第04章 紫外-可见分光光度计教学指导

1． 基本要求

1.1了 解

(1)分光光度计的概念

(2)紫外光区和可见光区的波长范围 (3)紫外-可见分光光度计准确性的影响因素 (4)紫外-可见分光光度计的应用 1.2 熟 悉

(1) 紫外-可见分光光度计的性能指标

(2) 紫外-可见分光光度计的常见故障及排除方法 1.3 掌 握

(1)紫外-可见分光光度计工作原理

(2)紫外-可见分光光度计的基本结构及各部件的基本功能 (3)紫外-可见分光光度计的基本类型及其特点

基本要求 重点难点 讲授学时 内容提要 2． 重点难点

2.1重 点 (1) 光的吸收定律

(2) 紫外-可见分光光度计的基本结构及各部件功能 (3) 紫外-可见分光光度计的基本类型及功能特点 2.2 难点

2.2.1 吸光度与液层厚度及溶液浓度的关系 2.2.2 摩尔吸光系数和比吸光系数 2.2.3 各种光源的功能特点 2.2.4 单色光的产生与颜色互补

2.2.5 单光束与双光束紫外-可见分光光度计的区别

3． 讲授学时

建议4学时

4． 内容提要 第一节 第二节 第三节 第四节 第五节

4.1 紫外-可见分光光度计的工作原理和基本结构

4.1.1 紫外-可见分光光度计的工作原理

光照射到物质可发生折射、反射和透射,一部分光会被物质吸收。不同的物质会吸收不同波长的光。改变入射光的波长，并依次记录物质对不同波长光的吸收程度，就得到该物质的吸收光谱。每一种物质都有其特定的吸收光谱，因此可根据物质的吸收光谱来分析物质的结构、含量和纯度。紫外-可见分光光度计的工作原理遵循朗伯-比尔定律。设入射光强度为I0，当透过浓度为c、液层厚度为b的溶液后，透射光强度为I，透射光强度与入射光强度的比值称为透光度，也叫透射率，以T表示。当液层厚度b或溶液浓度c按算术级数增加时，透光度T按几何级数减少，数学表达式为:

T

式中k为比例常数。

I10kbcI0

在光谱分析中，常常用吸光度表示溶液对入射光的吸收程度。吸光度与透光度的关系是：吸光度等于透光度的负对数，用A表示吸光度，有下列公式关系。

AlgTlg

该公式表明，当用一束单色光照射吸收溶液时，其吸光度与液层厚度及溶液浓度的乘积成正比。此即朗伯-比尔定律。在朗伯-比尔定律中，比例常数k称为吸光系数。如果溶液浓度以物质的量的浓度表示时，此常数称为摩尔吸光系数（ε），它表示在一定波长下测得的液层厚度为1cm、溶液浓度c为1mol/L时的溶液吸光度值。如果溶液浓度以质量体积比表示时，此常数称为比吸光系数（a），它表示当溶液浓度为1g/L、液层厚度为1cm时，在一定波长下测得的吸光度值。摩尔吸光系数ε和比吸光系数a可相互换算。

4.1.2 紫外-可见分光光度计的基本结构

紫外-可见分光光度计的基本结构由光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示系统五部分组成。结构示意图见图1

光 源 单色器 吸收池 IlgI0检测器 图1 紫外-可见分光光度计的基

本结构示意图

2

（1）光源：是提供入射光的装置。不同类型的分光光度计根据需要配有不同的光源，在紫外-可见分光光度计中，常用的光源有钨灯或卤钨灯、氢灯或氘灯、汞灯等多种。钨灯和卤钨灯，是紫外-可见分光光度计使用最多的光源之一，其发出光的波长范围是330nm～2500nm，是连续光谱，需用单色光器进行分光；紫外光区较窄，仅为330nm～400nm，所以钨灯或卤钨灯不适用于紫外分析。氢灯和氘灯，是紫外-可见分光光度计的紫外光源，其发出光的波长范围是150nm～400nm，是连续光谱，需用单色光器进行分光，是紫外光区的主要光源。汞灯发射的是离散线光谱，在254nm～734nm范围内产生一系列谱线，能量绝大部分集中在253nm波长处。

