(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 111393523 A(43)申请公布日 2020.07.10
(21)申请号 202010077316.6(22)申请日 2020.01.27
(71)申请人 江苏帆博生物制品有限公司
地址 211300 江苏省南京市高淳区经济开
发区恒盛路5号4幢(72)发明人 张杰 李永刚
(74)专利代理机构 北京志霖恒远知识产权代理
事务所(普通合伙) 11435
代理人 赵奕(51)Int.Cl.
C07K 16/02(2006.01)G01N 33/68(2006.01)
权利要求书3页 说明书10页
序列表3页 附图3页
CN 111393523 A(54)发明名称
抗体检测系统一种HA阻断剂的制备方法、
(57)摘要
本发明属于生物医学技术领域，公开了一种HA阻断剂的制备方法、抗体检测系统，利用浓度为33％-50％的硫酸铵纯化抗体；在得到的纯化抗体中加入戊二醛交联；透析完成后回收抗体并保存；将样品、检测微球、异嗜性抗体干扰指示微球和标记可检测信号的第二抗体混合，形成一反应体系；检测反应体系中第二抗体-抗原-第一抗体-微球四元复合物中微球上的可检测信号，并与标准值或标准曲线比较，确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量。本发明制备的HA阻断剂抗干扰能力强，完全消除HA干扰，不会对免疫检验产生干扰，有效减少假阳性发生率，提高免疫检验的准确度及精准率；本发明的制备方法简单，容易控制，成本低。
CN 111393523 A
权 利 要 求 书
1/3页
1.一种HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述HA阻断剂的制备方法包括以下步骤：第一步，将沉淀用原两倍腹水体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液重悬溶解，用0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液进行透析；弃去上清，解透析袋，将抗体转移至烧杯，在搅拌状态下用量筒倒入原腹水体积的饱和硫酸铵溶液，硫酸铵饱和度为33％；搅拌，混匀分装入离心杯，配平，离心，弃去上清，得到纯化抗体；
第二步，将得到的抗体倒入烧杯中，冰浴；将冰浴放在在磁力搅拌器上，搅拌的同时加入25％戊二醛至终浓度为0.4mg/ml；
第三步，慢速滤纸过滤，使用紫外分光光度计OD280nm检测抗体浓度，用PBS缓冲液稀释，加入甘油，再加入Proclin300，保存；
第四步，将HBR稀释液滴加到待测试的含有HA样本的培养基中，每孔中加入HBR稀释液100uL；在空气95％、二氧化碳5％，湿度为70％-80％，温度37摄氏度的环境下进行培养；培养时间为2-3小时；将样品、检测微球、异嗜性抗体干扰指示微球和标记可检测信号的第二抗体混合，形成一反应体系；检测反应体系中第二抗体-抗原-第一抗体-微球四元复合物中微球上的可检测信号，并与标准值或标准曲线比较，确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量。
2.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第一步中硫酸铵纯化抗体具体包括以下步骤：
步骤一，将冷冻的腹水在无菌环境下37℃温浴溶解，用脱脂纱布过滤，量取过滤后的腹水体积，加入等体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液，混匀；
步骤二，在1份腹水中加入1/10份pH8.0的Tris-HCl，温和搅拌；逐渐滴加硫酸铵溶液至饱和度为50％；搅拌1小时，10000r/min，4℃离心20分钟后去除上清，用等体积的硫酸铵重悬沉淀两次后再次离心，并去除上清；
步骤三，将得到的沉淀用原两倍腹水体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液重悬溶解，用0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液进行透析，期间换液三次，换液时间不少于4小时；
步骤四，弃去上清，解透析袋，将抗体转移至烧杯，在搅拌状态下用量筒匀速倒入原腹水体积的饱和硫酸铵溶液，此时硫酸铵饱和度为33％；搅拌1小时，混匀分装入离心杯，配平，10000r/min，4℃离心20分钟，弃去上清。
3.如权利要求2所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述步骤四之后还需进行：将收集到的沉淀用原腹水体积1/2的0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液溶解，用0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液进行透析，期间换液3次，换液时间不少于4小时；收集抗体，观察是否有沉淀：如有沉淀，用快速滤纸过滤去除沉淀，量取抗体体积；如无沉淀，直接量取抗体体积，轻轻混匀抗体，使用微量紫外分光光度计测定A280nm的蛋白含量，并记录测量用0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液稀释至17mg/ml，使用微量紫外分光光度计在A280模式测定抗体浓度，并记录测量结果。
4.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第二步中戊二醛交联具体包括以下步骤：
步骤一，将得到的抗体倒入烧杯中，冰浴1h；将冰浴放在在磁力搅拌器上，保持冰量没过抗体液面，搅拌的同时加入25％戊二醛至终浓度为0.4mg/ml，加入时间为20s；
步骤二，搅拌下加入2M甘氨酸至终浓度为0.01M，搅拌30min；
2
CN 111393523 A
权 利 要 求 书
2/3页
步骤三，使用0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液对样品进行透析，期间换液二次，换液时间不少于6小时；
步骤四，解透析袋，样品5500r/min，4℃离心18min，取上清，使用紫外分光光度计测定抗体浓度，并记录测量结果。
5.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第三步中慢速滤纸过滤，使用紫外分光光度计OD280nm检测抗体浓度，用PBS缓冲液稀释，加入甘油，再加入Proclin300，保存具体包括以下步骤：慢速滤纸过滤，使用紫外分光光度计OD280nm检测抗体浓度，用0.01MpH7.4的PBS缓冲液稀释至10mg/ml，加入总体积2％甘油，再加入总体积0.1％Proclin300，-20℃保存。
