(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 112513262 A(43)申请公布日 2021.03.16
(21)申请号 201980046835.1(22)申请日 2019.07.03
(30)优先权数据
2018-133086 2018.07.13 JP(85)PCT国际申请进入国家阶段日2021.01.12(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/JP2019/026513 2019.07.03(87)PCT国际申请的公布数据WO2020/013058 JA 2020.01.16(71)申请人 宝生物工程株式会社地址 日本滋贺县草津市
(72)发明人 上森隆司 松本裕之 斋藤宪介
秋友美和
(74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公
司 72001
代理人 罗文锋 李志强(51)Int.Cl.
C12N 9/12(2006.01)C12N 15/54(2006.01)
权利要求书2页 说明书19页
序列表23页
(54)发明名称
适合于从RNA进行核酸扩增的DNA聚合酶突变体
(57)摘要
提供：具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体，所述DNA聚合酶突变体包含由12个特定氨基酸A1‑A12组成的序列，其中所述具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体的特征在于A3和/或A10氨基酸被不同于引入突变之前的氨基酸残基的碱性氨基酸残基取代；试剂盒和包含所述DNA聚合酶的组合物；用于生产所述DNA聚合酶的方法；以及用于修饰具有逆转录酶活性的现有DNA聚合酶的方法。
CN 112513262 ACN 112513262 A
权 利 要 求 书
1/2页
1.一种具有逆转录酶活性并包含由12个氨基酸A1‑A12组成的序列的DNA聚合酶的突变体：
A1为支链氨基酸残基，
A2为亲水性中性氨基酸残基或疏水性脂肪族氨基酸残基，A3为亲水性中性氨基酸残基，
A4为酸性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A5为支链氨基酸残基，
A6为疏水性脂肪族氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A7为支链氨基酸残基，
A8为脯氨酸残基或亲水性中性氨基酸残基，
碱性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A9为疏水性芳香族氨基酸残基、
A10为酸性氨基酸残基或碱性氨基酸残基，
和A11为酸性氨基酸残基，
A12为疏水性脂肪族氨基酸残基；
其中A3和/或A10被不同于引入突变之前的氨基酸残基的碱性氨基酸残基替代。2.权利要求1的突变体，其中所述在引入突变之前的由12个氨基酸组成的序列包含亮氨酸作为A1、谷氨酰胺作为A3、亮氨酸作为A5、异亮氨酸作为A7、谷氨酸作为A11和丙氨酸作为A12。
3.权利要求1或2的突变体，其中所述由12个氨基酸组成的序列中的A3和/或A10被选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸替代。
4.权利要求1‑3中任何一项的突变体，其为来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的DNA聚合酶、来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶、来自热坚芽孢杆菌(Bacillus cardotenax)的DNA聚合酶、来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的DNA聚合酶或来自酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的DNA聚合酶的突变体。
5.一种含有权利要求1‑4中任何一项的突变体的试剂盒。6.一种包含权利要求1‑4中任何一项的突变体的组合物。
7.一种用于产生适合于从RNA进行核酸扩增的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶的方法，所述方法包括：
(1) 选择包含由12个氨基酸A1‑A12组成的序列的DNA聚合酶的步骤：A1为支链氨基酸残基，
A2为亲水性中性氨基酸残基或疏水性脂肪族氨基酸残基，A3为亲水性中性氨基酸残基，
A4为酸性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A5为支链氨基酸残基，
A6为疏水性脂肪族氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A7为支链氨基酸残基，
A8为脯氨酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A9为疏水性芳香族氨基酸残基、碱性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，
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CN 112513262 A
权 利 要 求 书
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A10为酸性氨基酸残基或碱性氨基酸残基，A11为酸性氨基酸残基，和
A12为疏水性脂肪族氨基酸残基；和
(2) 用不同于引入突变之前的氨基酸残基的碱性氨基酸残基替代步骤(1)中选择的DNA聚合酶的由12个氨基酸组成的序列中的A3和/或A10的步骤。
8.权利要求7的方法，其中步骤(1)中选择的所述DNA聚合酶包含由12个氨基酸组成的序列，其中A1为亮氨酸，A3为谷氨酰胺，A5为亮氨酸，A7为异亮氨酸，A11为谷氨酸和A12为丙氨酸。
9.权利要求7 或8的方法，其中在步骤(2)中，A3和/或A10被选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸替代。
10.一种用于改善具有逆转录酶活性并包含由12个氨基酸A1‑A12组成的序列的DNA聚合酶的方法：
A1为支链氨基酸残基，
A2为亲水性中性氨基酸残基或疏水性脂肪族氨基酸残基，A3为亲水性中性氨基酸残基，
A4为酸性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A5为支链氨基酸残基，
A6为疏水性脂肪族氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A7为支链氨基酸残基，
A8为脯氨酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A9为疏水性芳香族氨基酸残基、碱性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A10为酸性氨基酸残基或碱性氨基酸残基，A11为酸性氨基酸残基，和
A12为疏水性脂肪族氨基酸残基；
所述方法包括用另一个碱性氨基酸残基替代A3和/或A10。
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CN 112513262 A
说 明 书
适合于从RNA进行核酸扩增的DNA聚合酶突变体
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技术领域
[0001]本发明涉及适合于从RNA进行核酸扩增反应的DNA聚合酶突变体。此外，本发明涉及一种用于增强现有的DNA聚合酶对从RNA进行核酸扩增的活性的方法，以及一种用于产生适合于从RNA进行核酸扩增反应的DNA聚合酶突变体的方法。
背景技术
[0002]DNA聚合酶在世世代代的遗传信息准确传递中，即在基因组的复制和保留中起核心作用。DNA聚合酶在细胞内起负责DNA合成的酶的作用，并在存在金属活化剂(比如Mg2+)的情况下，按DNA模板或多核苷酸模板复制所需的顺序聚合脱氧核糖核苷三磷酸。DNA聚合酶参与一系列DNA合成过程，包括体内DNA复制、DNA修复、重组和基因扩增。在DNA合成过程期间，DNA模板被复制一次或多次以产生相同的复制物。相比之下，DNA复制可在体外，例如在聚合酶链反应中重复多次。
[0003]所谓的逆转录聚合酶链反应(RT‑PCR)为一种用于通过扩增来检测或量化目标RNA的技术，并在许多应用中使用。为了通过PCR扩增目标RNA，首先需要将RNA模板逆转录为cDNA。典型的RT‑PCR方法通过使用逆转录酶用于从RNA模板合成cDNA和使用耐热DNA聚合酶用于从合成的cDNA作为模板进行核酸扩增来进行。在这种情况下，需要选择适合于所使用的逆转录酶和耐热DNA聚合酶两者的反应溶液组成。在某些情况下，反应管的盖子可在逆转录反应和随后的核酸扩增反应之间打开，并且不能忽视交叉污染的风险。因此，已经开发了一种单步RT‑PCR方法，用于在不打开反应容器的情况下连续进行逆转录反应和PCR。在该方法中，可使用具有逆转录酶活性的DNA聚合酶。然而，由于逆转录反应和PCR使用相同的反应溶液组成进行，因此需要平衡逆转录反应和PCR。进一步地，已经报道了用于在相同反应溶液组成中进行逆转录反应和PCR时提高逆转录效率的技术(参见专利文献1‑3)。[0004]近年来，提出了各种等温核酸扩增反应方法并投入实际使用。等温核酸扩增方法也经常与使用RNA作为模板的逆转录反应组合使用，并且出现了与如上所述的RT‑PCR方法相同的问题。换句话说，对于RT‑等温核酸扩增方法，也需要在相同反应溶液组成中进行逆转录反应和等温核酸扩增和平衡逆转录反应和等温核酸扩增。[0005]引文列表