（2）单色器：是将来自光源的复合光分解为单色光并分离出所需波段光束的装置，是分光光度计的关键部件。主要由入射狭缝、色散元件、准直镜和出射狭缝组成。

（3）吸收池：又称为比色皿、比色杯、样品池或液槽等，是用来盛放被测溶液的器件，同时也决定着透光液层厚度、特定波长光的透光度等多种参数，应具有良好的透光性和较强的耐腐蚀性。在可见光范围内，常用无色光学玻璃或塑料制作；在紫外区，需用能透紫外线的石英玻璃或蓝宝石制作。

（4）检测器：又称为光电转换器，把光信号转换为电信号的装置。用于紫外-可见分光光度计上的检测器种类较多，包括光电管、光电倍增管、光电二极管阵列等。

（5）信号显示系统是把放大的信号以适当的方式显示或记录下来的装置。常用的信号

显示装置有指针显示、LD数字显示、VGA屏幕显示和计算机显示等四种类型。

4.1.3 单色光的产生与颜色互补

（1）单色光的产生 紫外-可见分光光度计所用的光源，发射光的光谱是连续的光源。而被测物质所需要的光是单色光，需要在连续的光谱中分离出单一波长的单色光。单色光是由单色器产生的，用于分光光度计上的单色器主要有棱镜单色器和光栅单色器两种。棱镜单色器的分光原理是光的折射原理，不同波长光的折射率不同，当一束平行的混合光进入棱镜单色器后就会按波长顺序分解成各种单一波长的单色光，根据需要选择不同波长的光。光栅单色器是利用光的衍射和干涉原理进行分光的。

（2） 颜色互补光 如果将两种颜色的单色光按一定的强度比例混合可以成为白光，这样的两种光互称为互补光。紫外-可见分光光度计的可见光谱分析要求被测溶液的颜色与所用的单色光互补，以求达到溶液对光的最大吸收。在某些方法学研究中要预先测定某种溶液的最大吸收光的波长。

4.2 紫外-可见分光光度计的分类

紫外-可见分光光度计可以按仪器的使用光波长分类；也可按仪器的光学系统分类。按使用波长分类可分为：紫外分光光度计（0.1nm～200nm）；可见分光光度计（360nm～800nm）；紫外-可见分光光度计（200nm～1000nm）；紫外-可见-红外分光光度计（200nm～2500nm）等。按光学系统分类可分为：单光束分光光度计；双光束分光光度计；双波长分光光度计；双波长—双光束分光光度计；动力学分光光度计等。根据目前分光光度计的应用情况，主要介绍单光束、双光束和双波长等三种分光光度计。 4.2.1 单光束分光光度计

单光束分光光度计是一类结构简单，使用、维护比较方便，应用广泛的分光光度计。其设计原理和

3

结构具有以下特点：①单光束光路，从光源到试样至接收器只有一个光通道，使用中依次对参考样品和待测试样进行测定，然后将二次测定数据进行比较、计算，获得最终结果；②只有一个色散元件，工作波长范围较窄；③通常采用直接接收放大显示的简单电子系统，用电表或数字显示；④结构简单、附件少、功能范围小，不能做特殊试样测定。目前国内常用的721型分光光度计和751型分光光度计均为单光束分光光度计，其结构示意图分别见图2和图3。

4.2.2 双光束分光光度计

双光束分光光度计在其出射狭缝和样品吸收池之间增加了一个光束分裂器或斩波器，作用是以一定的频率将一个光束交替分成两路，使一路经过参比溶液，另一路经过样品溶液，然后由一个检测器交替接收或由两个检测器分别接收两路信号，这是目前国内外使用最多，性能较为完善的一类分光光度计。双光束分光光度计结构示意图见图4。

