合钙制备过程不统一，有漏洞，不利于实现工业生产的问题，提供了一种畜禽骨胶原多肽螯合钙的制备方法。
[0006]本发明主要目的是制备一种新型钙营养强化剂，提供了畜禽骨胶原多肽螯合钙的制备方法，适用于工业化生产。
[0007]一种畜禽骨胶原多肽螯合钙的制备方法，包括以下步骤：[0008]步骤一：使用一种或一种以上蛋白酶酶解畜禽骨粉，得到含胶原多肽的畜禽骨粉酶解液；
[0009]步骤二：使用步骤一所得含胶原多肽的畜禽骨粉酶解液与氯化钙溶液混合，进行螯合反应；
[0010]步骤三：将步骤二所得螯合反应产物用截留分子量为500Da的滤膜透析，透析时间为24h，以去除反应体系中的游离钙离子，将反应产物冷冻干燥，得畜禽骨胶原多肽螯合钙粉；
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或者，将步骤二所得螯合反应产物冷冻干燥得反应产物冻干粉，使用50倍重量的
无水乙醇溶液洗涤反应产物冻干粉，离心，收集沉淀，再次使用无水乙醇溶液洗涤，收集相同条件下离心所得沉淀冷冻干燥，得畜禽骨胶原多肽螯合钙粉。[0012]步骤一中运用蛋白酶酶解畜禽骨粉的最优工艺条件，以获得最优的酶解效果；[0013]蛋白酶酶解畜禽骨粉的最优工艺条件：[0014]影响蛋白酶酶解的主要因素包括：酶浓度、反应温度、底物浓度、反应时间和反应pH值；
[0015]通过单因素试验和试验优化设计的方法，以蛋白酶酶解的水解度和蛋白酶酶解液的钙结合活性为指标，确定酶解畜禽骨粉最适的酶浓度、反应温度、底物浓度、反应时间、反应pH值；
[0016]水解度的测定：甲醛滴定法，样品中总蛋白质的含量用凯氏定氮法测定；[0017]钙结合活性分析：将蛋白酶酶解反应所得的蛋白酶酶解液冷冻干燥，得蛋白酶酶解冻干粉；500mg/L的蛋白酶酶解冻干粉与5mM CaCl2和20mM磷酸钠缓冲液进行混合，调节混合物pH值为7.8，在22℃条件下搅拌30min，反应结束后，使用0.45μm的微孔滤膜过滤去不溶性磷酸钙盐后，上清液中的钙含量用火焰原子吸收光谱法测定；钙结合活性用每克蛋白质结合钙离子的毫摩尔数表示，单位为mmol钙/g蛋白质。[0018]步骤二中运用螯合反应的最优反应条件，以获得最优的螯合反应效果；[0019]螯合反应的最优反应条件：
[0020]将蛋白酶酶解反应所得的蛋白酶酶解液冷冻干燥，得蛋白酶酶解冻干粉；[0021]影响螯合反应的主要因素包括：蛋白酶酶解冻干粉浓度、钙离子浓度、反应体系pH值、反应温度和反应时间五个因素；通过单因素试验和试验优化设计的方法，以螯合率和肽结合钙量为指标，确定最适的蛋白酶酶解冻干粉浓度、钙离子浓度、反应体系pH值、反应温度和反应时间；
[0022]肽结合钙量和螯合率两个指标参照如下公式计算：
[0023]Cb＝(ωt-ωf)/ωpt····················(1-1)[0024]Cb：肽结合钙量，单位：mmol/g；[0025]ωt：总钙质量，单位：g；[0026]ωf：游离钙质量，单位：g；[0027]ωpt：蛋白酶酶解冻干粉质量；
[0028]Cr＝(ωt-ωf)/ωt×100％··············(1-2)[0029]Cr：螯合率(％)；[0030]ωt：总钙质量，单位：g；[0031]ωf：游离钙质量，单位：g。
[0032]步骤一中蛋白酶酶解反应体系pH值和步骤二中螯合反应体系pH值所用的酸碱缓冲溶液为HCl和NaOH缓冲溶液。
[0033]步骤一中所述畜禽骨粉的制备方法为：[0034]1)鲜畜禽骨初粉碎为5cm-10cm的小块；[0035]2)去除筋、皮、骨髓和上面少量的肉；[0036]3)洗净沥干；
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4)高压锅或高压反应釜中在大于80kPa下高压蒸煮1h；