专利文献专利文献1：JP‑B 3844975专利文献2：WO2012/139748专利文献3：WO2014/090836发明概述
本发明要解决的问题
本发明的目的为提供一种基因工程改良方法用于产生具有逆转录酶活性的DNA聚
合酶，其适合于在同一容器中进行逆转录反应和核酸扩增反应。[0006]问题的解决方案
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说 明 书
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本发明人努力地研究开发了具有逆转录酶活性的适合于进行逆转录反应和核酸
扩增反应的DNA聚合酶突变体。结果，本发明人出乎意料地成功找到一种通过将突变引入到氨基酸序列中的特定位置来产生具有优于常规技术的逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体的方法。从而完成了本发明。
[0007]本发明的第一实施方案涉及具有逆转录酶活性并包含由12个氨基酸A1‑A12组成的序列的DNA聚合酶的突变体：
A1为支链氨基酸残基，
A2为亲水性中性氨基酸残基或疏水性脂肪族氨基酸残基，A3为亲水性中性氨基酸残基，
A4为酸性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A5为支链氨基酸残基，
A6为疏水性脂肪族氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A7为支链氨基酸残基，
A8为脯氨酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A9为疏水性芳香族氨基酸残基、碱性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A10为酸性氨基酸残基或碱性氨基酸残基，A11为酸性氨基酸残基，和
A12为疏水性脂肪族氨基酸残基；
其中A3和/或A10被不同于引入突变之前的氨基酸残基的碱性氨基酸残基替代。
[0008]在本发明第一实施方案的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体中，在引入突变之前的由12个氨基酸组成的序列优选地包含亮氨酸作为A1、谷氨酰胺作为A3、亮氨酸作为A5、异亮氨酸作为A7、谷氨酸作为A11和丙氨酸作为A12。在本发明第一实施方案的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体中，由12个氨基酸组成的序列中的A3和/或A10优选地被选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸替代。例如，优选的是A3和/或A10被精氨酸替代。
[0009]本发明第一实施方案的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体可衍生自任何DNA聚合酶，其没有特别限制，只要突变体衍生自适合于在同一容器中进行逆转录反应和核酸扩增反应的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶。例如，本发明的DNA聚合酶突变体优选地衍生自来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的DNA聚合酶、来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶、来自热坚芽孢杆菌(Bacillus cardotenax)的DNA聚合酶、来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的DNA聚合酶或来自酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的DNA聚合酶。[0010]本发明的第二实施方案涉及一种试剂盒，其含有本发明第一实施方案的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体。试剂盒可含有各种成分，作为用于制备适合于如下所述的逆转录反应和核酸扩增反应的反应溶液的试剂盒。
[0011]本发明的第三实施方案涉及一种包含本发明第一实施方案的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体的组合物。组合物可包含各种成分作为适合于如下所述的逆转录反应和核酸扩增反应的组合物。
[0012]本发明的第四实施方案涉及一种用于产生适合于从RNA进行核酸扩增的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶的方法，所述方法包括：
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说 明 书
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(1) 选择包含由12个氨基酸A1‑A12组成的序列的DNA聚合酶的步骤：A1为支链氨基酸残基，
A2为亲水性中性氨基酸残基或疏水性脂肪族氨基酸残基，A3为亲水性中性氨基酸残基，
A4为酸性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A5为支链氨基酸残基，
A6为疏水性脂肪族氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A7为支链氨基酸残基，
A8为脯氨酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A9为疏水性芳香族氨基酸残基、碱性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A10为酸性氨基酸残基或碱性氨基酸残基，A11为酸性氨基酸残基，和
和A12为疏水性脂肪族氨基酸残基；
(2) 用不同于引入突变之前的氨基酸残基的碱性氨基酸残基替代步骤(1)中选择
的DNA聚合酶的由12个氨基酸组成的序列中的A3和/或A10的步骤。[0013]在本发明第四实施方案的产生方法中，步骤(1)中选择的DNA聚合酶可包含由12个氨基酸组成的序列，其中A1为亮氨酸，A3为谷氨酰胺，A5为亮氨酸，A7为异亮氨酸，A11为谷氨酸和A12为丙氨酸。在步骤(2)中，A3和/或A10可被选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸替代。
[0014]本发明第四实施方案的产生方法可与包括产生编码突变体的核酸并然后将核酸引入到适当的宿主中以表达突变体的方法组合。
[0015]本发明的第五实施方案涉及一种用于改善具有逆转录酶活性并包含由12个氨基酸A1‑A12组成的序列的DNA聚合酶的方法：
A1为支链氨基酸残基，
A2为亲水性中性氨基酸残基或疏水性脂肪族氨基酸残基，A3为亲水性中性氨基酸残基，
A4为酸性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A5为支链氨基酸残基，
A6为疏水性脂肪族氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A7为支链氨基酸残基，
A8为脯氨酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A9为疏水性芳香族氨基酸残基、碱性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A10为酸性氨基酸残基或碱性氨基酸残基，A11为酸性氨基酸残基，和
A12为疏水性脂肪族氨基酸残基；
所述方法包括用另一个碱性氨基酸残基替代A3和/或A10。
[0016]在本发明第五实施方案的改善方法中，作为具有逆转录酶活性的DNA聚合酶，例如可选择包含由12个氨基酸组成的序列(其中A1为亮氨酸，A3为谷氨酰胺，A5为亮氨酸，A7为异亮氨酸，、A11为谷氨酸和A12为丙氨酸)的DNA聚合酶。进一步地，在本发明第五实施方案
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的改善方法中，由12个氨基酸组成的序列中的A3和/或A10可例如被选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸替代。
[0017]在本发明的第一至第五实施方案中，优选的是具有逆转录酶活性的DNA聚合酶包含由12个氨基酸A1‑A12组成的序列：
A1为亮氨酸，
A2为丝氨酸或丙氨酸，A3为谷氨酰胺，
A4为谷氨酸或天冬酰胺A5为亮氨酸，