光源 单色器 斩波器 吸收池 检测器

1 3 2 5 4 6 7 8 9 10 12 11 13 准光镜 图2 721型分光光度计结构示意图

1－光源 2－聚光透镜 3－色散棱镜 4－准直镜 5－保护玻璃 6－狭缝 7－反射镜 8－光栏 9－聚光透镜 10－吸收池 11－光门 12－保护玻璃 13－光电倍增管

图4 双光束分光光度计光路图

4.2.3 双波长分光光度计

双波长分光光度计的基本工作原理是从同一光源发出的光被分为两束，分别经两个单色器分光后得

4

到两束不同波长（λ1，λ2）的单色光，经切光器使两束光以一定频率交替照射同一样品，然后经过检测器显示出两个波长下的吸光度差值（ΔA=Aλ2-Aλ1）。双波长分光光度计结构示意图见图5。

单色器 G1 光源 λ1 切光器 吸收池 接收器

G2 λ2 △A=Aλ2－Aλ1

图5 双波长分光光度计光路图

只要λ1、λ2选择适当（被测物在一个波长上有最大吸收峰，在另一个波长上没有吸收或很少吸收；而非被测物在两个波长上的吸收是相同的），ΔA就是消除了非特征性吸收干扰（即扣除了背景吸收）的吸光度值。双波长分光光度计不用参比溶液，只用一个待测溶液，能较好的解决由于非特征吸收信号（如试样的浑浊、吸收池与空气界面以及吸收池与溶液界面的折射差别等）影响而带来的误差，大大提高检测的准确度。

4.3 紫外-可见分光光度计的性能指标及准确性影响因素

4.3.1 性能指标

（1）波长准确度和波长重复性：波长准确度也叫波长精度，是指仪器波长指示器上所指示的波长值与仪器实际输出的波长值之间的符合程度。波长重复性是指在对同一个吸收带或发射线进行多次测量时，峰值波长测量结果的一致程度。

（2）光度准确度：是指仪器在吸收峰上读出的透射率或吸光度与已知真实透射率或吸光度之间的偏差。该偏差越小，光度准确度越高。

（3）光度线性范围：是指仪器光度测量系统对于照射到接收器上的辐射功率与系统的测定值之间符合线性关系的功率范围，即仪器的最佳工作范围。只有在光度线性范围内测得的物质的吸光系数才是一个常数，此时仪器的光度准确度最高。由于分光光度计测得的数据都是相对于100%和0%而言的相对值，而100%和0%都是自由设定的。因此，如果分光光度计的光度系统的响应在0%～100%范围内是线性的，就可以认为光度读数是正确的。

（4）分辨率：是指仪器对于紧密相邻的峰可分辨的最小波长间隔，反映仪器分辨吸收光谱微细结构的能力，是衡量仪器性能的综合指标。单色器输出的单色光的光谱纯度、强度以及检测器的光谱灵敏

5

度等是影响仪器分辨率的主要因素。

（5）光谱带宽：是指从单色器射出的单色光（实际上是一条光谱带）最大强度的1/2处的谱带宽度。它与狭缝宽度、分光元件、准直镜的焦距有关。

（6）杂散光：除所需波长单色光以外，其余所有的光都是杂散光。杂散光是测量过程中的主要误差来源，会严重影响检测准确度。

（7）基线稳定度：是指在不放置样品的情况下，扫描100%T或0%T时读数偏离的程度，是仪器噪声水平的综合反映。

（8）基线平直度：是指在不放置样品的情况下，扫描100%T或0%T时基线倾斜或弯曲的程度，是仪器的重要性能指标之一。

4.3.2 分光光度计准确性的影响因素

（1）单色光不纯的影响

光的吸收定律只是在入射光为单色光的条件下成立，通常所指的单色光是指有一定谱带宽度的光谱。由于单色器的类型和质量不同，得到的单色光纯度不同，加上使用中狭缝宽度调节不当，都可造成入射光的单色性不纯。各种原因引起的单色光不纯都可使仪器读数不准，造成分光光度计的测量误差。

