ELISA步骤、试剂及注意事项

操作步骤

方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法：

1. 包被：用0.05M PH9。牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0。1ml,4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。（简称洗涤，下同)。

2. 加样:加一定稀释的待检样品0。1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤.（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

3。 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度)0。1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0。1ml,37℃10～30分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深,阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2。1倍，即为阳性.

方法二 用于检测未知抗体的间接法:

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0。1ml，4℃过夜.次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体）0。1ml,37℃孵育30—60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

试剂器材

1. 试剂

（1） 包被缓冲液（PH9。6 0。05M碳酸盐缓冲液)：NaCO3？1.59克 NaHCO3 2。93克 加蒸馏水至1000ml

（2） 洗涤缓冲液(PH7。4 PBS）:0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8。0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml

（3) 稀释液:牛血清白蛋白（BSA) 0.1克 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等 血清与洗涤液配成5~10%使用。

(4） 终止液(2M H2SO4)：蒸馏水178。3ml，逐滴加入浓硫酸(98％）21.7ml。

(5） 底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸）：0。2M Na2HPO4（28.4克／L) 25。7ml 0.1M 柠檬酸（19。2克／L) 24.3ml 加蒸馏水50ml。

（6）TMB(四甲基联苯胺)使用液：TMB（10mg／5ml无水乙醇) 0。5ml底物缓冲液(PH5.5） 10ml0。75％H2O2 32μl

（7) ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液（PH5。5） 1ml 3%H2O2 2μl （8)抗原、抗体和酶标记抗体. (9) 正常人血清和阳性对照血清。 2. 器材:

(1) 聚苯乙烯塑料板（简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾,洗涤瓶。

（2） 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。 （3) 4℃冰箱，37℃孵育箱.

注意事项

1. 正式试验时,应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性.有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。 2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:

（1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好.

（2） 包被抗体（或抗原）的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时,要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9。6之间.吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响，一般多采用4℃18~24小时.蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1。0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时,观察阳性标本的OD值.选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。

(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度.

(4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应,而本身无色.有些供氢体（如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护.有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间,以10—30分钟为宜.底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入.