A6为丙氨酸或天冬酰胺，A7为异亮氨酸，A8为脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸，
精氨酸或谷氨酰胺，A9为酪氨酸、
A10为谷氨酸或赖氨酸，A11为谷氨酸，和A12为丙氨酸；并且在突变体中，A3和/或A10被不同于引入突变之前的氨基酸残基
的碱性氨基酸残基替代。例如，在DNA聚合酶突变体中，A3和/或A10可被选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸替代。[0018]发明效果
本发明提供适合于在同一容器中进行逆转录反应和核酸扩增反应的具有逆转录
酶活性的DNA聚合酶突变体以及用于产生突变体的方法。根据本发明，引入如本发明所述的突变可在具有逆转录酶活性并且包含由如上所述的A1‑A12所示的特定部分氨基酸序列的任何DNA聚合酶中进行。结果，与常规方法相比较，可缩短逆转录反应所需的时间，可在随后的核酸扩增反应中对于起始模板以足够的量产生DNA，并且可在短时间内以比常规方法更高的检测灵敏度实现逆转录酶反应和核酸扩增反应。[0019]用于实施发明的方式
1. 本发明具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体
本发明的第一方面涉及一种适合于逆转录酶反应和核酸扩增反应的DNA聚合酶突
变体。本发明的突变体为具有逆转录酶活性的包含由12个氨基酸A1‑A12组成的序列的DNA聚合酶的突变体：
A1为支链氨基酸残基；
A2为亲水性中性氨基酸残基或疏水性脂肪族氨基酸残基；A3为亲水性中性氨基酸残基；
A4为酸性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基；A5为支链氨基酸残基；
A6为疏水性脂肪族氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基；A7为支链氨基酸残基；
A8为脯氨酸残基或亲水性中性氨基酸残基；A9为疏水性芳香族氨基酸残基、碱性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基；
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A10为酸性氨基酸残基或碱性氨基酸残基；A11为酸性氨基酸残基；和
A12为疏水性脂肪族氨基酸残基；其中在突变体中，A3和/或A10被另一个碱性氨基酸残基替代。
[0020]包含如上所述的构成的突变体为适合于在一个容器中进行逆转录反应和核酸扩增反应的DNA聚合酶突变体。[0021]如本文使用的“支链氨基酸残基”的实例包括缬氨酸残基、异亮氨酸残基和亮氨酸残基。“亲水性中性氨基酸残基”的实例包括丝氨酸残基、苏氨酸残基、天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基。“疏水性脂肪族氨基酸残基”的实例包括甘氨酸残基和丙氨酸残基。“酸性氨基酸残基”的实例包括天冬氨酸残基和谷氨酸残基。“疏水性芳香族氨基酸残基”的实例包括苯丙氨酸残基、酪氨酸残基和色氨酸残基。“碱性氨基酸残基”的实例包括赖氨酸残基、精氨酸残基和组氨酸残基。
[0022]在本发明的一个特定方面，例如具有逆转录酶活性并包含由12个氨基酸A1‑A12组成的序列(其中A1为亮氨酸，A3为谷氨酰胺，A5为亮氨酸，A7为异亮氨酸，A11为谷氨酸和A12为丙氨酸)的DNA聚合酶，可用作突变体的材料。
[0023]本发明突变体的一个优选实例为包含由12个氨基酸A1‑A12组成的序列并具有逆转录酶活性的DNA聚合酶的突变体，其中在突变体中，A3和/或A10的氨基酸被选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸(优选地被精氨酸)替代。
[0024]本发明突变体的一个更优选实例为DNA聚合酶的突变体，其中所述DNA聚合酶具有逆转录酶活性并包含由12个氨基酸A1‑A12组成的序列：
A1为亮氨酸，
A2为丝氨酸或丙氨酸，A3为谷氨酰胺，
A4为谷氨酸或天冬酰胺A5为亮氨酸，
A6为丙氨酸或天冬酰胺，A7为异亮氨酸，A8为脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸，A9为酪氨酸、精氨酸或谷氨酰胺，A10为谷氨酸或赖氨酸，A11为谷氨酸，和A12为丙氨酸；并且在突变体中，A3和/或A10被不同于引入突变之前的氨基酸残基的碱性氨基酸
残基替代，例如被选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸替代。[0025]例如，在来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶的情况下，SEQ ID NO: 1中680‑691位的氨基酸序列，具体地讲“LSQELAIPYEEA”(SEQ ID NO: 18)的氨基酸序列对应于由A1‑A12组成的序列。因此，本发明突变体的一个实例为来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的DNA聚合酶的突变体，其中A3 (682位)的谷氨酰胺残基和/或A10 (689位)的谷氨酸残基被选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸(优选
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精氨酸)替代。具有“LSRELAIPYREA”(SEQ ID NO: 19)的嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)来源的DNA聚合酶突变体可优选地用作适合于逆转录酶反应和核酸扩增反应的DNA聚合酶突变体。例如，作为实施例1中制备的来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的DNA聚合酶的突变体的突变体b13b46具有如上所述的突变Q682R和E689R。[0026]也可由来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)、热坚芽孢杆菌(Bacillus cardotenax)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)和酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶制备类似的突变体。
[0027]在本发明的一个特定方面，例如来自热坚芽孢杆菌(Bacillus cardotenax)的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶具有“LAQNLNISRKEA”(SEQ ID NO: 20)的序列作为由12个氨基酸A1‑A12组成的序列。类似地，来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶的12个氨基酸的序列为“LAQNLNITRKEA”(SEQ ID NO: 21)的序列。此外，来自酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶的12个氨基酸的序列为“LAQNLNIPQKEA”(SEQ ID NO: 22)的序列。来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶的12个氨基酸的序列为“LSQELAIPYEEA”(SEQ ID NO: 25的678‑689位)的序列。当这些氨基酸序列中的A3和/或A10被碱性氨基酸残基替代时，所得的突变体被引用为本发明突变体的实例。在突变体中，例如A3和/或A10被选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸替代。特别优选的是其中A3和/或A10被精氨酸替代的突变体。除这些突变体之外，本发明DNA聚合酶突变体的实例包括通过将与上述相同的突变引入到来自嗜热细菌的耐热聚合酶和适合于等温核酸扩增方法的嗜温性DNA聚合酶中获得的突变体。换句话说，Pol I型或家族A型DNA聚合酶也可适合用作本发明中用于引入突变的目标物。
[0028]本发明的DNA聚合酶突变体可包含上述突变与引入到除A1‑A12的12个氨基酸的序列以外的位置中的突变的组合，只要逆转录酶活性和核酸扩增活性不受损害即可。这种DNA聚合酶突变体的实例包括(但不限于)在除A1‑A12的12个氨基酸的序列以外的部分中与引入突变之前的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶(例如来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶(NCBI参考序列WP_0112288405.1)或来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶(Genbank登录号BAA06775.1))的氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性的功能性DNA聚合酶。这些DNA聚合酶可适合用于RT‑PCR。类似地，对于RT‑等温核酸扩增，DNA聚合酶突变体的实例包括在除A1‑A12的12个氨基酸的序列以外的部分中与来自热坚芽孢杆菌(Bacillus cardotenax)的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶(NCBI参考序列WP_0475858145.1)、来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶(Genbank登录号AAA8558.1)或来自酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶(Genbank登录号BAF3333.1)的氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性的功能性DNA聚合酶。
