植物试管苗玻璃化现象的发生及防治

植物试管苗玻璃化现象的发生及防治

刘柏林

甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州 （730070 ）

E-mail：liubl926@163.com

摘 要：植物试管苗玻璃化现象在不同的植物器官、组织、细胞以及原生质体的组织培养中普遍存在。玻璃化苗的形态解剖学特征、生理生化特点与正常的试管苗有显著不同。微环境、基因型、内源激素、植株自身的生理状态等一系列因素影响玻璃化的发生。本文通过研究玻璃化的发生机制，提出具体的防治措施。

关键词：试管苗；玻璃化现象；发生机制；防治措施

1. 引言

在植物组织的离体培养中，我们常发现有外观形态异常、呈半透明状的试管苗出现，我们把这种现象称为植物试管苗的玻璃化现象，其出现的概率可高达100%[1丝

～3]

在组织培养中

2．玻璃化苗的形态解剖学特征

2.1 形态学特征

与正常苗相比,玻璃苗在形态学上发生了显著变化,其共同特点是:植株矮小肿胀,呈半透明状;茎短而粗,几乎无节间;叶片厚而狭长,皱缩或卷曲,脆弱易破碎;叶表无角质层,无功能性气孔器,叶仅有海绵组织,没有栅栏组织[7]。

Debergh 等[8]描述了洋蓟（Cynara scolymus）玻璃化苗的形成过程：叶片和小叶柄逐渐显示出多水，尤其是丛生叶中央的幼叶逐渐肿胀，然后肿胀的小叶突然明显地生长，长度约为正常叶片的 5～6 倍；绿色叶片变成半透明,最终坏死。

2.2 解剖学特征

茎皮层及髓部的薄壁组织过度生长，细胞间隙大，输导组织发育不良或畸形，导管和管胞木质化不完全。叶片的栅栏组织细胞层数减少，或仅有海绵组织。叶肉细胞间隙大，表皮组织发育不良，包括叶表角质层变薄或缺少角质层蜡质，有的是蜡质发育不完全，或蜡质结晶的结构发生变化。果胶及纤维素等也发育不良。在有些植物玻璃化苗的叶表发现有大量的排水孔。气孔器数量或多或少，但功能不正常，其原因可能是保卫细胞中胼胝质含量增加，而纤维素含量减少。叶绿体中基粒和基质的组织结构异常，叶绿素含量低。根茎之间维管组织联系有缺陷[13]。

Miguens 等[9]利用扫描电镜观察了曼陀罗（Datura insignis）正常苗与玻璃化苗叶片的表面结构，发现玻璃化苗与正常苗的表面结构有相似之处：①两者均是叶片上下表面具有气孔器；②具有相似的腺毛及非腺毛的分布；③气孔长度、直径及分布相似；④未成熟气 孔的孔道关闭，在两个保卫细胞之间被一些非结晶状的物质所堵塞。但在两类叶片上，正常气孔具有典型的肾型保卫细胞，且与生长在田间植物叶片上的气孔器很相近，而异常气 孔器的保卫细胞畸形，在其垂周或水平面上有突出物或圆形疣突产生，甚至堵塞孔道。正常苗叶片上有 80 % 的正常气孔器，而玻璃化苗只有 7 %；玻璃化苗叶片上不正常气孔器的比例达 90 %，他们认为保卫细胞畸形是导致气孔功能异常的主要原因。

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3．玻璃苗的生理生化特点

玻璃苗的干物质重、叶绿素含量、蛋白质含量下降、且生根性能极差.与木质素合成有关的羟基肉桂酸,COA连接酶和与木质化进程有关的苯丙氨酸氨解酶的活性比正常苗低得多。玻璃苗中碱性过氧化物酶同工酶活性上升,而酸性过氧化物酶同工酶活性下降。此外,可溶性酚含量发生明显变化，玻璃苗中元素含量变化较为复杂。丝石竹玻璃苗叶片中P、Fe、Cu、Mn、Co等元素含量比正常苗低,K、Ca则较高。而保卫细胞中P含量比正常苗高。李云等[11]发现珠美海棠玻璃苗中元素含量低于正常苗的有16种，包括Cl、Au、Na、Mo、Sb、Mn、K、F、As、Zn、Ca、Mg、Co、Al、Br,其含量是正常苗相应元素含量的31%~92%,元素Th和La(镧)高于正常苗含量。值得注意的是各元素在玻璃苗某些部位的分布与总体趋势并不一致。在玻璃苗中,纤维素及木质素含量下降,珠美海棠玻璃苗中二者合成的速度比正常苗降低10.38%,降解的速度反而增加18.70%,造成玻璃苗中纤维素和木质素含量下降43.68%,而且在去茎基段、茎尖段、去叶茎和叶片等部位中均低于正常苗[11]。

牛自勉等[12]用HPLC(高效液相层析)方法测定苹果砧木茎尖培养苗玻璃化过程中内源激素的变化,结果表明,玻璃化苗叶片及茎尖中GA3、IAA、ABA含量极显著降低,同时CTK含量显著上升,但在茎叶极度玻璃化时,CTK含量显著下降。他们认为GA3/CTK,IAA/CTA比值大于10时茎叶正常,比值2～5是玻璃化的临界值。