6.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第四步中还包括：将冷冻的HBR室温下放置15分钟解冻，解冻后搅拌至质地均匀，得到HBR结合液；HBR浓度为0.040mg/ml-1.0mg/ml；用稀释缓冲液将HBR结合液补足到100ml，并且进行搅拌、混匀，得到HBR稀释液；将HBR稀释液滴加到待测试的含有HA样本的培养基中，每孔中加入HBR稀释液100uL；在空气95％、二氧化碳5％，湿度为70％-80％，温度37摄氏度的环境下进行培养；培养时间为2-3小时。
7.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第四步中反应体系具体包括：
检测微球是I式所示的第一抗体-微球的二元复合物：Anti1X-bead(I)式中，X表示目标抗原，anti1X表示针对所述目标抗原X的第一抗体，bead表示微球，-表示第一抗体与微球之间的结合方式。
8.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第四步中第二抗体与第一抗体可同时结合于目标抗原的不同表位，形成第二抗体-抗原-第一抗体-微球四元复合物；
异嗜性抗体干扰指示微球是II式所示的异嗜性干扰指示物-微球的二元复合物：Z-bead″(II)式中，Z表示异嗜性干扰指示物，bead″表示可与bead互相区别的不同微球，-表示异嗜性干扰指示物与微球之间的结合方式，在样品中存在异嗜性抗体的情况下，形成第二抗体-异嗜性抗体-异嗜性干扰指示物-微球四元复合物。
9.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第四步还包括：检测反应体系中第二抗体-异嗜性抗体-异嗜性干扰指示物-微球四元复合物中微球上的可检测信号，得到异嗜性抗体干扰指示微球的信号值，并与无异嗜性抗体干扰效应时的异嗜性抗体干扰指示微球信号值即正常值比较，当异嗜性抗体干扰指示微球测量值大于异嗜性抗体干扰指示微球正常值1.5倍时，则判定目标抗原的测定结果不可靠；如果异嗜性抗体干扰指示微球测量值小于或等于异嗜性抗体干扰指示微球正常值1.5倍时，则判定被检测样品中无异嗜性抗体干扰。
10.一种如权利要求1～9任意一项所述HA阻断剂的制备方法使用的抗体检测系统，其特征在于，所述抗体检测系统包括：
温度控制模块，与检测控制中心连接，用于利用加热器与散热器调控检测环境的温度；
3
CN 111393523 A
权 利 要 求 书
3/3页
湿度控制模块，与检测控制中心连接，用于利用加湿器、除湿器控制检测环境湿度；稀释模块，与检测控制中心连接，用于利用水将HBR稀释至指定浓度；搅拌模块，与检测控制中心连接，用于利用搅拌器将HBR或HBR稀释液搅拌均匀；检测控制中心，与温度控制模块、湿度控制模块、稀释模块、搅拌模块、时间控制模块、滴加模块、检测模块连接，用于预先设定相关温度、湿度、时间、浓度参数，并调控各个模块完成相应功能；
时间控制模块，与检测控制中心连接，用于利用计时器进行检测过程时间控制；滴加模块，与检测控制中心连接，用于将稀释好的HBR溶液滴加至含有HA样本的培养基中；
检测模块，与检测控制中心连接，用于利用检测微球、异嗜性抗体干扰指示微球进行抗原检测。
4
CN 111393523 A
说 明 书
一种HA阻断剂的制备方法、抗体检测系统
1/10页
技术领域
[0001]本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种HA阻断剂的制备方法、抗体检测系统。
背景技术
[0002]目前，最接近的现有技术：阻断剂，也叫受体拮抗剂，指能与受体结合，并能阻止激动剂产生效应的一类配体物质。拮抗剂对相应受体有亲和性，但没有效能，从而抑制了激动剂对受体的作用。拮抗剂可以结合受体的活性位点，也可以结合别构位点，甚至单独结合通常没有生物调节作用的位点来达到效果。拮抗剂和受体结合性质不同，所以结合时间有长有短，结合的可逆性也有不同。拮抗剂分为竞争性拮抗剂和非竞争性拮抗剂等类型。大部分药物拮抗剂都与内源性配体或底物竞争受体结合位点来达到效果。受体是可被配体结合而激活的大型蛋白质分子。受体可以结合在细胞膜上，也可存在于细胞内部，比如在细胞核或线粒体中。受体在活性位点与配体以非共价键结合，一个受体上可以有多个结合不同配体的位点。配体和受体在活性位点或别构位点结合后，都可以调节受体的活性。拮抗剂可以通过结合活性位点、别构位点，或者单独结合通常不参与生物调节的位点来产生效果。血清中的易嗜性抗体(HA)已被证实导致免疫检验的假阳性或是假阴性干扰，在免疫检测结合物中加入阻断剂能够消除HA的干扰。但是，在进行抗体检测中，由于标本中HA的来源是未知的，不能够准确的针对HA的结合位点进行操作，目前尚未有一个完全消除HA干扰的阻断剂。[0003]现有专利CN201811323185.4异嗜性抗体阻断剂HBR-6及其制备方法，包括其可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Phe-Thr-Ala-Asp-Thr-Ser-Ser，CDR2：Glu-Asp-Asp-Pro，CDR3：Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Tyr；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Asn-Ile-Pro-Lys-Leu-Leu-Ile-Tyr，CDR2：Ile-Val-Met-Thr，CDR3：Gln-Gly-Glu-Asp-Ile-Ala-Thr-Tyr-Arg，制备的异嗜性抗体阻断剂亲和性不好，抗干扰能力不强，不适用于大规模工业化生产。
[0004]现有专利CN201811323396.8异嗜性抗体阻断剂HBT-1及其制备方法，包括其可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Val-Gln-Ser-Ser-Ile-Thr，CDR2：Gln-Asp-Asp-Tyr-Ala-Tyr-Thr-Leu-Tyr，CDR3：Val-Tyr-Lys-Leu；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Gly-Asp-Val-Leu-Ser-Lys-Ser-Cys，CDR2：Lys-Asp-Arg-Phe，CDR3：His-Ile-Ile-Ser-Thr-Ser。制备的抗体亲和性不佳，且工艺复杂，工艺参数难以精准控制。[0005]综上所述，现有技术存在的问题是：现有的HA阻断剂亲和性不高，无法实现完全消除HA干扰，会对免疫检测结果产生影响；HA阻断剂的制备工艺复杂，难以推广使用。[0006]解决上述技术问题的难度：目前市场上已经有商品化的HA阻断剂如：IIR、NS-ABT、Heteroblock、MAB33及polyMAB33，其亲和性较差，与HA结合实现减少干扰的效果并不显著，导致错误结果出现；另外，现有的HA阻断剂的制备方法复杂，不适合规模化生产，难以推广使用。
5
CN 111393523 A[0007]
说 明 书
2/10页
解决上述技术问题的意义：解决上述问题后，HA阻断剂能够完全消除HA干扰，避免