[0029]本发明具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体可为进一步缺乏外切核酸酶活性的
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突变体。例如，关于来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、热坚芽孢杆菌(Bacillus cardotenax)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)等的DNA聚合酶，存在已知的缺乏5→3外切核酸酶活性的突变体。缺乏外切核酸酶活性的突变体缺少位于DNA聚合酶的N‑末端侧的5→3外切核酸酶结构域。本发明的突变体可为不具有5→3外切核酸酶活性的突变体，其中缺失5→3外切核酸酶结构域。
[0030]使用本发明具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体即使在引入突变之前的DNA聚合酶不能实现逆转录的逆转录反应条件下也导致产生期望的cDNA。逆转录反应条件的实例包括反应时间减少和反应温度升高。进一步地，当在相同条件下进行逆转录时，与使用引入突变之前的DNA聚合酶相比较，使用本发明具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体导致逆转
thermophilus)的具有逆转录录反应产物的量增加。例如，使用来自嗜热栖热菌(Thermus酶活性的DNA聚合酶进行逆转录反应需要在60℃下约30分钟的反应时间。当使用由来自嗜
thermophilus)的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶制备的本发明突变体热栖热菌(Thermus时，可在1‑5分钟的短时间内完成在60℃下的逆转录反应。另外，本发明的突变体在逆转录反应方面优于通过日本专利号3844975中公开的技术制备的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体。与具有逆转录酶活性的常规DNA聚合酶相比较，预期本发明的突变体在反应期间对抑制剂的抗性和与核酸模板的亲和性方面具有进一步改善。根据本发明，可显著改善原本具有低逆转录酶活性的Pol I型或家族A型DNA聚合酶的逆转录酶活性，并由此可产生适合于进行逆转录反应和核酸扩增反应的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体。[0031]本发明的突变体可为与PIP盒(PCNA相互作用蛋白盒)的融合蛋白。PCNA为促进DNA聚合酶活性的蛋白，也可促进具有逆转录酶活性的DNA聚合酶的逆转录酶活性。与PIP盒融合的本发明DNA聚合酶突变体可例如通过使用如本文所述的技术和如WO2017/090685所述的技术的组合来制备。[0032]2. 含有本发明DNA聚合酶突变体的组合物或试剂盒
本发明的组合物意指包含如上所述的本发明具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变
体的组合物。作为本发明组合物的一个方面，提供一种适合于逆转录反应和核酸扩增反应的组合物，其包含如以上第1部分所述的本发明适合于逆转录酶反应和核酸扩增反应的DNA聚合酶突变体以及其他成分，例如逆转录反应和聚合酶链反应(RT‑PCR)所需要的成分，比如二价金属盐、dNTP、缓冲液成分、还原剂、无菌水等。当已知待扩增/检测的RNA时，本发明的组合物还可包含适当的引物。当本发明的突变体适合于逆转录反应和等温核酸扩增反应时，本发明的组合物优选地包含与以上所述相同的成分，只要组合物包含逆转录反应和等温核酸扩增反应所需要的成分即可。
[0033]构成二价金属盐的二价金属离子的实例包括(但不限于)锰离子和镁离子。适合于逆转录酶的二价金属离子及其浓度为本领域已知的。二价金属离子可以盐比如氯化物、硫
例如，本发明组合物中二价金属离子的浓度可优选地为0.5‑20 酸盐或乙酸盐的形式提供。
mM。作为dNTP，使用选自dATP、dCTP、dGTP和dTTP及其衍生物中的至少一种。优选地，使用dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物。[0034]用于保持pH的缓冲液成分的实例包括(但不限于)Tris缓冲液、曲辛(tricine)缓冲液、N‑二(羟乙基)甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、乙酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。例如，适
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合于逆转录反应和核酸扩增反应的缓冲液成分及其浓度为本领域已知的。用于逆转录反应的还原剂的实例包括(但不限于)DTT (二硫苏糖醇)和2‑巯基乙醇。适合于逆转录反应的还原剂及其浓度为本领域已知的。[0035]对于逆转录反应，例如可使用随机6聚体寡dT引物和基因特异性引物作为引物。引物的链长从杂交特异性的观点出发，优选地为6个核苷酸或更多，更优选地为10个核苷酸或更多，和从寡核苷酸合成的观点出发，优选地为100个核苷酸或更少，更优选地为30个核苷酸或更少。作为用于非特异性cDNA合成的随机引物，可使用链长为6‑8个核苷酸的寡核苷酸的混合物。寡核苷酸可例如通过已知方法化学合成，或者可衍生自生物样品。例如，可通过用限制性内切核酸酶消化从天然样品制备的DNA，并然后从消化的产物中分离寡核苷酸来制备衍生自生物样品的寡核苷酸。对于核酸扩增反应，本发明的组合物可包含针对待扩增的核酸序列设计的引物对。用于逆转录反应的引物也可用作用于核酸扩增的引物对之一。[0036]本发明的试剂盒为适合于逆转录反应方法和核酸扩增反应方法的用于RT‑PCR的试剂盒或用于RT‑等温核酸扩增的试剂盒。本发明的试剂盒含有如以上第1部分所述的本发明适合于逆转录反应和核酸扩增反应的DNA聚合酶突变体以及二价金属盐、dNTP、缓冲液成分、还原剂或适合于逆转录反应和核酸扩增反应的其他成分。本发明试剂盒的实例包括用于通过在使用时混合试剂盒中含有的成分来制备逆转录反应/核酸扩增反应溶液的试剂盒、含有如上所述的本发明组合物的可仅通过在使用时向组合物中添加DNA模板和水(无菌水等)来使用的试剂盒以及含有干燥形式的如上所述的本发明组合物的试剂盒。本发明还包括用于检测特定RNA的含有对目标RNA特异性的引物和作为阳性对照的RNA的试剂盒。二价金属盐、dNTP、缓冲液成分和还原剂如上所述。
[0037]本发明的组合物和试剂盒可进一步含有用于检测扩增的双链核酸所需要的成分，例如嵌入剂或荧光标记的探针。嵌入剂的实例包括SYBR (注册商标)、Green I、TB Green (注册商标)和其他核酸结合染料。荧光标记的探针的实例包括TaqMan (注册商标)探针、Cycleave (注册商标)探针和分子信标探针。[0038]3. 用于产生本发明具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体的方法
用于产生本发明适合于逆转录酶反应和核酸扩增反应的DNA聚合酶突变体的方法
涉及用于产生如以上第1部分所述的DNA聚合酶突变体的方法。
[0039]本发明产生方法的一个特定方面为一种用于产生适合于从RNA进行核酸扩增的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶的方法，所述方法包括：
(1) 选择包含由12个氨基酸A1‑A12组成的序列的DNA聚合酶的步骤：A1为支链氨基酸残基，
A2为亲水性中性氨基酸残基或疏水性脂肪族氨基酸残基，A3为亲水性中性氨基酸残基，
A4为酸性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A5为支链氨基酸残基，
A6为疏水性脂肪族氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A7为支链氨基酸残基，
A8为脯氨酸残基或亲水性中性氨基酸残基，A9为疏水性芳香族氨基酸残基、碱性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，
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A10为酸性氨基酸残基或碱性氨基酸残基，A11为酸性氨基酸残基，和
A12为疏水性脂肪族氨基酸残基；和