[0038]5)去除蒸煮液，凉水冲洗除脂，沥干；[0039]6)60℃热风干燥；[0040]7)超微粉碎机粉碎；[0041]或将两种、两种以上畜禽骨粉混合，制备混合骨粉。
[0042]步骤一中蛋白酶酶解所使用的蛋白酶包括水解蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、碱性水解蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一种或几种，采用分步酶解法或混合酶解法进行酶水解。[0043]进一步优选方案：
[0044]使用复合蛋白酶酶解鹿骨粉，最优酶解条件为：底物浓度5％，酶与底物的重量比为8/1000，使用1mol/L HCl溶液调节反应体系pH值为6.5，反应温度55℃，酶解时间为4h；[0045]最优酶解条件下，得到含鹿骨胶原多肽的鹿骨粉酶解液，将其与氯化钙溶液混合进行螯合反应；
[0046]最优螯合反应条件为：[0047]将鹿骨粉酶解液、蒸馏水和0.1mol/L CaCl2溶液配制成体积比为20：17：3的反应溶液，调节反应体系pH值为7.0，在40℃下反应15min。[0048]进一步优选方案：
[0049]使用风味蛋白酶和水解蛋白酶双酶酶解牛骨粉，最优酶解条件为：使用风味蛋白酶，在底物浓度5％，酶与底物的重量比为8/1000，使用1mol/L HCl和1mol/L NaOH溶液调节反应体系pH值为7.5，反应温度50℃，酶解时间为2.5h下酶解牛骨粉，100℃下灭酶10min，使用1mol/L HCl和1mol/L NaOH溶液调节反应体系pH值为9.0，按酶与牛骨粉的重量比为8/1000加入水解蛋白酶，在反应温度55℃，酶解时间为2h下进行水解蛋白酶的酶解，酶解反应结束后，100℃下灭酶10min；[0050]最优酶解条件下，得到含牛骨胶原多肽的酶解液，将其与氯化钙溶液混合进行螯合反应；
[0051]最优螯合反应条件为：将牛骨粉酶解液、蒸馏水和0.1mol/L CaCl2溶液配制成体积比为6：3：1的反应溶液，调节反应体系pH值为8.0，在50℃下反应20min。[0052]进一步优选方案：
[0053]使用木瓜蛋白酶酶解混合骨粉，最优酶解条件为：底物浓度4％，酶与底物的重量比为1/100，使用1mol/L HCl和1mol/L NaOH溶液调节反应体系pH值为6.5，反应温度45℃，酶解时间为3h；
[0054]最优酶解条件下，得到含混合骨胶原多肽的酶解液，将其与氯化钙溶液混合进行螯合反应；
[0055]最优螯合反应条件为：将混合骨粉酶解液、蒸馏水和0.1mol/L CaCl2溶液配制成体积比为5：4：1的反应溶液，调节反应体系pH值为8.0，在45℃下反应20min。[0056]传统制备胶原多肽螯合钙的过程中，常用磷酸缓冲液调节酶水解体系和螯合反应体系的pH值，没有考虑到磷酸根会与溶液中的游离钙离子反应生成不溶性磷酸钙盐的问题，在生产过程中会影响螯合反应的进行，对生成产物的检测造成影响。[0057]传统制备胶原多肽螯合钙的方法，是将酶解液冻干粉与无机钙盐(氯化钙、氢氧化
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钙、硫酸钙等)溶解混合，在一定条件下进行螯合反应，直接向螯合反应结束的反应液中加入6-8倍的乙醇进行反应产物沉淀，再离心收集沉淀得胶原多肽螯合钙；或将螯合反应结束的反应液先蒸发浓缩至一定体积，再加入乙醇进行反应产物沉淀，离心收集沉淀得胶原多肽螯合钙。第一种产物收集方法需加入大量的乙醇，导致不必要的浪费，由于加入乙醇后溶液体积过大，离心过程不易进行，不利于产物的收集；第二种产物收集方法中，解决了乙醇不必要浪费的问题，但蒸发浓缩过程耗时较长，且可能对反应产物的结构和性质造成一定影响。因此，本发明将酶解液与CaCl2溶液螯合反应体系直接冷冻干燥得反应产物冻干粉，再用无水乙醇溶液反复洗涤，离心收集沉淀，将所得沉淀冷冻干燥得畜禽骨胶原多肽螯合钙粉；或将酶解液与CaCl2溶液螯合反应体系用截留分子量为500Da的滤膜透析24h，以去除反应体系中的游离钙离子，将反应产物冷冻干燥，得畜禽骨胶原多肽螯合钙粉。