残留的HA与动物免疫球蛋白的片段结合对实验产生干扰，样本检测的准确性提高；制备方法的改进能够降低HA阻断剂制备的复杂程度，便于推广使用。制备的HA阻断剂超越传统阻断的方法，能阻断更多假阳性；并且其应用范围广，可阻断抗所有种属(anti-rabbit，anti-goat，anti-sheep，andanti-mouse)，作为通用试剂使用，为检测提供更多便利。发明内容
[0008]针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种HA阻断剂的制备方法、抗体检测系统。
[0009]本发明是这样实现的，一种HA阻断剂的制备方法，所述HA阻断剂的制备方法包括以下步骤：
[0010]第一步，将沉淀用原两倍腹水体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液重悬溶解，用0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液进行透析；弃去上清，解透析袋，将抗体转移至烧杯，在搅拌状态下用量筒倒入原腹水体积的饱和硫酸铵溶液，硫酸铵饱和度为33％；搅拌，混匀分装入离心杯，配平，离心，弃去上清，得到纯化抗体；[0011]第二步，将得到的抗体倒入烧杯中，冰浴；将冰浴放在在磁力搅拌器上，搅拌的同时加入25％戊二醛至终浓度为0.4mg/ml；[0012]第三步，慢速滤纸过滤，使用紫外分光光度计OD280nm检测抗体浓度，用PBS缓冲液稀释，加入甘油，再加入Proclin300，保存；[0013]第四步，将HBR稀释液滴加到待测试的含有HA样本的培养基中，每孔中加入HBR稀释液100uL；在空气95％、二氧化碳5％，湿度为70％-80％，温度37摄氏度的环境下进行培养；培养时间为2-3小时；将样品、检测微球、异嗜性抗体干扰指示微球和标记可检测信号的第二抗体混合，形成一反应体系；检测反应体系中第二抗体-抗原-第一抗体-微球四元复合物中微球上的可检测信号，并与标准值或标准曲线比较，确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量。[0014]进一步，所述第一步中硫酸铵纯化抗体具体包括以下步骤：[0015]步骤一，将冷冻的腹水在无菌环境下37℃温浴溶解，用脱脂纱布过滤，量取过滤后的腹水体积，加入等体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液，混匀；[0016]步骤二，在1份腹水中加入1/10份pH8.0的Tris-HCl，温和搅拌；逐渐滴加硫酸铵溶液至饱和度为50％；搅拌1小时，10000r/min，4℃离心20分钟后去除上清，用等体积的硫酸铵重悬沉淀两次后再次离心，并去除上清；[0017]步骤三，将得到的沉淀用原两倍腹水体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液重悬溶解，用0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液进行透析，期间换液三次，换液时间不少于4小时；[0018]步骤四，弃去上清，解透析袋，将抗体转移至烧杯，在搅拌状态下用量筒匀速倒入原腹水体积的饱和硫酸铵溶液，此时硫酸铵饱和度为33％；搅拌1小时，混匀分装入离心杯，配平，10000r/min，4℃离心20分钟，弃去上清。[0019]进一步，所述步骤四之后还需进行：将收集到的沉淀用原腹水体积1/2的0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液溶解，用0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液进行透析，期间换液3次，换液时间不少于4小时；收集抗体，观察是否有沉淀：如有沉淀，用快速滤纸过滤去除沉淀，
6
CN 111393523 A
说 明 书
3/10页
量取抗体体积；如无沉淀，直接量取抗体体积，轻轻混匀抗体，使用微量紫外分光光度计测定A280nm的蛋白含量，并记录测量用0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液稀释至17mg/ml，使用微量紫外分光光度计在A280模式测定抗体浓度，并记录测量结果。[0020]进一步，所述第二步中戊二醛交联具体包括以下步骤：[0021]步骤一，将得到的抗体倒入烧杯中，冰浴1h；将冰浴放在在磁力搅拌器上，保持冰量没过抗体液面，搅拌的同时加入25％戊二醛至终浓度为0.4mg/ml，加入时间为20s；[0022]步骤二，搅拌下加入2M甘氨酸至终浓度为0.01M，搅拌30min；[0023]步骤三，使用0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液对样品进行透析，期间换液二次，换液时间不少于6小时；[0024]步骤四，解透析袋，样品5500r/min，4℃离心18min，取上清，使用紫外分光光度计测定抗体浓度，并记录测量结果。[0025]进一步，所述第三步中慢速滤纸过滤，使用紫外分光光度计OD280nm检测抗体浓度，用PBS缓冲液稀释，加入甘油，再加入Proclin300，保存具体包括以下步骤：慢速滤纸过滤，使用紫外分光光度计OD280nm检测抗体浓度，用0.01MpH7.4的PBS缓冲液稀释至10mg/ml，加入总体积2％甘油，再加入总体积0.1％Proclin300，-20℃保存。[0026]进一步，所述第四步中还包括：将冷冻的HBR室温下放置15分钟解冻，解冻后搅拌至质地均匀，得到HBR结合液；HBR浓度为0.040mg/ml-1.0mg/ml；用稀释缓冲液将HBR结合液补足到100ml，并且进行搅拌、混匀，得到HBR稀释液；将HBR稀释液滴加到待测试的含有HA样本的培养基中，每孔中加入HBR稀释液100uL；在空气95％、二氧化碳5％，湿度为70％-80％，温度37摄氏度的环境下进行培养；培养时间为2-3小时。[0027]进一步，所述第四步中反应体系具体包括：
[0028]检测微球是I式所示的第一抗体-微球的二元复合物：[0029]Anti1X-bead(I)[0030]式中，X表示目标抗原，anti1X表示针对所述目标抗原X的第一抗体，bead表示微球，-表示第一抗体与微球之间的结合方式。[0031]进一步，所述第四步中第二抗体与第一抗体可同时结合于目标抗原的不同表位，形成第二抗体-抗原-第一抗体-微球四元复合物；
[0032]异嗜性抗体干扰指示微球是II式所示的异嗜性干扰指示物-微球的二元复合物：[0033]Z-bead″(II)[0034]式中，Z表示异嗜性干扰指示物，bead″表示可与bead互相区别的不同微球，-表示异嗜性干扰指示物与微球之间的结合方式，在样品中存在异嗜性抗体的情况下，形成第二抗体-异嗜性抗体-异嗜性干扰指示物-微球四元复合物。[0035]进一步，所述第四步还包括：检测反应体系中第二抗体-异嗜性抗体-异嗜性干扰指示物-微球四元复合物中微球上的可检测信号，得到异嗜性抗体干扰指示微球的信号值，并与无异嗜性抗体干扰效应时的异嗜性抗体干扰指示微球信号值即正常值比较，当异嗜性抗体干扰指示微球测量值大于异嗜性抗体干扰指示微球正常值1.5倍时，则判定目标抗原的测定结果不可靠；如果异嗜性抗体干扰指示微球测量值小于或等于异嗜性抗体干扰指示微球正常值1.5倍时，则判定被检测样品中无异嗜性抗体干扰。