(2) 用不同于引入突变之前的氨基酸残基的碱性氨基酸残基替代步骤(1)中选择
的DNA聚合酶的由12个氨基酸组成的序列中的A3和/或A10的步骤。[0040]在以上方面中，可选择包含由12个氨基酸组成的序列(其中A1为亮氨酸，A3为谷氨酰胺，A5为亮氨酸，A7为异亮氨酸，A11为谷氨酸和A12为丙氨酸)的DNA聚合酶作为用于引入突变的材料。
[0041]在本发明产生方法的步骤(2)中，优选地所选择的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶中的A3和/或A10被选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸替代，更优选地被精氨酸替代。[0042]可经由常规方法，例如经由计算机同源性搜索，通过提取包含由12个氨基酸A1‑A12组成的序列的DNA聚合酶来进行步骤(1)。为了进行搜索，可使用已知的氨基酸序列数据库。
[0043]通过制备编码在步骤(1)中选择的DNA聚合酶的核酸，并将对应于核酸中的A3和/或A10的密码子转化为碱性氨基酸残基的密码子来进行步骤(2)。这种碱基取代可通过已知方法进行。例如，可使用用于引入突变的市售试剂盒。可化学合成编码其中引入突变的突变体的全长核酸。此外，引入如上所述的突变可与将突变引入到除A1‑A12的12个氨基酸的序列以外的位置中组合。
[0044]为了产生本发明具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体，可制备编码突变体的核酸并将其引入到适当的宿主中以表达突变体。可进行密码子优化以允许目标突变体在所用宿主中表达或提高表达水平。密码子优化优选地通过本领域通常使用的方法进行。[0045]在本发明具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体的产生中，可将编码突变体的氨基酸序列的核酸插入到适当的表达载体中以产生突变体。表达载体优选地含有编码本发明突变体的核酸和可操作地连接于所述核酸的表达调控序列。表达调控序列的实例包括(但不限于)启动子、参与调控启动子的基因、核糖体结合序列、多聚腺苷酸化信号、转录终止序列(转录终止子)和增强子。表达载体可进一步含有编码用于选择转化体的标记物(抗药性
发光标记物等)的基因。基因、荧光标记物、
[0046]作为其中插入编码本发明具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体的核酸的表达载体，可使用本领域通常使用的任何表达载体。表达载体的实例包括(但不限于)能够在宿主细胞中自我复制的载体和能够整合到宿主染色体中的载体。可使用与宿主相容的载体。[0047]其中插入编码本发明具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体的核酸的表达载体的实例包括质粒载体、噬菌体载体和病毒载体。作为质粒载体，可使用适合于所用宿主的质粒。例如，衍生自大肠杆菌(Escherichia coli)的质粒、衍生自芽孢杆菌属(Bacillus)细菌的质粒和衍生自酵母的质粒为本领域技术人员众所周知的，并且有许多市售质粒。这类已知质粒及其突变体可用于本发明。作为噬菌体载体，可使用例如λ噬菌体(例如Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP)。作为病毒载体，例如可使用动物病毒比如逆转录病毒或牛痘病毒(vaccinia virus)或者昆虫病毒比如杆状病毒(baculovirus)。此外，已经构建许多使用酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞作为宿主的异源蛋白表达系统，并且其已经可市售获得。这些表达系统可用于产生本发明具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体。
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可根据宿主选择待用用于本发明产生方法的表达载体装载的启动子。当宿主为大
肠杆菌时，启动子的实例包括(但不限于)衍生自大肠杆菌和噬菌体的启动子，比如trp启动子、lac启动子、PL启动子和PR启动子及其修饰物。此外，可使用含有噬菌体衍生的启动子和RNA聚合酶基因的组合的表达系统(例如pET表达系统等)。[0049]为了促进表达的多肽的纯化，本发明的表达载体可进一步含有编码亲和标签的核酸。将编码亲和标签的核酸插入到载体中，使得表达本发明的逆转录酶突变体与亲和标签的融合蛋白。亲和标签的实例包括(但不限于)组氨酸(His)标签、谷胱甘肽S‑转移酶(GST)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签和由8个氨基酸残基(Trp‑Ser‑His‑Pro‑Gln‑Phe‑Glu‑Lys)组成的Strep (II)标签。可将标签添加至编码本发明具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体的核酸的5'‑末端和/或3'‑末端侧。可将标签适当地添加至不干扰表达和标签功能的位置。优选的是可在表达的多肽的纯化阶段切割标签。能够被切割的这种标签的实例包括(但不限于)含有编码用于切割融合多肽的蛋白酶(比如因子Xa、PreScision Protease、凝血酶、肠激酶和TEV蛋白酶(烟草蚀纹病毒蛋白酶))的识别序列的核酸的标签。[0050]4. 用于改进本发明具有逆转录酶活性的DNA聚合酶的方法
用于改进本发明具有逆转录酶活性的DNA聚合酶的方法可如下所述进行。所述方
法包括在具有逆转录酶活性的包含由12个氨基酸A1‑A12组成的序列的DNA聚合酶中，用另一个碱性氨基酸残基替代氨基酸A3和/或A10。[0051]在本发明的改进方法中，首先，可选择具有逆转录酶活性的包含由如下所示的12个氨基酸A1‑A12组成的序列的DNA聚合酶作为在引入突变之前的DNA聚合酶的候选物。[0052]A1为支链氨基酸残基；
A2为亲水性中性氨基酸残基或疏水性脂肪族氨基酸残基；A3为亲水性中性氨基酸残基；
A4为酸性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基；A5为支链氨基酸残基；
A6为疏水性脂肪族氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基；A7为支链氨基酸残基；
A8为脯氨酸残基或亲水性中性氨基酸残基；A9为疏水性芳香族氨基酸残基、碱性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基；A10为酸性氨基酸残基或碱性氨基酸残基；A11为酸性氨基酸残基；和
A12为疏水性脂肪族氨基酸残基。
[0053]用于选择具有逆转录酶活性的DNA聚合酶作为候选物的方法的一个实例包括通过常规方法，例如通过计算机同源性搜索，提取包含由A1‑A12组成的氨基酸序列的DNA聚合酶。可使用已知的氨基酸序列数据库进行搜索。[0054]在本发明的一个特定方面，优选地使用包含由12个氨基酸组成的序列(其中A1为亮氨酸，A3为谷氨酰胺，A5为亮氨酸，A7为异亮氨酸，A11为谷氨酸和A12为丙氨酸)的DNA聚合酶作为用于引入突变的材料。在由此选择的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶中，氨基酸A3和/或A10被另一个碱性氨基酸残基替代，并从而获得DNA聚合酶的改进。具体地讲，DNA聚合酶的逆转录活性得到增强，并且每反应时间的逆转录产物(cDNA)的产生量得到增加。
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对于如上所述的氨基酸替代，优选的是A3和/或A10被选自赖氨酸、精氨酸和组氨
酸的氨基酸替代。特别优选的是被精氨酸残基替代。在本发明的改进方法中，可将进一步的突变引入到除A1‑A12的12个氨基酸的序列以外的位置，只要逆转录酶活性和核酸扩增活性不受损害即可。在本发明中，待改进的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶的实例包括(但不限于)来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、热坚芽孢杆菌(Bacillus cardotenax)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)和酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的DNA聚合酶、来自嗜热细菌的耐热聚合酶、适合于等温核酸扩增方法的嗜温性DNA聚合酶和通过氨基酸替代、插入或缺失从上述聚合酶改变的聚合酶以及衍生自上述聚合酶的其他改变的聚合酶。换句话说，待改进的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶可为原本具有低逆转录酶活性的Pol I型或家族A型DNA聚合酶。实施例
在下文中，将通过实施例详细解释本发明，但本发明的范围并不限于这些实施例。
[0057]实验方法：
(1) 用于制备Tth DNA聚合酶突变体的方法
