感染A型产气荚膜梭菌小鼠体内α毒素的分布及定位

动物医学进展，２０１ｌ，３２（１０）：１９—２３　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　感染Ａ型产气荚膜梭菌小鼠体内　毒素的分布及定位　王苗利，蔡玉梅　，柴同杰　，张红娜　（山东农业大学动物科技学院环境微生物实验室，山东泰安２７１０００）　摘　要：为了研究ａ毒素在感染Ａ型产气荚膜梭茵动物的体内的分布情况，自制了高效价的兔抗ａ毒　素多克隆抗体作为一抗，ＨＲＰ和ＦＩＴＣ分别标记的羊抗兔ＩｇＧ作为二抗，通过免疫组化法对ａ毒素进行了　定位检测。结果表明，在小鼠延髓、肠、肾、肺、胃的间充质细胞胞浆中发现了阳性颗粒，在脾、肝的问充质细　胞中未发现毒素分布。结果提示，首次在延髓的细胞胞浆中发现了ａ毒素，表明ａ毒素能突破血脑屏障进入　延髓损坏生命中枢，这可能是引起动物死亡的一个重要原因。　关键词：Ａ型产气荚膜梭茵；ａ毒素；蛋白表达；免疫组化　中图分类号：￥８５２．６１６．３　文献标识码：Ａ　文章编号：１００７—５０３８（２０１１）１０—０００１９—０５　产气荚膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）又　成；限制性内切酶、ＤＮＡ凝胶回收试剂盒和克隆载　司产品；感受态细胞ＴｏｐｌＯ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｌｙｓＳ及其　ＤＮＡ抽提试剂为北京全式金生物技术有限公司产　品；Ｎｉ—Ａｇａｒｏｓｅ　Ｈｉｓ标签蛋白纯化柱、抗体亲和层析　纯化柱及Ｔ—ＭａｘＴＭ佐剂为南京金斯瑞生物科技有　限公司产品；ＨＲＰ标记羊抗兔二抗、ＦＩＴＣ标记羊抗　称魏氏梭菌，是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症　体、表达载体ｐＥＴ２８ａ为宝生物工程（大连）有限公　和人创伤性气性坏疽的主要病原菌之一［１］。该菌分　为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ　５个型，其致病因子是菌体产生的　外毒素嘲。在家畜，主要引起牛羊“猝死症　。在　家禽，主要引起坏死性肠炎而危害养禽业［４］。其中　Ａ型产气荚膜梭菌病是影响养殖业的主要疾病之　一，给养殖业带来了巨大的经济损失。此外，Ａ型产　兔二抗、过氧化物酶ＤＡＢ底物显色液为北京博奥森　生物公司产品。　１＿２　方法　气荚膜梭菌还可引起人的食物中毒［　。该型菌的主　要致病毒素是ａ毒素，它具有细胞毒性、溶血活性、　致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性　等特性［６］。　１．２．１　ａ毒素全基因的ＰＣＲ扩增、克隆及表达载　体的构建　通过引物软件ＤＮＡ　Ｓｔａｒ以及ｐｒｉｍ—　ｍｅｒ５．０，设计上游引物５＇－ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴ—　国内外对产气荚膜梭菌ａ毒素的致病性进行了　许多方面的研究［７］，但缺少具体的有关检测Ａ型产　ＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＴＧＴ－３　，下游引物５　１＿ＧＣＧ—　气荚膜梭菌ａ毒素在患病动物体内各组织中的分布　ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＡＴＴＡＴＡＡＧＴＴ一３　。　情况的研究。本试验以小鼠为试验动物，采用免疫　预期产物长度１　２２８　ｂｐ。回收ＰＣＲ产物，与Ｔ载体　组化方法探讨ａ毒素在小鼠体内的分布，方法简便，　操作简单，周期短，便于保存，可为进一步阐明ａ毒　素致病机理提供科学的理论依据。　连接、转化，蓝白斑筛选阳性重组菌。将重组质粒与　表达载体ｐＥＴ２８ａ用ＥｃｏＲ　Ｉ／Ｘ　０　Ｉ双酶切，回收片　段和线性ｐＥＴ２８ａ，将两者连接、转化，筛选阳性重组　ｌ材料与方法　１．１　材料　菌落，接种于含１００　ｍｇ／ｍＬ　Ｋａｎ的ＬＢ培养液中扩　增，提取质粒，送金斯特工程有限公司测序。　１．２．２　ａ毒素蛋白的诱导表达与纯化　将重组菌　液接种到ＬＢ培养基中，分为４组，３７℃振荡培养，　ＩＰＴＧ终浓度分别为０、０．１、０．６、１．０　ｍｍｏｌ／Ｌ，将　不同时间的菌液取样，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析，同时做　产气荚膜梭菌Ａ５２８型菌株（ＡＴＣＣ５２８标准菌　株，由德国柏林大学提供），本实验室保存；新西兰兔　（２．