两种产物收集方法工艺流程简单，避免了其他条件对螯合产物的影响，且实现了绿色生产，节约资源。[0058]本发明所得的畜禽骨胶原多肽螯合钙可以按照标准要求制备成口服液、片剂和肠溶胶囊等类型，或作为添加剂加入到食品和保健品中。[0059]本发明的积极效果在于，提供了一种通用的畜禽骨胶原多肽螯合钙的制备方法，优化传统胶原多肽螯合钙制备工艺中存在的缺陷，简化了生产流程，使方案更适合工业化生产。
[0060]本发明一方面可以充分利用畜禽骨中的高蛋白资源制备骨胶原多肽螯合钙，既满足了人体必需氨基酸的摄入需求，也促进解决了生物利用率高的钙营养强化剂短缺的问题；另一方面也开发了高附加值的畜禽骨骼产品，为我国畜禽加工副产品——骨骼的综合利用提供了新的途径。
附图说明
[0061]下面结合附图对本发明作进一步的说明：
[0062]图1为本发明所述畜禽骨胶原多肽螯合钙的制备方法的工艺流程图。
具体实施方式
[0063]以下给出几个具体实施例，但本发明不受具体实施例限制。[0064]实施例1
[0065]首先将鲜鹿骨初粉碎为5cm-10cm的小块，去除筋、皮、骨髓和上面少量的肉，洗净沥干，在高压锅中80kPa下高压蒸煮1h，去除蒸煮液，凉水冲洗除脂，沥干，然后在60℃下热风干燥6h，将干燥鹿骨块用超微粉碎机粉碎得鹿骨粉。[0066]使用复合蛋白酶酶解鹿骨粉，最优酶解条件为：底物浓度5％，酶与底物的重量比为8/1000，反应体系pH值6.5(使用1mol/L HCl溶液调节)，反应温度55℃，酶解时间为4h。最优酶解条件下，得到含鹿骨胶原多肽的酶解液，将鹿骨粉酶解液、蒸馏水和0.1mol/L CaCl2溶液配制成体积比为20：17：3的反应溶液，调节反应体系pH值为7.0，在40℃下反应15min，[0067]螯合反应体系用截留分子量为500Da的滤膜透析24h，以去除反应体系中的游离钙离子，将反应产物冷冻干燥，得鹿骨胶原多肽螯合钙粉。[0068]实施例2
[0069]首先将鲜鹿骨初粉碎为5cm-10cm的小块，去除筋、皮、骨髓和上面少量的肉，洗净
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沥干，在高压锅中80kPa下高压蒸煮1h，去除蒸煮液，凉水冲洗除脂，沥干，然后在60℃下热风干燥6h，将干燥鹿骨块用超微粉碎机粉碎得鹿骨粉。[0070]使用复合蛋白酶酶解鹿骨粉，最优酶解条件为：底物浓度5％，酶与底物的重量比为8/1000，反应体系pH值6.5(使用1mol/L HCl溶液调节)，反应温度55℃，酶解时间为4h。最优酶解条件下，得到含鹿骨胶原多肽的酶解液，将鹿骨粉酶解液、蒸馏水和0.1mol/L CaCl2溶液配制成体积比为20：17：3的反应溶液，调节反应体系pH值为7.0，在40℃下反应15min，[0071]将螯合反应体系冷冻干燥得反应产物冻干粉，使用50倍重量的无水乙醇溶液洗涤反应产物冻干粉，在3000rpm下离心20min，收集沉淀，再次使用无水乙醇溶液洗涤，收集相同条件下离心所得沉淀冷冻干燥，得鹿骨胶原多肽螯合钙粉。[0072]实施例3
[0073]首先将鲜牛腿骨初粉碎为5cm-10cm的小块，去除筋、皮、骨髓和上面少量的肉，洗净沥干，在高压反应釜中80MPa下高压蒸煮1h，去除蒸煮液，凉水冲洗除脂，沥干，然后在60℃下热风干燥7h，将干燥鹿骨块用超微粉碎机粉碎得鹿骨粉。[0074]使用风味蛋白酶和水解蛋白酶双酶酶解牛骨粉，最优酶解条件为：首先使用风味蛋白酶，在底物浓度5％，酶与底物的重量比为8/1000，反应体系pH值7.5(使用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节)，反应温度50℃，酶解时间为2.5h下酶解牛骨粉，100℃下灭酶10min，将反应体系pH值调节为9.0(使用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节)，按酶与牛骨粉的重量比为8/1000加入水解蛋白酶，在反应温度55℃，酶解时间为2h下进行水解蛋白酶的酶解，酶解反应结束后，100℃下灭酶10min，得到含牛骨胶原多肽的酶解液。将牛骨粉酶解液、蒸馏水和0.1mol/L CaCl2溶液配制成体积比为6：3：1的反应溶液，调节反应体系pH值为8.0，在50℃下反应20min；