以NCBI参考序列号WP_011228405.1公布了编码来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus) (Tth) HB8菌株的野生型DNA聚合酶的基因的核苷酸序列。DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。化学合成具有包含引入到氨基酸序列中的特定位置(由12个氨基酸A1‑A12组成的部分序列)中的突变的序列的人工基因。使用In‑Fusion (注册商标) HD Cloning Kit (由Takara Bio USA制造)将由此获得的人工基因引入到质粒pET6xHN‑N (由Takara Bio USA制造)中。由此获得的质粒具有编码在N‑末端侧具有组氨酸标签的Tth DNA聚合酶突变体的核苷酸序列。[0058]接下来，用质粒转化大肠杆菌BL21 DE3菌株(由Takara Bio Inc.制造)，并在37℃下于含有100 μg/mL氨苄西林的1.5%琼脂糖LB板上培养过夜。从板中选择3个单个菌落。将单个菌落接种到含有100 μg/mL氨苄西林的LB培养基(下文称为LB‑AP培养基)中，并在37℃下伴随振荡培养过夜。然后，将300 μL培养液接种到25 mL的LB‑AP培养基中，并在37℃下伴随振荡培养过夜。当OD600值达到0.6时，将IPTG以1 mM的最终浓度添加至培养液中。在37℃下培养诱导21小时之后，收集细菌细胞。
[0059]将由此获得的细菌细胞悬浮于含有2 mL 50 mM Tris HCl pH 8.0 (4℃)、100 mM NaCl、1 mM EDTA (pH 8.0)和5%甘油的溶液(下文称为缓冲液S)中。将溶菌酶(由Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.制造)以0.1 mg/mL的最终浓度添加至悬浮液中。在4℃下振荡1小时之后，将混合物在4℃下以15000 x g离心30分钟。收集上清液。将收集的上清液在85℃下保持15分钟，并然后在4℃下以15000 x g离心30分钟。加热之后的上清液使用
Ultra‑0.5 mL柱通过离心浓缩约20倍。Amicon
[0060]由此获得的浓缩物在如下所述的实验中用作Tth DNA聚合酶突变体粗溶液。关于DNA聚合酶的活性，基于使用活化的鲑鱼精子DNA作为模板/引物，在74℃下在30分钟内在反应溶液(pH 9.3)中将10 nmol的所有核苷酸掺入到酸不溶性沉淀物中的活性(其视为1U)，计算所使用的酶的单位数。
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(2) 用于评估Tth DNA聚合酶突变体的逆转录活性的方法通过以下方法测试(1)中获得的Tth DNA聚合酶突变体的逆转录反应。对于Tth
DNA聚合酶突变体粗提取溶液，制备最终体积为50 μL的反应溶液，并且反应溶液含有5 X RT‑PCR缓冲液[最终浓度为50 mM 的N‑二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.2)、最终浓度为115 mM的乙酸钾、最终浓度为8%的甘油]、最终浓度为2.5 mM的乙酸锰、最终浓度为0.1%的BSA、最终浓度为0.2 μM的具有SEQ ID NO: 2和3中所示的核苷酸序列的引物对、最终浓度为0.2 μM的具有SEQ ID NO: 4中所示的核苷酸序列的探针、最终浓度为0.3 mM的dNTP、链长为4.4 kb的RNA模板[对应于λDNA (GenBank登录号J0245.9.1)的核酸编号12697‑17090的区域的RNA，对应于1 x 107个拷贝]、以实验方法(1)制备的5 U Tth DNA聚合酶突变体和2.5 U的Taq抗体(由Takara Bio Inc.制造)。作为对照，还制备了含有野生型Tth DNA聚合酶的反应溶液。
[0062]RT‑PCR条件包括：在90℃下处理30秒，在60℃下1分钟和然后在95℃下1分钟，并然后进行45个循环，其中1个循环包括95℃下15秒和56℃下45秒。使用TP‑990 Thermal Cycler Dice (注册商标)Real Time System III (由Takara Bio Inc.制造)作为热循环仪进行实时PCR，并测量Ct值。[0063]实施例1：Tth DNA聚合酶突变体的制备
根据实验方法(1)，制备编码其中Tth DNA聚合酶的野生型氨基酸序列中682位的
谷氨酰胺被精氨酸替代的突变体蛋白的人工基因。制备携带获得的人工基因的重组质粒。根据实验方法(1)，表达蛋白并纯化表达的蛋白。由此获得的Tth DNA聚合酶突变体在682位具有从谷氨酰胺到精氨酸的替代突变(Q682R)，其称为“b13”。类似地，制备其中Tth DNA聚合酶的野生型氨基酸序列中689位的谷氨酸被精氨酸替代(E689R)的Tth DNA聚合酶突变体(称为“b46”)和其中682位的谷氨酰胺被精氨酸替代和689位的谷氨酸被精氨酸替代(Q682R + E689R)的Tth DNA聚合酶突变体(称为“b13b46”)。突变体蛋白的氨基酸序列和核酸序列如SEQ ID NO: 5‑10所示。[0064]实施例2：Tth DNA聚合酶突变体的逆转录活性评估测试‑1
根据实验方法(2)评估实施例1中制备的Tth DNA聚合酶突变体和野生型Tth DNA
聚合酶的逆转录活性。当通常使用野生型Tth DNA聚合酶时，标准逆转录反应在60℃下进行30分钟。在该实施例中，在短时间的逆转录反应中，在60℃下持续1分钟比较酶的性能。结果如表1所示。由于Ct值与目标物的起始量成反比，因此Ct值可用于计算DNA的起始拷贝数。例如，如果Ct值小1 (减1)，则可在PCR中用作模板的DNA的量将加倍。[0065][表1]
如表1所示，当使用突变体b13、b46和b13b46时，PCR中的起始DNA模板量为使用野
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生型酶时PCR中的起始DNA模板量的100‑1000倍或更多倍。DNA模板量的增加意指PCR之前通过逆转录反应产生的cDNA的量增加。因此，发现突变体在逆转录反应中的活性为野生型酶活性的100‑1000倍或更多倍。[0066]实施例3：PIP盒与Tth突变体的融合蛋白
研究了实施例1中所述的Tth DNA聚合酶突变体与PCNA结合结构域的融合蛋白。首
先，根据WO2017/090685的实施例4中所述的方法制备具有SEQ ID NO: 11中所示的氨基酸序列的3个PIP与野生型Tth DNA聚合酶的融合蛋白(PIP‑L14‑PIP‑L14‑PIP‑L15‑Tth DNA聚合酶)，其中3个PIP包含3个串联排列的PIP盒并融合于各Tth DNA聚合酶突变体的N‑末端侧。融合蛋白称为“3PIP‑野生型”。类似地，制备3PIP与实施例1中所述的突变体b13、b46和b13b46的融合蛋白，并将其称为“3PIP‑b13”、“3PIP‑b46”和“3PIP‑b13b46”。另外，通过如
PCNA D143R突变体(PCNA13)，其为识别PIPWO2007/004654的实施例中所述的方法制备Puf
盒的聚合酶相关因子。[0067]在该实施例中，如下所述制备用作逆转录反应的模板的RNA。通过常规方法制备具有包含使用用于GI检测和用于GII检测的引物通过PCR扩增的区域的核苷酸序列的RNA，所述引物具有与由卫生、劳动和福利部药品与食品安全局食品安全部检验与安全科(Inspection and Safety Division, Food Safety Department, Pharmaceutical and Food Safety Bureau, Ministry of Health, Labor and Welfare)发布的“诺如病毒的检测方法(日期为2003年11月5日第1105001号公告所附的附录；最终版本：日期为2013年10月22日的1022‑No.1) (下文称为“法定方法”)中所述相同的核苷酸序列。[0068]以最终体积为25 μL制备含有通过上述方法制备的RNA模板和5 X RT‑PCR缓冲液、最终浓度为2.5 mM的乙酸锰、最终浓度为0.1%的BSA、最终浓度为0.2 μM的如法定方法定义的具有SEQ ID NO: 12和13中所示的核苷酸序列的GI引物对或最终浓度为0.2 μM的如法定方法定义的具有SEQ ID NO: 14和15中所示的核苷酸序列的GII引物对、最终浓度为0.2 μM的具有SEQ ID NO: 16中所示的核苷酸序列的用于GI检测的探针或最终浓度为0.2 μM的具有SEQ ID NO: 17中所示的核苷酸序列的用于GII检测的探针、最终浓度为0.3 mM的dNTP、最终浓度为4%的聚乙二醇4‑壬基苯基3‑磺丙基醚、最终浓度为850 nM的PCNA13和5U上述3PIP‑Tth DNA聚合酶突变体的反应溶液。作为对照，还制备了含有野生型Tth DNA聚合酶的反应溶液和含有具有添加至N‑末端侧的3PIP的野生型Tth DNA聚合酶的反应溶液。RT‑PCR条件包括：在58℃下处理5分钟和在95℃下30秒，然后进行5个循环的反应，其中1个循环包括95℃下5秒和56℃下1分钟；并随后进行40个循环的反应，其中1个循环包括90℃下5秒和56℃下1分钟。使用与实施例2中使用的相同的热循环仪。GI检测结果如表2所示。类似地，GII检测结果如表3所示。[0069][表2]