（2）杂散光的影响

杂散光会严重影响检测准确度。有两种原因引起的杂散光对检测结果具有较大影响：①仪器中光学、机械零件的反射和散射等原因使所采用的测定波长的光偏离正常光路，在不通过样品的情况下直接照射到单色器。这种杂散光波长与测定波长相同；②由仪器的光学系统设计制作缺陷引起。如不必要的反射面、光束孔径不匹配、光学元件表面的擦痕、光学系统的像差、不均匀色散以及由于机械零部件加工不良、位置错移、仪器内壁防眩黑漆脱落等。

（3）吸收池的影响

吸收池的质量不好或使用保管不当、吸收池不配套、透光面被污染上油污、指纹、沉淀，吸收池与光路不垂直等原因，都可影响捡测结果的准确性。

（4）电压、检测器负高压波动的影响

仪器电源电压波动过大，超过了仪器的稳压范围或稳压器质量不好，都可引起光源电压、检测器负高压波动，造成光源光强波动和检测器噪声增大，使检测结果准确度降低。

（5）仪器狭缝宽度的影响

分光光度计单色器分出来的单色光是通过狭缝截获而得到的，如果狭缝的质量不好或者开得太大，所截获的单色光波长的单一性就差，杂波就会与测定波长一起进入吸收池，干扰测定，引起测定误差。

（6）背景吸收的影响

待测样品中存在着一些杂质，在待测样品所测定的波长有较大的吸光度，造成背景吸收，使待测物质的吸光度增加或引起待测物质的吸收光谱相重叠。

（7）其它因素的影响

6

吸光度读数刻度误差、仪器安装环境（如振动、温度变化）、化学因素（如溶液的pH值、荧光、溶剂效应）等也会影响检测结果的准确性。

4.4 紫外-可见分光光度计的常见故障及排除方法

分光光度计是由光、机、电等几部分组成的精密仪器，为保证仪器测定的数据正确可靠，不仅应注意正确的安装调试，按操作规程使用、保养等，还应了解并能排除仪器的常见故障。紫外-可见分光光度计常见故障和排除方法如下表所示。

表 紫外-可见分光光度计常见故障现象及排除方法

故 障 现 象 故 障 原 因 排 除 方 法 接好电源线 检查保险丝，更换新的保险丝 整机检查，并与厂方联系 检修光门盖 更换放大器 变换灵敏度开关，调整光源 更换新的光源 检查比色器架子，摆正位置 检修光门 进行波长校正 清洗吸收池 重新配制溶液 需预热20分钟以上 更换光源 调换仪器运行环境 对正样品室 加稳压器，消除干扰 重新启动，正确操作 与厂家联系解决 接通电源后，指示灯不亮， 电源线接触不良 仪器不工作 保险丝坏 电路故障 光门不能完全关闭 不能调零（即0％T） 微电流放大器损坏 光能量不够 不能置100％T 光源（钨灯、氘灯）损坏 吸收池架没安装到位 光门不能完全打开 仪器受振动等原因使波长位移 测光精度不准 吸收池有污垢 样品混浊，配制溶液不准确 预热时间不够 光源老化 噪声指标异常 环境振动过大，空气流速过大 样品室不正 电压低，强磁场 其 他 程序错误 不明故障原因 4.5 紫外-可见分光光度计的应用

4.5.1 定性分析

紫外-可见分光光度计的定性分析对未知样品测定所得到的光谱参数与已知化合物进行比较，从而确定未知样品的基本性质，这种方法又称为定性鉴定。在进行定性分析时要注意以下两点：①测试溶剂 选择的测试溶剂应当有较好的稳定性，应当对标准物和待测物有良好的溶解度，本身在测定的波长内无吸光度或吸光度很小。②测试条件 标准物和待测物的测试条件要完全相同，如溶剂、pH、离子强度、温度及所用的仪器。 4.5.2 定量分析