５　ｋｇ）及昆明小鼠（１８　ｇ～２０　ｇ），购自泰邦生物公　司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合　收稿日期：２０１１一Ｏ４—１２　基金项目：山东农业大学青年科技创新基金（２３６５５）；中国国际合作项目“动物疫源性人畜共患病的监测”　（２００９ＤＦＡ３２８９０）　作者简介：王苗利（１９８７一），女，山东泰安人，硕士研究生，主要从事产气英膜梭茵致病性的研究。＊通讯作者　２０　动物医学进展　２Ｏｌ１年第３２卷第９期（总第２２０期）　空载体对照组，根据电泳结果判定最佳诱导条件。　浓度为１：２００的ＨＲＰ标记的山羊抗兔ｌｇＧ，３７℃　将最佳条件下表达的菌液超声裂解，４℃离心，分离　上清与沉淀。沉淀用尿素重悬，与上清分别上柱纯　化，透析。　湿盒孵育４０　ｒａｉｎ，用ＰＢＳ漂洗２　ｒａｉｎ×３次；滴加辣　根过氧化物酶ＤＡＢ显色液至标本上，显色５　ｒａｉｎ　１０　ｒａｉｎ，蒸馏水充分洗涤终止反应；切片置人Ｇｉｌｌ苏　木素中染色ｌ　ｒａｉｎ，脱水，透明封片，镜检。　１．２．３　制备兔抗ａ毒素多克隆抗体　将透析后蛋　白与佐剂混合制成疫苗免疫兔，同时设对照组，１４　ｄ　ＦＩＴＣ荧光标记免疫组化操作方法同免疫组织　化学检测，只是在ＨＲＰ标记的山羊抗兔ＩｇＧ，３７℃　湿盒孵育４０　ｍｉｎ后，ＰＢＳ漂洗２　ｍｉｎ×３次后，即可　后第２次免疫，２８　ｄ后第３次免疫，３５　ｄ后采血　ＥＬＩＳＡ测滴度，３８　ｄ后颈部采血，经亲和层析柱纯　化去除杂抗体，测定效价。　１．２．４　Ａ型产气荚膜梭茵攻毒试验　将Ａ５２８菌　株接种于Ｇｏｒｄｏｎ产毒肉汤，４２℃厌氧震荡培养６　ｈ　～９　ｈ，取培养液常规硫酸铵沉淀法提取外毒素，用　灭菌生理盐水稀释，腹腔皮下注射于６只小鼠，同时　设生理盐水注射阴性对照组，取７２　ｈ内死亡小鼠的　组织，投入４０　ｇ／Ｌ多聚甲醛固定液中，阴性对照组　操作同上。　１．２．５　组织切片的制备及病理组织学检查　组织　于多聚甲醛中固定４８　ｈ后，常规脱水、透明、包埋、　切片。取对照组和攻毒组的切片做常规ＨＥ染色，　观察病理组织学变化。操作步骤如下：切片经二甲　苯脱蜡，梯度酒精脱水，水化，置入Ｇｉｌｌ苏木素中染　色１０　ｒａｉｎ，水冲至不脱色。盐酸酒精溶液分化、返　蓝。取出切片置于８５０　ｍＬ／Ｌ酒精溶液２　Ｓ，再置于　１０　ｇ／Ｌ伊红染液染色０．５　ｍｉｎ～１　ｍｉｎ，水冲至不脱　色为止。取出切片进行酒精脱水，二甲苯透明，封　片、镜检。　１．２．６　ａ毒素蛋白的免疫组织化学检测　取攻毒　组的组织切片，分别进行酶标及荧光标记免疫组化　实验。将兔抗ａ毒素一抗稀释倍数依次设为１：５０、　ｌ：１００、ｌ：３００，１：６００、１：１　０００，ＨＲＰ标记二抗　稀释倍数为１：１００、１：２００，ＦＩＴＣ标记二抗稀释倍　数为１：１００、１：２００。同时设阴性对照，阴性对照　使用未攻毒小鼠组织，摸索一抗、二抗的最佳稀释倍　数。步骤如下：将各组织切片于５７℃烤箱内烘烤４　ｈ后，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，水化；取出切片于　３　ｍＬ／Ｌ过氧甲醇中室温孵育２０　ｍｉｎ，再用ＰＢＳ漂　洗２　ｍｉｎ×３次，置于０．５　ｍＬ／Ｌ　Ｔｅｗｅｅｎ一２０中室温　孵育３　ｍｉｎ￣５　ｍｉｎ；将切片浸于柠檬酸盐缓冲液中，　进行微波修复，每次修复５　ｍｉｎ，共修复３次，中间室　温冷却，冷却后ＰＢＳ漂洗２　ｍｉｎ×３次；滴加５０　ｇ／Ｌ　ＢＳＡ封闭液，于３７℃湿盒内孵育２０　ｒａｉｎ；弃去孵化　液，滴加ｌ：３００稀释浓度的兔抗ａ毒素抗体，４℃湿　盒内孵育１４　ｈ～１８　ｈ后，取出湿盒于３７℃复温４５　ｍｉｎ，ＰＢＳ漂洗２　ｒａｉｎ×３次；切片置０．５　ｍＬ／Ｌ　Ｔｅｗｅｅｎ一２０中室温孵育２　ｒａｉｎ，弃去多余液体，滴加　封片于荧光显微镜下进行镜检。　２结果　２．１　ａ毒素全基因ＰＣＲ扩增、克隆及表达载体的　构建结果　在进行了３２个循环的扩增后，经１０　ｇ／Ｌ琼脂　糖凝胶电泳，结果表明，成功扩增出ｌ　２２８　ｂｐ的ａ毒　素基因片段（图１）。　Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ　２　０００；１～３．目的片段　Ｍ．ＤＮＡ　ＭａＲｒ　ＤＬ　２　０００　ｌ　１－３．Ｔａｒｇｅｔ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　图１　ＰＣＲ结果电泳图　Ｆｉｇ．１　Ｅ１ｅｃｔｒｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　阳性重组质粒经Ｅｃ０Ｒ　Ｉ／ＨｉｎｄＩｎ双酶切后能　被切成约１．