4．影响玻璃苗发生的因素

4.1 培养材料差异

培养材料种类和外殖体类型及大小显著影响着玻璃苗的发生。当外殖体越幼小,玻璃苗发生概率越大。这可能是外殖体的较老组织中含有防止玻璃苗产生的物质,或者是较大外殖体的分生组织远离培养基表面,而使其生长环境的水分状况得到改善[7]。周菊华[3]发现瑞香外殖体取材部位显著影响玻璃苗发生频率,对枝条而言,取芽和茎基之间的中段茎作外殖体易发生玻璃化现象。张翠玉等则根据月季不同品种在不同BA浓度下玻璃化程度,将10种月季分为易、较易和不易玻璃化3类。

4.2 培养基微环境的影响

已经证实，液体培养比固体培养更容易产生试管苗玻璃化，提高培养器皿内空间相对 湿度容易产生玻璃化，故提高培养基琼脂或 Ge1rite 浓度能降低玻璃苗的发生，但须注意这 也同时降低了试管苗的增殖率，而且不能排除琼脂和 Ge1rite 中高浓度 K+、Mg2+等杂质的作用[13]。试管苗培养过程中,光照、温度、湿度、pH值均间接影响着玻璃化的发生[14著减少。

～16]

。肖

玉兰等[10]研究发现,光照强度在10000～20000lx(勒克斯)范围内,随着光照强度提高,玻璃苗显

4.3无机盐和微量离子的影响

研究表明,MS培养基是控制玻璃化发生的较理想的培养基。培养基中增加K、P、Fe、Cu、Mn、Zn元素的含量,降低B含量,增加硝态氮,降低铵态氮,均可避免玻璃苗发生[7]。

4.4 琼脂种类和浓度

许多研究表明,琼脂是形成玻璃苗的重要影响因素。张燕玲[17]等报道,琼脂浓度与玻璃苗

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发生率呈极显著负相关(r=-0.982),说明提高琼脂浓度是控制玻璃化的有效途径。琼脂作为培养基的主要凝固剂,其浓度过高,会大大降低试管苗的繁殖系数,且生长缓慢[7]。

4.5 碳源和植物激素

糖作为碳源,除为细胞提供合成新化合物的碳骨架的能源外。还可以维持一定的渗透压。在MS培养基中,糖浓度与玻璃苗发生率呈极显著负相关(r=-1.00)[7]。张燕玲等[17]研究表明，糖含量与丝石竹玻璃苗率呈极显著负相关，在含糖 20 g/L 的培养基中，玻璃苗率为100 %，含糖 60 g/L 的培养基，玻璃苗率则降至 70 %。郭达初等[18]报道用 3 %或 4 % 葡萄糖替换相同浓度的蔗糖明显增加香石竹嫩梢培养物的玻璃苗百分率。李云等[19]在珠美海棠中也观察到了同样的现象，但认为葡萄糖和蔗糖对试管苗的影响未达到显著水平。Zimmerman 和 Cobb [20] 也报道矮牵牛玻璃苗叶片的还原糖含量明显较高、肌醇含量明显较低。

关于植物外源激素,普遍认为BA+NAA比KT+IBA易诱发玻璃苗形成,且随着浓度升高,玻璃化率升高。这可能是NAA诱导了培养物细胞分裂素的驯化,从而导致内源细胞分裂素较高而发生。而外源赤霉素和乙烯对玻璃化的发生没有显著影响。除此之外,一些研究者还认为内源根皮苷的含量也会影响玻璃苗的发生[7]。

5．玻璃苗发生机制

在一定程度上可以认为， 组织培养过程中试管苗的玻璃化现象实际上主要是适应性的生理问题。在自然环境中的陆生植物未见有玻璃化现象存在。 玻璃化苗绝大多数来自茎尖或茎切段培养物的不定芽，仅极少数玻璃苗来自愈伤组织的再生芽；已经成长的组织、器官不可能再玻璃化。这也是符合最年幼部分耐逆性最差的常规概念的。 已经玻璃化的试管苗，随着培养基和培养环境在培养过程中的变化是有可能逆转的，也可以通过诱导愈伤组织形成后再生成正常苗。目前,除人为增加染色体导致玻璃化的1例报告外[20]。未曾报道玻璃化发生与遗传直接有关。

通过大量的实验，我们已经掌握了一些影响玻璃化苗发生的因素，但对其发生的机理和规律还缺乏一定的理论依据。因此，我们需要进一步去探讨和研究玻璃化发生的规律和机制，掌握防治玻璃化的技术措施。李胜等[13]对玻璃化的发生机制提出了以下共识： 1）玻璃苗是在人工提供的培养基和培养条件下培养植物的产物。