[0036]本发明的另一目的在于提供一种所述HA阻断剂的制备方法使用的抗体检测系统，
7
CN 111393523 A
说 明 书
4/10页
其特征在于，所述抗体检测系统包括：[0037]温度控制模块，与检测控制中心连接，用于利用加热器与散热器调控检测环境的温度；
[0038]湿度控制模块，与检测控制中心连接，用于利用加湿器、除湿器控制检测环境湿度；
[0039]稀释模块，与检测控制中心连接，用于利用水将HBR稀释至指定浓度；[0040]搅拌模块，与检测控制中心连接，用于利用搅拌器将HBR或HBR稀释液搅拌均匀；[0041]检测控制中心，与温度控制模块、湿度控制模块、稀释模块、搅拌模块、时间控制模块、滴加模块、检测模块连接，用于预先设定相关温度、湿度、时间、浓度参数，并调控各个模块完成相应功能；
[0042]时间控制模块，与检测控制中心连接，用于利用计时器进行检测过程时间控制；[0043]滴加模块，与检测控制中心连接，用于将稀释好的HBR溶液滴加至含有HA样本的培养基中；
[0044]检测模块，与检测控制中心连接，用于利用检测微球、异嗜性抗体干扰指示微球进行抗原检测。
[0045]综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明制备的HA阻断剂抗干扰能力强，能够完全消除HA干扰，不会对免疫检验产生干扰，有效减少假阳性的发生率，能够提高免疫检验的准确度及精准率；同时本发明的制备方法简单，过程容易控制，各种试剂均为实验室常用试剂，成本低；且保持常温的制备环境，保证了分析物以及相应阻断剂的稳定性，安全可靠。
[0046]同时本发明还提供了相应的检验方法，证明了本发明制备的阻断剂的性能优越，能够实现消除干扰，提高免疫检验准确率的目的。本发明提供的HA阻断剂及其制备方法，筛选出HA阻断剂，并获得其重链和轻链可变区，测序后得到其独特的核普酸序列，具有良好的亲和性。
附图说明
[0047]图1是本发明实施例提供的HA阻断剂的制备方法流程图。[0048]图2是本发明实施例提供的抗体纯化方法流程图。
[0049]图3是本发明实施例提供的抗体检测系统的结构示意图；[0050]图中：1、温度控制模块；2、湿度控制模块；3、稀释模块；4、搅拌模块；5、检测控制中心；6、时间控制模块；7、滴加模块；8、检测模块。具体实施方式
[0051]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0052]下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0053]本发明实施例提供的HA阻断剂包括重链和轻链；所述重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；重链可变区核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；轻链可变区氨基酸序列如
8
CN 111393523 A
说 明 书
5/10页
SEQIDNO：3所示；轻链可变区核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。[0054]所述重链的3个互补决定区CDR序列分别为：CDR1：VQSSIT，CDR2：QDDYAYTLY，CDR3：VYKL。
[0055]所述轻链的3个互补决定区CDR序列分别为：CDR1：GDVLSKSC，CDR2：KDRF，CDR3：HIISTS。
[0056]本发明实施例提供的HA阻断剂的基因序列具体包括：[0057]SEQIDNO：1：重链可变区氨基酸序列：
[0058]EVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWSANILPGSGSPNYNEKFKGKDTFTADTSSNTAYMVQSSITSEDSAVYYCARRGRGFPYWGQGTLVTVSA
[0059]AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLRCLVKGYSPEPVTLPWNSGSLSSGVHTLPAVLQSGLNTLSSSLTVTSSTSPSQSITRNVANPASSPKVDKKIEPRGPTIKPCPRCKCPAPNLLGGPSVFIGPPKIKNVLMISKSPIVTYVVVDKSEDDPDVQISWFVGNVEVHTAQDDYAYTLYHSTLRAVSALPIQAQDWMPGKEFKCKDNNKDLAAPIRRTISKAKGSVRAPQVYVTPPREEERTKKQVTRTCMVRDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFVYKLLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSR；[0060]SEQIDNO：2：重链可变区核苷酸序列：
[0061]GAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGATGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCACCGGCTACACCTTCAGCAGCTACTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCACGGCCTGGAGTGGAGCGCCAACATCCTGCCCGGCAGCGGCAGCCCCAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGACACCTTCACCGCCGACACCAGCAGCAACACCGCCTACATGGTGCAGAGCAGCATCACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAAGAGGCAGAGGCTTCCCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGCCAAGACCACCGCCCCCAGCGTGTACCCCCTGGCCCCCGTGTGCGGCGACACCACCGGCAGCAGCGTGACCCTGAGATGCCTGGTGAAGGGCTACAGCCCCGAGCCCGTGACCCTGCCCTGGAACAGCGGCAGCCTGAGCAGCGGCGTGCACACCCTGCCCGCCGTGCTGCAGAGCGGCCTGAACACCCTGAGCAGCAGCCTGACCGTGACCAGCAGCACCAGCCCCAGCCAGAGCATCACCAGAAACGTGGCCAACCCCGCCAGCAGCCCCAAGGTGGACAAGAAGATCGAGCCCAGAGGCCCCACCATCAAGCCCTGCCCCAGATGCAAGTGCCCCGCCCCCAACCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCATCGGCCCCCCCAAGATCAAGAACGTGCTGATGATCAGCAAGAGCCCCATCGTGACCTACGTGGTGGTGGACAAGAGCGAGGACGACCCCGACGTGCAGATCAGCTGGTTCGTGGGCAACGTGGAGGTGCACACCGCCCAGGACGACTACGCCTACACCCTGTACCACAGCACCCTGAGAGCCGTGAGCGCCCTGCCCATCCAGGCCCAGGACTGGATGCCCGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAGGACAACAACAAGGACCTGGCCGCCCCCATCAGAAGAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCAGCGTGAGAGCCCCCCAGGTGTACGTGACCCCCCCCAGAGAGGAGGAGAGAACCAAGAAGCAGGTGACCAGAACCTGCATGGTGAGAGACTTCATGCCCGAGGACATCTACGTGGAGTGGACCAACAACGGCAAGACCGAGCTGAACTACAAGAACACCGAGCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTACTTCGTGTACAAGCTGCTGAGAGTGGAGAAGAAGAACTGGGTGGAGAGAAACAGCTACAGCTGCAGCGTGGTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACCACCAAGAGCTTCAGCAGATGA；[0062]SEQIDNO：3：轻链可变区氨基酸序列：
[0063]DIVMTQTPSSLSASLGDVLSKSCHASQNIKVWLSWYQQKPGNIPKLLIYKTSNLHTGVSSRFSGSGSGTAFTLTISSLQGEDIATYYCQQGQSYPFTFGGGTKLEIKRADVAPTASIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNKDRFKDSNVKCEIDGSERQNGVLNPWTDQDSKHSTYSTSSTLTLTKDEYERHNSYTTEATHIISTSPIVRSFNRNEGIRDRADLIG；
[0064]SEQIDNO：4：轻链可变区核苷酸序列：
9
CN 111393523 A[0065]
说 明 书
6/10页
GACATCGTGATGACCCAGACCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACGTGCTGAGCAAGAGCTG
CCACGCCAGCCAGAACATCAAGGTGTGGCTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAACATCCCCAAGCTGCTGATCTACAAGACCAGCAACCTGCACACCGGCGTGAGCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGCCTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGGCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGGCCAGAGCTACCCCTTCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGAGCCGACGTGGCCCCCACCGCCAGCATCTTCCCCCCCAGCAGCGAGCAGCTGACCAGCGGCGGCGCCAGCGTGGTGTGCTTCCTGAACAAGGACAGATTCAAGGACAGCAACGTGAAGTGCGAGATCGACGGCAGCGAGAGACAGAACGGCGTGCTGAACCCCTGGACCGACCAGGACAGCAAGCACAGCACCTACAGCACCAGCAGCACCCTGACCCTGACCAAGGACGAGTACGAGAGACACAACAGCTACACCACCGAGGCCACCCACATCATCAGCACCAGCCCCATCGTGAGAAGCTTCAACAGAAACGAGGGCATCAGAGACAGAGCCGACCTGATCGGCTGA。[0066]如图1所示，本发明实施例提供的HA阻断剂的制备方法包括以下步骤：[0067]S101：向抗体中加入浓度为33％-50％的硫酸铵溶液，通过过滤、混匀、搅拌、离心、溶解、透析、在此搅拌离心、溶解、过滤等方法进行抗体纯化。[0068]S102：向步骤S101得到的纯化抗体中缓慢加入戊二醛、甘氨酸搅拌；同时加入磷酸缓冲盐溶液进行透析离心，进行抗体的交联。[0069]S103：透析完成后回收抗体并，同时利用慢速滤纸过滤，使用紫外分光光度计OD280nm检测抗体浓度，用0.01MpH7.4的PBS缓冲液稀释至10mg/ml，加入总体积2％甘油，再加入总体积0.1％Proclin300，-20℃保存。[0070]S104：对步骤S103得到的抗体进行检测反应体系检测。[0071]如图2所示，步骤S101中，本发明实施例提供的硫酸铵纯化抗体具体包括以下步骤：
[0072]S201：将冷冻的腹水在无菌环境下37℃温浴溶解，用脱脂纱布过滤，量取过滤后的腹水体积，加入等体积pH7.40.01M磷酸缓冲盐溶液，混匀。[0073]S202：在1份腹水中加入1/10份pH8.0的Tris-HCl，温和搅拌；逐渐滴加硫酸铵溶液至饱和度为50％；搅拌1小时，10000r/min，4℃离心20分钟后去除上清，用等体积的硫酸铵重悬沉淀两次后再次离心，并去除上清。[0074]S203：将得到的沉淀用原两倍腹水体积pH7.40.01M磷酸缓冲盐溶液重悬溶解，用pH7.40.01M磷酸缓冲盐溶液进行透析，期间换液三次，换液时间不少于4小时。[0075]S204：弃去上清，解透析袋，将抗体转移至烧杯，在缓慢搅拌状态下用量筒缓慢匀速倒入原腹水体积的饱和硫酸铵溶液，此时硫酸铵饱和度约为33％；搅拌1小时，混匀分装入离心杯，配平，10000r/min，4℃离心20分钟，弃去上清。[0076]S205：将收集到的沉淀用原腹水体积1/2的pH7.40.01M磷酸缓冲盐溶液溶解，用pH7.40.01M磷酸缓冲盐溶液进行透析，期间换液3次，换液时间不少于4小时。[0077]S206：收集抗体，观察是否有沉淀：如有沉淀，用快速滤纸过滤去除沉淀，量取抗体体积；如无沉淀，直接量取抗体体积，轻轻混匀抗体，使用微量紫外分光光度计测定A280nm的蛋白含量，并记录测量值。[0078]S207：用pH7.40.01M磷酸缓冲盐溶液稀释至17mg/ml，使用微量紫外分光光度计测定抗体浓度(A280模式测)，并记录测量结果。[0079]步骤S102中，本发明实施例提供的戊二醛交联具体包括以下步骤：[0080](1)将步骤S101得到的抗体倒入烧杯中，冰浴1h；将冰浴放在在磁力搅拌器上，保