２　ｋｂ和５　ｋｂ的２个片段，与预期的酶切　图谱相一致（图２）。　２　１　Ｍ　５０００ｂｐ　１　０００ｂｐ　Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ　５　０００；１，２．ｐｅｔ２８ａ－ａ载体双酶切结果　Ｍ　ＤＮＡ　Ｍａｋｅｒ　ＤＬ　５　０００；１，２．ｐｅｔ２８ａ－ｅ　ｖｅｃｔｏｒ　ｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　图２　重组表达质粒双酶切产物电泳图　Ｆｉｇ．２　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ　２．２　ａ毒素蛋白的诱导表达与纯化结果　取不同ＩＰＴＧ浓度、不同诱导时间的样品进行　王苗利等：感染Ａ型产气荚膜梭菌小鼠体内Ｕ毒素的分布及定位　２３　膜脱落、出血，肾、肝、脾、心脏、肺、脑、泄殖腔的充　ｐｈａ—ｔｏｘｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ａｖｉａｎ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｏｆ　Ｃ／ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　血、出血；经免疫组织化学检测后，发现毒素主要定　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ口］．Ｃｌｉｎ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ，２００４，４２：１３４５—１３４７．　位在肺、肾、胃、小肠、延髓间充质细胞的细胞质内，　［２］　Ｓｃｈｏｔｔｅ　Ｕ，Ｔｒｕｙｅｎ　Ｕ，Ｎｅｕｂａｕｅｒ　Ｈ．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ｂｅｔａ—ｔｏｘｉ—　ｇｅｎｉｃ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ａｎｉｍａｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　在肝、脾的间充质细胞内没有发现阳性颗粒。根据　ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒｓ？ａ　ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｖｅｔ　Ｍｅｄ　Ｂ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ　Ｖｅｔ　ＨＥ染色及免疫组化检测结果，推测Ａ型产气荚膜　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ，２００４，５１：４２３—４２６．　梭菌ａ毒素的致死的原因如下：细菌在动物体内大　［３］Ｗａｇｅｓ　Ｄ　Ｐ，Ｏｐｅｎｇａｒｔ　Ｋ．Ｎｅｃｒｏｔｉｃ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ，Ｄｉｓｅａｓｅｓ．ｏｆ　ｐｏｕｌｔｒｙ　量繁殖，产生毒素，毒素随血液循环系统到达全身，　［Ｍ］．Ｉｏｗａ　Ｓｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ：Ａｍｅｓ　Ｉｏｗａ，２００３：７８１—７８３．　因ａ毒素具有磷脂酶Ｃ和鞘磷脂酶的活性，破坏细　［４］Ｐａｒｉｓｈ　Ｗ　Ｅ．Ｎｅｃｒｏｔｉｃ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｏｗｌ（Ｃａｌｌｕｓ　ｇａｌｌｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）Ｉ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　胞膜结构的完整性［８　，所以在攻毒致死小鼠的心、　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　Ｃｄｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｗｅｌｃｈｉｉ［Ｊ］．Ｃｏｍｐ　Ｐａｔｈｏｌ，１９６１，７１；３７７—　肝、脑、脾、肺　肾、小肠、胃等组织器官中发现出血、　３９３．　