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[表3]
如表2和3所示，当使用具有添加至N‑末端侧的PIP盒的本发明突变体b13、b46和
b13b46并时，与使用野生型酶和具有添加至N‑末端侧的PIP盒的野生型酶时相比较，起始DNA模板量增加。[0070]实施例4：Tth DNA聚合酶突变体的逆转录活性评估测试‑2
针对检测实际样品中的诺如病毒评估了在实施例2中发现其在逆转录反应中的活
性增强的突变体b13和b13b46。从征得知情同意的受试者中获得诺如病毒阳性粪便样品，将其以约10% (w/v)悬浮于PBS中，并然后以15000 rpm离心5分钟。由此获得的上清液(1 μL)如下所述用于反应中。以最终体积为25 μL制备含有1 μL粪便上清液、5 X RT‑PCR缓冲液[最终浓度为50 mM的曲辛缓冲液(pH 8.15)、最终浓度为50 mM的乙酸钾、最终浓度为8%的甘油、最终浓度为1%的DMSO、最终浓度为2.5 mM的乙酸锰、最终浓度为0.1%的BSA]、最终浓度为0.2 μM的如法定方法定义的GI引物对、最终浓度为0.2 μM的用于GI检测的探针、最终浓度为0.3 mM的dNTP、5U上述3PIP‑Tth DNA聚合酶突变体、最终浓度为4%的聚乙二醇4‑壬基苯基3‑磺丙基醚和2.5U的Taq抗体(由Takara Bio Co., Ltd. 制造)的反应溶液。作为对照，还制备了含有野生型Tth DNA聚合酶的反应溶液。在使用Tth DNA聚合酶的情况下，RT‑PCR条件包括在90℃下处理3分钟，58℃下5分钟或30分钟和95℃下30秒，然后进行5个循环的反应，其中1个循环包括95℃下5秒和56℃下30秒；并随后进行40个循环的反应，其中1个循环包括90℃下5秒和56℃下30秒。在使用Tth DNA聚合酶突变体的情况下，RT‑PCR条件包括在90℃下处理3分钟，58℃下5分钟和95℃下30秒，然后进行5个循环的反应，其中1个循环包括95℃下5秒和56℃下30秒；并随后进行40个循环的反应，其中1个循环包括90℃下5秒和56℃下30秒。使用与实施例2中使用的相同的热循环仪。[0071]作为以上实验的结果，仅当逆转录反应在58℃下进行30分钟时使用Tth DNA聚合
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酶才检测到粪便中的诺如病毒GI。另一方面，即使当逆转录反应在58℃下进行了短短5分钟时间时，使用本发明的突变体b13和b13b46仍检测到粪便中的诺如病毒GI。这些结果表明，即使当将本发明的突变体用于实际样品中的检测时，其在逆转录酶反应中仍保持增强的活性。
[0072]实施例5：Tth DNA聚合酶突变体的逆转录活性评估测试‑3
将本发明的Tth DNA聚合酶突变体与先前报道能够进行高温和有效逆转录反应的
Tth DNA聚合酶突变体进行比较。根据日本专利号3844975，通过实验方法(1)制备Tth DNA聚合酶突变体的粗酶溶液。具体地讲，由于Taq DNA聚合酶(Genbank登录号BAA06775.1)的氨基酸序列中681位对应于基于以NCBI参考序列号WP_0112288405描述的氨基酸序列的Tth DNA聚合酶的氨基酸序列中的683位，将氨基酸序列中683位的谷氨酸用苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、精氨酸或酪氨酸替代以制备Tth DNA聚合酶突变体。这些氨基酸突变体称为突变体E683F、E683K、E683L、E683R和E683Y。
[0073]除了将逆转录反应时间在60℃下从1分钟变为2分钟之外，通过如上所述的实验方法(2)进行评估。结果如表4所示。[0074][表4]
如表4所示，在683位包含谷氨酸替代的Tth DNA聚合酶突变体不能从模板产生扩
增产物或者比本发明的Tth DNA聚合酶突变体产生更高的Ct值。结果意味着，与本发明的突变体相比较，PCR开始时的起始DNA模板量减少，换句话说，PCR之前由逆转录反应产生的cDNA的量为约1/2或更少。因此，发现本发明的突变体在逆转录反应活性方面优于通过现有技术制备的突变体。[0075]实验方法
(3) 用于制备Bca DNA聚合酶突变体的方法
以NCBI参考序列号NZ_CP02574.1公布了编码来自热坚芽孢杆菌(Bacillus caldoteneax) (Bca)的野生型DNA聚合酶的基因的核苷酸序列。DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 23所示。化学合成具有包含引入到氨基酸序列中的特定位置(由12个氨基酸A1‑A12组成的部分序列)中的突变的序列的人工基因。根据实验方法(1)，制备了含有编码
DNA聚合酶突变体的基因的质粒。在N‑末端侧具有组氨酸标签的Bac
[0076]接下来，用质粒转化大肠杆菌BL21 DE3菌株(由Takara Bio Inc.制造)，并在37℃下于含有100 μg/mL氨苄西林的1.5%琼脂糖LB板上培养过夜。从板中选择3个单个菌落。将单个菌落接种到含有100 μg/mL氨苄西林的LB培养基(下文称为LB‑AP培养基)中，并在37℃
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下伴随振荡培养过夜。然后，将30 mL培养液接种到3 L的LB‑AP培养基中，并在37℃下伴随振荡培养过夜。当OD600值达到0.6时，将IPTG以1 mM的最终浓度添加至培养液中。在37℃下培养诱导4小时之后，收集细菌细胞。[0077]将由此获得的细菌细胞(3 g)悬浮于12 mL缓冲液(50 mM Tris HCl pH 7.0 (4℃)、4 μM PMSF、1 mM DTT、10%甘油)中，用Sonic 180 W搅拌10分钟，并然后在4℃下以10000 rpm离心30分钟。收集上清液并在60℃下加热30分钟。使热处理之后的上清液在冰上冷却30分钟，并然后以11000 rpm离心30分钟(4℃)以回收上清液。由此获得的上清液先后进行DEAE Sepharose Fast Flow (由GE Healthcare制造)、CM Sephadex Fast Flow (由GE Healthcare制造)、Sephadex‑G100、Heparin Sepharose (由GE Healthcare制造)和Q Sepharose (由GE Healthcare制造)以制备Bca DNA聚合酶突变体蛋白的纯化溶液。将纯化的溶液用于如下所述的测试中。关于DNA聚合酶的活性，基于使用活化的鲑鱼精子DNA作为模板/引物，在74℃下在30分钟内在反应溶液(pH 9.3)中将10 nmol的所有核苷酸掺入到酸
计算所使用的酶的单位数。不溶性沉淀物中的活性(其视为1U)，
[0078]实验方法
(4) 用于制备Aac DNA聚合酶突变体的方法
以NCBI参考序列号AB275481.1公布了编码来自酸热脂环酸芽孢杆菌
(Alicyclobacillus acidocaldarius) (Aac)的野生型DNA聚合酶的基因的核苷酸序列。DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 24所示。化学合成具有包含引入到氨基酸序列中的特定位置(由12个氨基酸A1‑A12组成的部分序列)中的突变的序列的人工基因。根据实验方法(1)，制备了含有编码在N‑末端侧具有组氨酸标签的Aac DNA聚合酶突变体的基因的质粒。
[0079]接下来，用质粒转化大肠杆菌BL21 DE3菌株，并以与实验方法(3)中所述相同的方式进行培养。因此收集细菌细胞。[0080]将由此获得的细菌细胞(3 g)以与实验方法(3)中所述相同的方式进行纯化，以制备Aac DNA聚合酶突变体的纯化溶液。将纯化的溶液用于如下所述的测试中。以与Bca DNA聚合酶的情况中相同的方式计算所使用的酶的单位数。[0081]实验方法
(5) 用于制备Taq DNA聚合酶突变体的方法
以NCBI参考序列号D32013.1公布了编码来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)
(Taq)的野生型DNA聚合酶的基因的核苷酸序列。DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 25所示。化学合成具有包含引入到氨基酸序列中的特定位置(由12个氨基酸A1‑A12组成的部分序列)中的突变的序列的人工基因。根据实验方法(1)，制备了含有编码在N‑末端侧具有组氨酸标签的Taq DNA聚合酶突变体的基因的质粒。[0082]接下来，用质粒转化大肠杆菌BL21 DE3菌株，并以与实验方法(3)中所述相同的方
因此收集细菌细胞。式进行培养。
[0083]将由此获得的细菌细胞(13 g)悬浮于39 mL缓冲液[100 mM Tris HCl pH 7.5 (4℃)、200 mM EDTA pH 7.5、2.4 μM PMSF]中，用Sonic 180 W搅拌10分钟，并然后在4℃下以12000 rpm离心30分钟。收集上清液，并将1.34 g硫酸铵和0.64 mL的10% PEI添加至上清液中。搅拌30分钟(4℃)之后，将混合物离心30分钟(4℃)。然后收集上清液。将上清液在75℃