2）与愈伤组织再生苗相比，从茎尖、茎段培养物直接增殖不定芽形成试管苗的进程快、时间短，至少有部分外植体分生组织还没有来得及适应新的环境。

3）试管培养不论试验设计千变万化，但有许多方面是相似的，如光照弱、培养容器内相对湿度接近饱和、氧气供应不足、培养基内各成分大多相似、无机供应处于完全速效状态和异养营养等等。但是不同植物生长分化的需求差异甚大。因此，对于比较相似的培养基和培养条件，不同植物所不能满足的需求是不相同的，这也可能是不同植物产生玻璃苗 的原因的不同缘由。

4）可以认为，微繁殖中试管苗的玻璃化现象实际上主要是适应性的生理问题。

丰锋[7]将玻璃化的机理概括为：离体培养过程中培养基与外殖体的水势梯度过大,造成水分失调,逆境乙烯,因此而形成并打破内源激素的平衡,造成某些代谢过程受阻,代谢过程受阻又反过来抑制离子的吸收,从而加重生理失调。这一系列犹如链式反应,是连续和循环的过程,这样就导致玻璃化。

大量实验各自阐述了玻璃化产生机理的不同侧面，对玻璃化发生机理的系统性研究还很

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缺乏，应此，我们下一步的研究要从系统研究着手，掌握玻璃化发生的普遍规律。

6．玻璃化苗的防治措施

随着组培工作的研究进展，很多工作者通过大量试验从不同的侧面提出了防治玻璃化发生的具体措施，为大规模的组培生产解决了一些障碍。Leshem和 Sachs [22] 曾指出玻璃化是生长因子不平衡的产物。大量实验发现培养基和培养条件不适宜、不平衡是试管苗玻璃化的发生原因。玻璃化问题实质上是适应性问题，即不同种类植物不同个体的适应性差异的问题。因此，在控制玻璃化的发生时，大多数学者都采用如下的措施[13]：

1）适当提高光照培养时的光照强度。延长光照时间，因强光有助于克服玻璃化，却未见光照有增加玻璃化发生率的报道。

2）琼脂浓度不低于 0.8 %，条状琼脂事先用双蒸馏水浸泡 24 h 以去杂质，使用粒状琼脂时尽可能选用含灰量低于 2.5 %。因为琼脂杂质中的 Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+等含 量高，会影响培养基中矿质元素的适宜含量和合理比例。

3）注意通气以尽可能降低培养容器内的空气相对湿度和改善氧气供应状况，可以采用上海和北京等几家组培器皿生产公司生产的可调节通气的组培专用瓶。

4）适当降低培养基中NH4+浓度，或者及时转移，NH4+浓度高低交替以兼顾不定芽增殖系数和控制玻璃苗发生。适当提高培养基中的 Ca2+浓度可能有益，至少不会增加玻璃苗的发生。

5）注意碳源种类和浓度的选择，梁海曼等对石竹培养物的分析表明玻璃苗的总可溶性糖含量较高而蔗糖含量明显较低，故玻璃苗的糖代谢异常。因此，有必要对碳源供应进行深入研究。

6）适当添加 IAA、GA3、ABA，减少 BA。一般认为 IAA 对植物幼茎，叶柄等组织木质化部的分化有直接作用，GA3对蛋白酶、核酸、淀粉酶的生物合成有促进作用，GA3，IAA 的急剧下降可能诱发木质素、蛋白质以及核酸等物质合成的失调，而 ABA 的适当含量是维持植物正常生长所必需。

7）考虑到玻璃化发生是“生长因子不平衡的产物”、是培养物“中毒”、不能很好适应培养基和培养环境的结果，因而，注意提高培养物对逆境的耐受能力应该是有益的。 8）在高温季节，培养室必须有降温设施，控制室温不超过 32℃。 9）减小接种密度。

10）外植体的类型影响玻璃苗的产生，这与内源激素的含量和分布有关，一般来说，选取顶芽部位有助于减少玻璃苗的产生。

7．展望

随着对植物组织培养技术在理论上的深入研究，玻璃化现象的发生及其机理被人们更多的认识，并在实践中采取了具体的措施来防治玻璃化的发生。由于植物组织培养是细胞工程、基因工程必不可少的操作系统，是进行大规模快繁育苗和生产植物次生代谢产物的重要手段，因此，我们必须要防治玻璃化的发生给我们的生产实践带来的损失。从理论和实践上对玻璃化的研究都具有巨大的潜力，研究玻璃化的发生机制和解决防治玻璃化的措施有很广阔的应用前景。

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Occurrence and prevention of vitrification in the test -tube

plantlets

Liu Bailin

College of life science and technology ,Gansu Agricultural university , lanzhou (730070）

Abstract

Plant test-tube plantlets vitrification generally exists in different plant organ, tissue, cell, protoplast. Vitrificated plantlets are prominently different from normal test-tube plantlets in anatomical characteristic, physiological characteristic and biochemical characteristic. Occurrence of vitrificated plantlets is influenced by a series of elements such as micro-environment, genotype, endogenous hormone, self-physiological state . The specific methods for preventing and controlling were raised through studying the emergence mechanism of vitrification.

Keywords：test-tube plantlets; vitrification phenomenon; the happening mechanism; prevention measure

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