10
CN 111393523 A
说 明 书
7/10页
持冰量没过抗体液面，快速搅拌的同时加入25％戊二醛至终浓度为0.4mg/ml，加入时间为20s。[0081](2)在快速搅拌下，均匀加入2M甘氨酸至终浓度为0.01M，慢速搅拌30min。[0082](3)使用用pH7.40.01M磷酸缓冲盐溶液对样品进行透析，期间换液二次，换液时间不少于6小时。[0083](4)解透析袋，样品5500r/min，4℃离心18min，取上清，使用紫外分光光度计测定抗体浓度，并记录测量结果。[0084]步骤S104中，本发明实施例提供的抗体检测具体包括：[0085](1)将冷冻的HBR室温下放置15分钟进行解冻，解冻后搅拌至质地均匀，得到HBR结合液(HBR浓度为0.040mg/ml-1.0mg/ml)；用稀释缓冲液将HBR结合液补足到100ml，并且进行搅拌、混匀，得到HBR稀释液。[0086](2)将HBR稀释液滴加到待测试的含有HA样本的培养基中，每孔中加入HBR稀释液100uL；在空气95％、二氧化碳5％，湿度为70％-80％，温度37摄氏度的环境下进行培养；培养时间为2-3小时。[0087](3)对步骤(2)得到的样品进行检测。[0088]步骤(3)中的，本发明实施例提供的对样品进行检测的方法具体包括：[0089](a)将样品、检测微球、异嗜性抗体干扰指示微球和标记了可检测信号的第二抗体混合，形成一反应体系。
[0090]其中所述的检测微球是如I式所示的第一抗体-微球的二元复合物：[0091]Anti1X-bead(I)[0092]式中，“X”表示目标抗原，“anti1X”表示针对所述目标抗原“X”的第一抗体，“bead”表示微球，“-”表示第一抗体与微球之间的结合方式。
[0093]所述第二抗体与第一抗体可同时结合于目标抗原的不同表位，从而形成“第二抗体-抗原-第一抗体-微球”四元复合物。
[0094]所述异嗜性抗体干扰指示微球是如II式所示的异嗜性干扰指示物-微球的二元复合物：
[0095]Z-bead″(II)[0096]式中，“Z”表示异嗜性干扰指示物，“bead″”表示可与“bead”互相区别的不同微球，“-”表示异嗜性干扰指示物与微球之间的结合方式，从而在样品中存在异嗜性抗体的情况下，形成“第二抗体-异嗜性抗体-异嗜性干扰指示物-微球”四元复合物。[0097](b)检测反应体系中所述“第二抗体-抗原-第一抗体-微球”四元复合物中微球上的可检测信号，并与标准值或标准曲线比较，从而确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量。
[0098]并且检测反应体系中所述“第二抗体-异嗜性抗体-异嗜性干扰指示物-微球”四元复合物中微球上的可检测信号，得到异嗜性抗体干扰指示微球的信号值，并与无异嗜性抗体干扰效应时的异嗜性抗体干扰指示微球信号值即正常值比较，当异嗜性抗体干扰指示微球测量值大于异嗜性抗体干扰指示微球正常值1.5倍时，则判定目标抗原的测定结果不可靠；如果异嗜性抗体干扰指示微球测量值小于或等于异嗜性抗体干扰指示微球正常值1.5倍时，则判定被检测样品中无异嗜性抗体干扰。
11
CN 111393523 A[0099]
说 明 书
8/10页
如图3所示，本发明实施例提供的抗体检测系统具体包括：
[0100]温度控制模块1：与检测控制中心5连接，用于利用加热器与散热器调控检测环境的温度；
[0101]湿度控制模块2：与检测控制中心5连接，用于利用加湿器、除湿器控制检测环境湿度；
[0102]稀释模块3：与检测控制中心5连接，用于利用水将HBR稀释至指定浓度；[0103]搅拌模块4：与检测控制中心5连接，用于利用搅拌器将HBR或HBR稀释液搅拌均匀；[0104]检测控制中心5：与温度控制模块1、湿度控制模块2、稀释模块3、搅拌模块4、时间控制模块6、滴加模块7、检测模块8连接，用于预先设定相关温度、湿度、时间、浓度参数，并调控各个模块完成相应功能；[0105]时间控制模块6：与检测控制中心5连接，用于利用计时器进行检测过程时间控制；[0106]滴加模块7：与检测控制中心5连接，用于将稀释好的HBR溶液滴加至含有HA样本的培养基中；
[0107]检测模块8：与检测控制中心5连接，用于利用检测微球、异嗜性抗体干扰指示微球进行抗原检测。
[0108]下面结合实验对本发明的技术效果做进一步说明：[0109]本实验HA阻断剂对免疫检测结果准确性的验证，建立肾小球硬化大鼠模型用于验证HA阻断剂对免疫检测结合物中HA的效果。[0110]实验一[0111]1实验过程
[0112]1.1模型建立：
[0113]将12只雄性SD大鼠随机分为正常对照组(假手术组)、模型组(各8只)，于SPF级动物房中适应性饲养一周后开始实验，期间自由进食饮水以及自然光照。采用左侧肾切除再结合给与大鼠尾静脉注射盐酸多柔比星的方法构建大鼠肾小球硬化模型。[0114]具体方法为：用10％的水合氯醛(按0.3ml·100g-1换算)腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，腹部备皮，碘伏消毒，在无菌条件下，沿腹中线偏左1cm处行纵向切口约3cm，逐层分离皮肤、组织层，暴露出左侧肾脏，用4-0号手术缝合线在接近肾门处将肾动脉和肾静脉一起结扎，并远离结扎处0.5cm处再进行二次结扎，并在此处用止血钳止血，在两次结扎中间处，用手术剪一并剪断肾静脉和肾动脉，若无出血渗血情况，松开止血钳，游离出肾脏且不损伤肾上腺，同时结扎左侧输尿管。之后用1ml五水头孢唑林钠(1g·100ml-1双蒸水)对手术组进行局部抗感染，之后依次缝合肌肉层和皮肤层，关闭腹腔。其中假手术组按以上操作步骤进行手术，仅游离左侧肾脏，触及肾包膜，不切除肾脏，也不对其进行结扎和切除，术后连续三天，每日腹腔注射1ml五水头孢唑林钠(1g·100ml-1双蒸水)，同时在手术缝合处用碘伏对伤口进行消毒，防止感染。同时，在切除大鼠左侧肾脏后第7天、14天，分别由尾静脉注射盐酸多柔比星注射液各5mg·kg-1。
[0115]1.2肾小球硬化大鼠模型的评价方法的建立
[0116]1)应用多元统计分析方法对代谢轮廓进行表征，采用主成分分析法(PCA)对数据进行模式识别，考察各组数据轮廓的分离情况。[0117]具体方法是在大鼠术后的第7天、第10天和第14天分别收集大鼠模型的尿液，首先
12
CN 111393523 A
说 明 书
9/10页