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下加热15分钟，在冰上冷却30分钟，并然后以35000 rpm离心60分钟(4℃)以回收上清液。由此获得的上清液通过使用Phenyl Sepharose Cl‑4B (GE Healthcare)进行纯化。以与Bca DNA聚合酶的情况中相同的方式计算所使用的酶的单位数。[0084]实验方法
(6) 用于评估Bca、Aac和Taq DNA聚合酶突变体的逆转录活性的方法测量在(3)、(4)和(5)中获得的Bca、Aac和Taq DNA聚合酶突变体的聚合酶(Pol)活
性。为了测量Pol活性，制备含有最终浓度为25 mM的TAPS缓冲液(pH 9.3, 25℃)、最终浓度为50 mM的KCl、最终浓度为2 mM的MgCl2、最终浓度为0.1 mM的DTT、各自最终浓度为200 μM的dATP、dGTP和dCTP、最终浓度为100 μM的[3H]‑dTTP以及最终浓度为0.25 mg/ml的活化的鲑鱼精子DNA的反应溶液。具体地讲，使用活化的鲑鱼精子DNA作为模板/引物，测量在74℃下在30分钟内在用于测量的反应溶液中将10 nmol的所有核苷酸掺入到酸不溶性沉淀物中的活性，并且所测量的活性视为1U。[0085]接下来，测量在(3)、(4)和(5)中获得的Bca、Aac和Taq DNA聚合酶突变体的逆转录活性。为了测量逆转录活性，制备含有50 mM Tris‑HCl pH 8.3 (37℃)、5 mM Tris‑HCl pH 7.5 (37℃)、85 mM KCl、8 mM MgCl2、10 mM DTT、0.1% NP‑40、0.02 mg/ml 聚(A)、2.5 mM dTTP和100 μCi/ml [3H]‑dTTP的反应溶液。具体地讲，使用聚(rA)·寡(dT) 12‑18作为模板/引物，测量在37℃下在10分钟内在用于测量的反应溶液中将1 nmol的[3H]‑dTTP掺入的酶活性，并且所测量的活性视为1U。[0086]实验方法
(7) 用于评估Bca、Aac和Taq DNA聚合酶突变体的逆转录活性的方法通过以下方法测试在(3)、(4)和(5)中获得的Bca、Aac和Taq DNA聚合酶突变体的
逆转录反应。在该测试中，使用BcaBEST (商标) RNA PCR Kit (由Takara Bio Inc.制造)的一部分组分。具体地讲，对于每种DNA聚合酶突变体纯化溶液，混合试剂盒所附的2 X Bca 1st Buffer、25 mM MgSO4、RNA酶抑制剂(40 U/μl)、10 mM dNTP、最终浓度为0.5 μM的具有SEQ ID NO: 26中所示的核苷酸序列的逆转录引物、最终浓度为500 μM 的dNTP、最终浓度为10 ng/μL的作为模板的HL60总RNA (由Takara Bio Inc.制造)、和通过实验方法(3)、(4)或(5)制备的Bca、Aac或Taq DNA聚合酶突变体的0.5 μL纯化溶液，以制备10 μL逆转录反应溶液。作为对照，还制备了含有野生型Bca、Aac或Taq DNA聚合酶的反应溶液。[0087]逆转录条件包括在65℃下处理60秒，55℃下5分钟和95℃下2分钟。作为热循环仪，使用TP‑990 Thermal Cycler Dice (注册商标) Real Time System III (由Takara Bio Inc.制造)。
[0088]将由此获得的cDNA溶液进行实时PCR。使用RR420A TB Green (注册商标) Premix Ex Taq (商标) (Tli RNase H Plus) (由Takara Bio Inc.制造)进行实时PCR。制备含有最终浓度为0.2 μM的具有SEQ ID NO: 26中所示的核苷酸序列的正向引物、最终浓度为0.2 μM的具有SEQ ID NO: 27中所示的核苷酸序列的反向引物和1 μL通过上述逆转录反应获得的cDNA的PCR反应溶液。将PCR反应溶液(每一个反应25 μL)进行实时PCR反应。[0089]PCR条件包括在90℃下预变性30秒，并然后进行40个循环的反应，其中1个循环包括95℃下5秒和60℃下30秒。使用TP‑990 Thermal Cycler Dice (注册商标) Real Time System III (由Takara Bio Inc.制造)作为热循环仪进行实时PCR，并测量Ct值。
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实施例6：Bca、Aac和Taq突变体的逆转录活性评估测试‑1通过在实验方法(6)中描述的方法，使用在(3)、(4)和(5)中获得的Bca、Aac和Taq
DNA聚合酶突变体进行评估测试1。结果如表5所示。各DNA聚合酶突变体b13b46包含对应于Tth DNA聚合酶突变体b13b46的突变“Q682R + E689R”的突变(换句话说，对应于Tth DNA聚合酶的氨基酸序列中682和689位的位置的氨基酸被精氨酸替代)。[0091][表5]
突变类型Pol活性(U/μg)逆转录活性(U/μg)RT\\Pol活性比Bca天然型127.925.51Bca突变体b13b46)194.679.42Aac天然型73.98.51Aac突变体(b13b46)88.838.84Taq天然型82.261.11Taq突变体(b13b46)82.019.59如表5所示，与Bca天然型形成对照，制备的Bca (b13b46)突变体在保持聚合酶活
性的同时具有增强的逆转录活性。与天然型相比较，Bca (b13b46)突变体的逆转录活性提高到约2倍。在Aac的情况下，在保持聚合酶活性的同时，与天然型相比较，Aac (b13b46)突变体的逆转录活性提高到约4倍。在Taq的情况下，在保持聚合酶活性的同时，与天然型相比较，Taq (b13b46)突变体的逆转录活性提高到约9倍。[0092]实施例7：Bca、Aac和Taq突变体的逆转录活性评估测试‑2
确证了使用(3)、(4)和(5)中获得的Bca、Aac和Taq DNA聚合酶突变体合成的cDNA
的量以评估逆转录活性。
[0093]评估测试2通过实验方法(7)中描述的方法进行。结果如表6所示。[0094][表6]
如表6所示，当使用每种突变体时，PCR中的起始DNA模板量为使用野生型酶时PCR
中的起始DNA模板量的510‑1000倍或更多倍。DNA模板量的增加意指PCR之前通过逆转录反应产生的cDNA的量增加。因此，发现突变体在逆转录反应中的活性为野生型酶活性的510‑1000倍或更多倍。还发现，可根据本发明改善分类为Pol I型或家族A型的DNA聚合酶的逆转录酶活性。
[0095]工业适用性
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根据本发明，提供具有逆转录酶活性的适合于在同一容器中进行逆转录反应和核
酸扩增反应的DNA聚合酶。即使将难以逆转录的具有刚性二级结构的RNA用作模板时，DNA聚合酶的使用也使得能够进行有效的逆转录反应。进一步地，当在同一容器中连续进行逆转录反应和核酸扩增反应时，提高的逆转录反应效率使得与常规酶相比检测能够在更短的时间内进行并且具有相似或更高的灵敏度。因此，本发明具有逆转录酶活性的DNA聚合酶可用于包括基因工程、生物学、医学和农业的广泛范围的领域。[0096]序列表自由文本
SEQ ID NO: 1: DNA聚合酶I嗜热栖热菌SEQ ID NO: 2: PCR正向引物λRNASEQ ID NO: 3: PCR反向引物λRNASEQ ID NO: 4: 探针λRNA。5’‑末端为标记的FAM和3’‑末端为标记的BHQ1SEQ ID NO: 5: DNA聚合酶变体Tth b13
b13SEQ ID NO: 6: DNA聚合酶变体Tth
SEQ ID NO: 7: DNA聚合酶变体Tth b46SEQ ID NO: 8: DNA聚合酶变体Tth b46SEQ ID NO: 9: DNA聚合酶变体Tth b13 b46SEQ ID NO: 10: DNA聚合酶变体Tth b13 b46SEQ ID NO: 11: PIP‑L14‑PIP‑L14‑PIP‑L15 TthSEQ ID NO: 12: PCR正向引物COG1FSEQ ID NO: 13: PCR反向引物COG1RSEQ ID NO: 14: PCR正向引物COG2FSEQ ID NO: 15: PCR反向引物COG2RSEQ ID NO: 16: 探针RING1‑TP(a)。5’‑末端为标记的Cy5和3’‑末端为标记的
BHQ3
SEQ ID NO: 17: 探针RING2AL‑TP。5’‑末端为标记的ROX和3’‑末端为标记的BHQ2SEQ ID NO: 18: Tth DNA聚合酶的部分序列(A1‑A12)SEQ ID NO: 19: Tth DNA聚合酶变体的部分序列(A1‑A12)SEQ ID NO: 20: Bca聚合酶的部分序列(A1‑A12)SEQ ID NO: 21: Bst聚合酶的部分序列(A1‑A12)SEQ ID NO: 22: Aac聚合酶的部分序列(A1‑A12)SEQ ID NO: 23: DNA聚合酶I热坚芽孢杆菌SEQ ID NO: 24: DNA聚合酶I酸热脂环酸芽孢杆菌SEQ ID NO: 25: DNA聚合酶I水生栖热菌SEQ ID NO: 26: PCR正向引物hACTB‑FSEQ ID NO: 27: PCR反向引物hACTB‑533。
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