充血、坏死等病变，并在肺、肾、胃、小肠、延髓间充质　［５］Ｆａｅｈ　Ｐ，Ｇｕｉｌｌｏｕ　Ｊ　Ｐ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ／ｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　细胞的细胞质内发现了免疫阳性颗粒。而进入肝脏　ａｌｐｈａ－ｔｏｘｉｎ　（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ｃ）　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｃ／ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　门静脉的血液由于之前已流经脾脏，经过脾脏的吞　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ［刀．Ａｐｐｌ　Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ，１９９３，７４：６１—６６．　噬作用后，进入肝脏的ａ毒素量已经大量减少，又经　［６］吴信法．兽医细菌学［Ｍ］．北京：中国农业出版社，１９９６．　［７］陈小云，关孚时，张存帅，等．产气荚膜梭菌主要外毒素最新研　肝脏自身的解毒作用，因此在肝脏的间充质细胞内　究进展口］．中国兽药杂志，２００５，３９（６）：２９－３３．　没有发现ａ毒素的存在。ａ毒素突破了血脑屏障的　［８３吕存女，张敬友，赵　红，等．微量法测定产气荚膜梭菌毒素　防御作用，侵害延髓的神经元细胞质，影响心脏、肺　［Ｊ］．兰州大学学报，２０００，３６（６）：１０１－１０４．　的自主神经活动。控制动物心跳、呼吸的生理功能　［９］　赵宝华，杨　虹，顾为望．产气荚膜梭菌毒素研究进展［Ｊ］．河北　中枢正是位于延髓，因此，延髓一旦受到破坏，心、肺　师范大学学报：自然科学版，２００２，２６（５）：５０６－５１２．　［１Ｏ］Ｍｅｒｒｉｌｌ　Ｇ　Ａ，Ｒｉｖｅｒａ　Ｖ　Ｒ，Ｎｅａｌ　Ｄ　Ｄ，ａｔ　ａ１．Ａｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｅｌｅｃ—　等器官不能正常工作，动物的生命就会发生危险。　ｔｒｏｃｈｅｍ　ｉｌｕｍ　ｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　Ｃｌｏｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ　ａｌ—　本试验已证实，产气荚膜梭菌ａ毒素能破坏肺、　ｐｈａ　ｔｏｘｉｎ［Ｊ］．Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００６，３５７（２）：１８１—１８７．　肾、胃、肠等问充质细胞的细胞膜进入细胞质内，损　［１１］Ｏｄａ　Ｍ，Ｋｉｈａｒａ　Ａ，Ｙｏｓｈｉｏｋａ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｒｙｔｈｒｏ　ｍｙｃｉｎ　害脏器功能，但关键的因素很可能是ａ毒素能突破　ｏｎ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ　ａｌ－　血脑屏障，侵害延髓的生命中枢，破坏呼吸系统及心　ｐｈａ　ｔｏｘｉｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｅｘｐ　Ｔｈｅｒ，２００８，３２７（３）：９３４—９４０．　［１２］Ｃａｒｍａｎ　Ｒ　Ｊ，Ｓａｙｅｅｄ　Ｓ，Ｌｉ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ　脏的传导系统，从而导致”猝死症”的发生。本试验　ｔｏｘｉｎ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｅｃｅｓ　ｏｆ　ｈｅａｌｔｈｙ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎｓ［Ｊ］．　对Ａ型产气荚膜梭菌的ａ毒素进行了定位，有关其　Ａｎａｅｒｏｂｅ，２００８，１４（２）：１０２－１０８．　他型产气荚膜梭菌的ａ毒素及其他毒素在患病动物　［１３］Ｄｉｔｔｍａｒ　Ｅ，Ｂｅｙｅｒ　Ｐ，Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ　ａｎ　ｔｅｒｏｅｏｌｉ—　体内分布情况的研究也具有重要的意义，有待于进　ｔｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｏｎａｔｅ　ｗｉｔｈ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ：ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，　一步的研究。　