7

定量分析是对被测物质进行含量测定。在临床生物化学检验的方法学研究中，应用分光光度计进行定量分析是非常可靠的方法。方法研究成熟后，可以用同样的条件转移到生化自动化分析仪上实现自动化分析。定量分析主要包括比色分析法测定和消光系数法测定。

(1)比色分析法测定 在一定范围内，溶液中溶质的含量与溶液颜色的深浅成正比，溶液颜色的深浅与吸光度成正比，与透光度成反比。因此，可以通过测定溶液吸光度的变化来确定该溶液中溶质的含量。这种分析方法称为比色分析法，大多是在可见光范围内进行。比色分析原理主要依据朗伯-比尔定律，即待测溶液在一定浓度范围内吸光度值的大小与浓度成正比。只要测出待测溶液的吸光度值和标准溶液的吸光度值，将待测溶液的吸光度值与标准溶液的吸光度值进行比较，便可知道待测溶液的浓度，可以计算出溶液中溶质的含量。在可见光区的比色分析中，主要考虑溶液的颜色与单色光的互补性，只有选择最佳的互补单色光才能得到最好的测定值。比色分析中，多数溶液是有色溶液，用可见光分析就可以；对于某些无色溶液，由于有一些特殊的化学基团，也可以进行比色分析。如蛋白质分子中含有芳香族氨基酸，在280nm处有最大吸收峰；核酸分子中含有碱基，在260nm处有最大吸收峰，利用它们的最大吸收峰特性进行比色定量分析，只不过所应用的是紫外分光光度计。

(2)消光系数法测定 蛋白质分子中含有芳香族氨基酸，在280nm处有特定的吸光度值。但是，不同蛋白质分子中含有芳香族氨基酸数量是不同的，相同质量的不同蛋白质在280nm处的吸光度值是不同的。每一种蛋白质在280nm处有一个特定的消光系数，只要在280nm处测出该蛋白质的吸光度值，对照消光系数表就可以计算出蛋白质的含量。 4.5.3 纯度鉴定

一种物质在一定的条件下、一定的波长范围内，它的吸收光谱是一定的。根据它们的吸收光谱最大吸收峰的位置或吸收峰形状和数量，可以判断该物质的纯度。例如，在核酸提取过程中，经常会混有蛋白质，如何判断所提取的核酸的纯度，利用紫外分光光度计就可以完成这项工作。在紫外光区，核酸的最大吸收峰是260nm，蛋白质的最大吸收峰是280nm。如果有蛋白质污染、盐过量或有机溶剂过量，都会导致吸光度值的偏离。因此，用A260/A280和A260/A230的比值，能合理判断样品的纯度。纯RNA样品的A260/A280的比值是2.0±0.1，纯DNA样品的A260/A280的比值是1.8±0.1。不管是RNA还是DNA，A260/A230的比值应大于2.0但小于2.4。A260/A230的比值不在这个范围的说明样品有污染。通常情况下，A260/A280数值低说明分离的RNA有蛋白质污染，A260/A230数值低说明分离的RNA有胍盐（细胞裂解液中含有）或β-巯基乙醇污染。

另外还有其它几种物质的纯度鉴定可以应用紫外-可见分光光度计。乙醇纯度检查，乙醇中最主要的杂质是苯，苯在紫外光区的256nm处有一个很强的吸收峰，只要在256nm处的吸光度值超标，就可以判断乙醇中混有苯。四氯化碳纯度检查，四氯化碳中的杂质主要是二硫化碳，二硫化碳在318nm有强吸收峰，测定318nm的吸光度值，就可判断四氯化碳中有无二硫化碳污染。

8