对术后第7天、第10天和第14天收集大鼠模型的尿液分别进行LC-MS分析，得出大鼠模型的LC-MS图谱；然后对大鼠模型的LC-MS谱图积分数据矩阵进行多元统计分析，得出大鼠模型的轮廓图进而对大鼠模型的轮廓图进行轮廓动态分析，得出大鼠模型的轮廓动态变化趋势图，在不同的时间点，模型组偏离正常对照组的程度不同，而在模型复制术后第14天时偏离程度最大，说明在术后第14天代谢调控网络发生显著变化，证明肾小球硬化模型复制成功。[0118]2)在PCA动态分析的基础上，利用偏最小二乘-判别分析法(PLS-DA)对正常组和术后第14天模型尿液进一步分析，得到与正常组对术后第14天模型组尿液轮廓图。接着运用响应置换检验验证模型(R2值代表模型的解释能力，Q2值代表模型的预测能力，Q2>0.5说明模型预测能力较好，模型有效；Q2>0.9说明此模型效果突出)，模型响应置换结果为：R2＝0.54，Q2＝－0.192，响应置换检验中的Q2<0则说明建模成功，没有出现过度拟合。得分图中各组内的样本点也趋于集中，正常对照组与模型组之间分隔更远，且通过了响应置换检验，说明该模型的拟合度较好，进一步验证了PLS-DA模型的构建是成功的。最后对PLS-DA分析加载的结果进行描述，利用变量重要性(VIP)分析，并结合统计学(P<0.05)获得潜在的生物标志物，从对照组与模型组中找到含量变化差异显著的变量，这些变量所涉及到的代谢通路有可能导致肾小球硬化模型的形成。
[0119]对第14天收集大鼠模型的尿液进行LC-MS分析得出大鼠模型的LC-MS图谱进行积分，得出15个生物标志物的含量变化：
[0120]3)首先分析步骤1)得出的轮廓动态变化趋势图，与第0天相比，在模型构建第14天时偏离程度最大；然后，分析步骤2)得出15个生物标志物的含量变化。[0121]1.3HA阻断剂添加[0122]2生物学检测结果
[0123]模型组大鼠肾脏明显缩小，表面有细小颗粒，颜色苍白，肾小管毛细血管塌陷，系膜细胞和基质增生明显，肾小球囊壁增厚，间质细胞增加，纤维增多，远端肾小管扩张，多伴有炎细胞浸润，肾小球硬化特征十分明显。[0124]实验二[0125]1实验过程
[0126]1.1模型建立：
[0127]将12只雄性SD大鼠随机分为正常对照组(假手术组)、模型组(各8只)，于SPF级动物房中适应性饲养一周后开始实验，期间自由进食饮水以及自然光照。采用左侧肾切除再结合给与大鼠尾静脉注射盐酸多柔比星的方法构建大鼠肾小球硬化模型。[0128]具体方法为：用10％的水合氯醛(按0.3ml·100g-1换算)腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，腹部备皮，碘伏消毒，在无菌条件下，沿腹中线偏左1cm处行纵向切口约3cm，逐层分离皮肤、组织层，暴露出左侧肾脏，用4-0号手术缝合线在接近肾门处将肾动脉和肾静脉一起结扎，并远离结扎处0.5cm处再进行二次结扎，并在此处用止血钳止血，在两次结扎中间处，用手术剪一并剪断肾静脉和肾动脉，若无出血渗血情况，松开止血钳，游离出肾脏且不损伤肾上腺，同时结扎左侧输尿管。之后用1ml五水头孢唑林钠(1g·100ml-1双蒸水)对手术组进行局部抗感染，之后依次缝合肌肉层和皮肤层，关闭腹腔。其中假手术组按以上操作步骤进行手术，仅游离左侧肾脏，触及肾包膜，不切除肾脏，也不对其进行结扎和切除，术后连续三天，每日腹腔注射1ml五水头孢唑林钠(1g·100ml-1双蒸水)，同时在手术缝合处用碘伏对
13
CN 111393523 A
说 明 书
10/10页
伤口进行消毒，防止感染。同时，在切除大鼠左侧肾脏后第7天、14天，分别由尾静脉注射盐酸多柔比星注射液各5mg·kg-1。
[0129]1.2肾小球硬化大鼠模型的评价方法的建立
[0130]1)应用多元统计分析方法对代谢轮廓进行表征，采用主成分分析法(PCA)对数据进行模式识别，考察各组数据轮廓的分离情况。[0131]具体方法是在大鼠术后的第7天、第10天和第14天分别收集大鼠模型的尿液，首先对术后第7天、第10天和第14天收集大鼠模型的尿液分别进行LC-MS分析，得出大鼠模型的LC-MS图谱；然后对大鼠模型的LC-MS谱图积分数据矩阵进行多元统计分析，得出大鼠模型的轮廓图进而对大鼠模型的轮廓图进行轮廓动态分析，得出大鼠模型的轮廓动态变化趋势图；在不同的时间点，模型组偏离正常对照组的程度不同，而在模型复制术后第14天时偏离程度最大，说明在术后第14天代谢调控网络发生显著变化，证明肾小球硬化模型复制成功。[0132]2)在PCA动态分析的基础上，利用偏最小二乘-判别分析法(PLS-DA)对正常组和术后第14天模型尿液进一步分析，得到与正常组对术后第14天模型组尿液轮廓图。接着运用响应置换检验验证模型(R2值代表模型的解释能力，Q2值代表模型的预测能力，Q2>0.5说明模型预测能力较好，模型有效；Q2>0.9说明此模型效果突出)，模型响应置换结果为：R2＝0.54，Q2＝－0.192，响应置换检验中的Q2<0则说明建模成功，没有出现过度拟合。得分图中各组内的样本点也趋于集中，正常对照组与模型组之间分隔更远，且通过了响应置换检验，说明该模型的拟合度较好，进一步验证了PLS-DA模型的构建是成功的。最后对PLS-DA分析加载的结果进行描述，利用变量重要性(VIP)分析，并结合统计学(P<0.05)获得潜在的生物标志物，从对照组与模型组中找到含量变化差异显著的变量，这些变量所涉及到的代谢通路有可能导致肾小球硬化模型的形成。
[0133]对第14天收集大鼠模型的尿液进行LC-MS分析得出大鼠模型的LC-MS图谱进行积分，得出15个生物标志物的含量变化：
[0134]3)首先分析步骤1)得出的轮廓动态变化趋势图，与第0天相比，在模型构建第14天时偏离程度最大；然后，分析步骤2)得出15个生物标志物的含量变化。[0135]2生物学检测结果
[0136]模型组大鼠肾脏略有缩小，表面有细小颗粒，颜色苍白，肾小管毛细血管塌陷，系膜细胞和基质增生，肾小球囊壁增厚，间质细胞增加，纤维增多，远端肾小管扩张，多伴有炎细胞浸润，肾小球硬化特征较明显。[0137]实验结果表明，HA阻断剂的添加实现完全消除HA干扰，避免残留的HA与动物免疫球蛋白的片段结合对实验产生干扰，样本检测的准确性提高。[0138]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
14
CN 111393523 A
序 列 表
1/3页
序列表<110> 江苏帆博生物制品有限公司<120> 一种HA阻断剂及其制备方法<160> 4<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 442<212> PRT<213> 人工序列(ArtificialSequence)<400> 1Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ser 35 40 45Ala Asn Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Pro Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60Lys Gly Lys Asp Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Val Gln Ser Ser Ile Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Ala Arg Arg Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala 115 120 125Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Arg Cys Leu 130 135 140Val Lys Gly Tyr Ser Pro Glu Pro Val Thr Leu Pro Trp Asn Ser Gly145 150 155 160Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Leu Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly 165 170 175Leu Asn Thr Leu Ser Ser Ser Leu Thr Val Thr Ser Ser Thr Ser Pro 180 185 190Ser Gln Ser Ile Thr Arg Asn Val Ala Asn Pro Ala Ser Ser Pro Lys 195 200 205Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro 210 215 220
15
CN 111393523 A
序 列 表
2/3页
Arg Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe225 230 235 240Ile Gly Pro Pro Lys Ile Lys Asn Val Leu Met Ile Ser Lys Ser Pro 245 250 255Ile Val Thr Tyr Val Val Val Asp Lys Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val 260 265 270Gln Ile Ser Trp Phe Val Gly Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Asp 275 280 285Asp Tyr Ala Tyr Thr Leu Tyr His Ser Thr Leu Arg Ala Val Ser Ala 290 295 300Leu Pro Ile Gln Ala Gln Asp Trp Met Pro Gly Lys Glu Phe Lys Cys305 310 315 320Lys Asp Asn Asn Lys Asp Leu Ala Ala Pro Ile Arg Arg Thr Ile Ser 325 330 335Lys Ala Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Thr Pro Pro 340 345 350Arg Glu Glu Glu Arg Thr Lys Lys Gln Val Thr Arg Thr Cys Met Val 355 360 365Arg Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly 370 375 380Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp385 390 395 400Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Lys Leu Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp 405 410 415Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His 420 425 430Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg 435 440<210> 2<211> 1329<212> DNA<213> 人工序列(ArtificialSequence)<400> 2<210> 3<211> 223<212> PRT<213> 人工序列(ArtificialSequence)<400> 3Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
16
CN 111393523 A
序 列 表
3/3页
1 5 10 15Asp Val Leu Ser Lys Ser Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Lys Val Trp 20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45Tyr Lys Thr Ser Asn Leu His Thr Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Gly65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Phe 85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Val Ala 100 105 110Pro Thr Ala Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 115 120 125Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Lys Asp Arg Phe Lys Asp Ser 130 135 140Asn Val Lys Cys Glu Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu145 150 155 160Asn Pro Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys His Ser Thr Tyr Ser Thr Ser 165 170 175Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190Thr Thr Glu Ala Thr His Ile Ile Ser Thr Ser Pro Ile Val Arg Ser 195 200 205Phe Asn Arg Asn Glu Gly Ile Arg Asp Arg Ala Asp Leu Ile Gly 210 215 220<210> 4<211> 672<212> DNA<213> 人工序列(ArtificialSequence)<400> 4
17
CN 111393523 A
说 明 书 附 图
1/3页
图1
18
CN 111393523 A
说 明 书 附 图
2/3页
图2
19
CN 111393523 A
说 明 书 附 图
3/3页
图3
20
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容