[0075]螯合反应体系用截留分子量为500Da的滤膜透析24h，以去除反应体系中的游离钙离子，将反应产物冷冻干燥，得牛骨胶原多肽螯合钙粉。[0076]实施例4
[0077]首先将鲜牛腿骨初粉碎为5cm-10cm的小块，去除筋、皮、骨髓和上面少量的肉，洗净沥干，在高压反应釜中80MPa下高压蒸煮1h，去除蒸煮液，凉水冲洗除脂，沥干，然后在60℃下热风干燥7h，将干燥鹿骨块用超微粉碎机粉碎得鹿骨粉。[0078]使用风味蛋白酶和水解蛋白酶双酶酶解牛骨粉，最优酶解条件为：首先使用风味蛋白酶，在底物浓度5％，酶与底物的重量比为8/1000，反应体系pH值7.5(使用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节)，反应温度50℃，酶解时间为2.5h下酶解牛骨粉，100℃下灭酶10min，将反应体系pH值调节为9.0(使用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节)，按酶与牛骨粉的重量比为8/1000加入水解蛋白酶，在反应温度55℃，酶解时间为2h下进行水解蛋白酶的酶解，酶解反应结束后，100℃下灭酶10min，得到含牛骨胶原多肽的酶解液。将牛骨粉酶解液、蒸馏水和0.1mol/L CaCl2溶液配制成体积比为6：3：1的反应溶液，调节反应体系pH值为8.0，在50℃下反应20min；
[0079]将螯合反应体系冷冻干燥得反应产物冻干粉，使用50倍重量的无水乙醇溶液洗涤反应产物冻干粉，在3000rpm下离心20min，收集沉淀，再次使用无水乙醇溶液洗涤，收集相同条件下离心所得沉淀冷冻干燥，得牛骨胶原多肽螯合钙粉。[0080]实施例5
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首先将鲜鹿骨初粉碎为5cm-10cm的小块，去除筋、皮、骨髓和上面少量的肉，洗净
沥干，在高压锅中80kPa下高压蒸煮1h，去除蒸煮液，凉水冲洗除脂，沥干，然后在60℃下热风干燥6h，将干燥鹿骨块用超微粉碎机粉碎得鹿骨粉。按照同样的步骤制备鲜猪骨粉，并将鹿骨粉与猪骨粉按1：1的比例进行混合得到混合骨粉。[0082]使用木瓜蛋白酶酶解混合骨粉，最优酶解条件为：底物浓度4％，酶与底物的重量比为1/100，反应体系pH值6.5(使用1mol/L HCl调节)，反应温度45℃，酶解时间为3h。最优酶解条件下，得到含混合骨胶原多肽的酶解液，将混合骨粉酶解液、蒸馏水和0.1mol/L CaCl2溶液配制成体积比为5：4：1的反应溶液，调节反应体系pH值为8.0，在45℃下反应20min；
[0083]将螯合反应体系冷冻干燥得反应产物冻干粉，使用50倍重量的无水乙醇溶液洗涤反应产物冻干粉，在3000rpm下离心20min，收集沉淀，再次使用无水乙醇溶液洗涤，收集相同条件下离心所得沉淀冷冻干燥，得混合骨胶原多肽螯合钙粉。
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CN 108402471 A
说 明 书 附 图
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图1
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