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｃｏｕｒｓｅ，ａｎｄ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ａｌｐｈａ　ｔｏｘｉｎ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｐｅｄｉａｔｒ，　参考文献：　２００８，１６７（８）：８９１—８９５．　［１］Ｓｈｅｅｄｙ　Ｓ　Ａ，Ｉｎｇｈａｍ　Ａ　Ｂ，Ｒｏｏｄ　Ｊ　Ｉ，ｅｔ　ａ１．Ｈｉｇｈｌｙ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ａｌ—　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａａｌｐｈａ　Ｔｏｘｉｎ　ｉｎ　Ｍｉｃｅ　Ｉｎｆｅｃｔｅｄ　Ｗｉｔｈ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ　Ｔｙｐｅ　Ａ　ＷＡＮＧ　Ｍｉａｏ—ｌｉ，ＣＡＩ　Ｙｕ—ｍｅｉ，ＣＨＡＩ　Ｔｏｎｇ－ｊｉｅ，ＺＨＡＮＧ　Ｈｏｎｇ—ｎａ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＡｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｆａｎ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，２７１０１７，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｔｅｓｔ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｐｈａ—ｔｏｘｉｎ　ｉｎ　ａｎｉｍａｌｓ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ　ｔｙｐｅ　Ａ，ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｔｉｔｅｒ　ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ—ａｌｐｈａ—ｔｏｘｉｎ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ａｓ　ｐｒｉｍａｒｙ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　ＨＲＰ　ｏｒ　ＦＩＴＣ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ａｌｐｈａ－ｔｏｘｉｎ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ　ｃｅｌｌ　ｐｌａｓｍａ　ｏｆ　ｍｅｄｕｌｌａ，　ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ，ｋｉｄｎｅｙ，ｌｕｎｇｓ　ａｎｄ　ｓｔｏｍａｃｈ　ｅｘｃｅｐｔ　ｌｉｖｅｒ　ａｎｄ　ｓｐｌｅｅｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ａｌｐｈａ—ｔｏｘｉｎ　ｗａｓ　ｆｉｒｓｔｌｙ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｐｌａｓｍａ　ｏｆ　ｍｅｄｕｌｌａ　ｗｈｉｃｈ　ｂｒｏｋｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｂｌｏｏｄ　ｂｒａｉｎ　ｂａｒｒｉｅｒ　ｔｏ　ｄａｍａｇｅ　ｔｈｅ　ｖｉｔａｌ　ｃｅｎ—　ｔｅｒ．Ｉｔ　ｍａｙ　ｂｅ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｅａｓｏｎ　ｗｈｙ　ｔｈｅ　ａｌｐｈａ—ｔｏｘｉｎ　ｃｏｕｌｄ　ｃａｕｓｅ　ａｎｉｍａｌ　ｄｅａｔｈ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ；ｏ【一ｔｏｘｉｎ；ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