酵母培养物对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响

Vol.37 No.4

2017年8月 Journal of Guangdong Ocean University Aug. 2017

第37卷 第4期 广东海洋大学学报

何远法, 迟淑艳, 谭北平, 等. 酵母培养物对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响[J]. 广东海洋大学学报, 2017, 37(4): 21-27.

酵母培养物对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响

何远法1，迟淑艳1，谭北平1, 2，张含乐3，董晓慧1, 2，

杨奇慧1，刘泓宇1，章 双1

（1. 广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；2. 南海生物资源开发与利用协同创新中心，广东 广州 510275；

3. 北京英惠尔生物技术有限公司，北京 100081）

摘 要：在基础饲料中分别添加质量分数0（对照）和0.30%的酵母培养物，配制2种等氮等脂饲料（分别记为Y0、Y0.3组），投喂初始体质量为（1.20±0.01）g的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）56 d。提取凡纳滨对虾肠道总DNA，采用Illumina MiSeq高通量测序比较样品菌群组成和多样性，研究饲料中添加酵母培养物对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响。结果表明，Y0.3组对虾肠道分类单元（OTUs）数量、丰富度指数（Chao1、ACE值）、多样性指数（Shannon、npShannon指数）与Y0组差异无统计学意义（P＞0.05）；从物种分类树发现，两组的主要细菌类群均为变形菌门（Proteobacteria），其中，γ-变形菌纲是对虾肠道的最主要菌群，所占比例达69.48%；从科分类水平看，Y0.3组对虾肠道菌群链球菌科（Streptococcaceae）比Y0组提高4.98%；从优势属水平来看，Y0.3组对虾肠道的乳球菌属（Lactococcus）高于Y0组，差异有统计学意义（P＜0.01）；Y0.3组对虾肠道的发光杆菌属（Photobacterium）低于Y0组，差异有统计学意义（P＜0.05）。饲料中添加质量分数0.30%酵母培养物可改善凡纳滨对虾肠道菌群多样性。

关键词：酵母培养物；凡纳滨对虾；肠道菌群；菌群结构；多样性；高通量测序

中图分类号：S963.73; S966.12+9 文献标志码：A 文章编号：1673-9159（2017）04-0021-07 doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2017.04.004

Effect of Yeast Culture on Intestinal Microbiota of Litopenaeus vannamei

HE Yuan-fa1, CHI Shu-yan1, TAN Bei-ping1,2, ZHANG Han-le3, DONG Xiao-hui1,2,

YANG Qi-hui1, LIU Hong-yu1, ZHANG Shuang1

（1. Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China; 2. South China Sea Bio-Resource Exploition and Utilization Collaborative Innovation Center, Guangzhou 510275, China;

3. Beijing Enhalor Biotechnology Co., Ltd, Beijing 100081, China）

Abstract: A yeast culture was added to the base diet at mass fraction 0 (control group) and 0.30%, and two isonitrogenous and isolipid diets, named Y0 and Y0.3 respectively, were prepared. Litopenaeus vannamei with an average initial weight of 1.20±0.01g were fed with the two diets for 56 days. After the test, the intestine from Litopenaeus vannamei was extracted in order to acquire the total DNA. Illumina MiSeq high-throughput sequencing was used to compare composition and the diversity of intestinal flora. Results showed that, though the operational taxonomic units (OTUs) number, Chao, ACE, Shannon and npShannon indexs of Y0.3 group obtained higher average value than that of the Y0

收稿日期：2017-01-19

基金项目：农业部公益性行业科研专项（201003020）；广东省教育厅高等学校高层次人才项目（粤财教[2013] 246） 第一作者：何远法（1992—），男，硕士研究生，研究方向为水产动物营养与饲料。Hefa0628@163.com 通信作者：迟淑艳，教授。chishuyan77@163.com

22 广 东 海 洋 大 学 学 报 第37卷 group, there were no significant difference between Y0.3 group and those fed with Y0 group (P>0.05). With respect to the phylogenetic tree of species classification, the main bacteria phyla, Proteobacteria, found in the intestine of shrimp fed with Y0.3 was similar to the shrimp fed with Y0. The proportion of class γ-Proteobacteria in the intestinal microbiota reached 69.48%. From the dominant family level of bacterial community, the number of Streptococcaceae in Y0.3 group were higher than those in Y0 group which had 4.98%. From the dominant genus level of bacterial community, the proportion of Lactococcus in Y0.3 group were significantly higher than those in Y0 group (P＜0.01). The proportion of Photobacterium in Y0.3 group were also significantly lower than those in Y0 group (P＜0.05). It can be concluded that the addition of dietary 0.30% yeast culture improved diversity of intestinal microbiota for Litopenaeus vannamei.

Key words: yeast culture; Litopenaeus vannamei; intestinal microbiota; community structure; diversity

近年来，凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）养殖过程中病害尤其是细菌性病害频发，严重影响其养殖成活及产品质量。肠道微生物在动物吸收营养素、生长代谢、免疫、抗病等方面发挥着重要作用，其结构组成、多样性与稳定性是影响宿主健康的重要因素[1-2]，因此，维持肠道微生物的动态平衡对虾病害防治有重要意义。

酵母培养物（Yeast culture）是在特定工艺条件下由高性能酵母菌在特定的培养基上经充分厌氧发酵后的微生态制品，主要由酵母细胞外代谢产物、经过发酵后的培养基以及少量无活性酵母细胞构成[1]，除含有B族维生素、矿物质、消化酶、有机酸、氨基酸、寡糖外，还含有一些重要“未知生长因子”[2]，可改善饲料适口性，促进动物生长，调节动物体内微生态平衡，促进肠胃有益菌群的生

[3-6]

长，抑制病菌，提高动物免疫力和抗病力。研究表明，酵母培养物可改善大菱鲆 (Scophthalmus

[5]

maximus) [7]、刺参（Stichopus japonicas Selenka）、

[8]

鲫鱼（Carassius auratus）和罗非鱼（Oreochromis niloticus♀× O. aureus♂）[9]的肠道菌群结构。有关酵母培养物对对虾肠道微生物的影响尚未见报道，笔者在凡纳滨对虾基础饲料中添加酵母培养物，通过Illumina MiSeq测序平台测定凡纳滨对虾肠道细菌16S rDNA 基因序列，探讨酵母培养物干预后对虾肠道菌群结构及丰度的变化，为凡纳滨对虾的健康养殖积累基础资料。

糖蛋白≥15%，蛋白质、核酸、类脂、灰分等其他

[10]

成分约30%。何远法等研究表明，饲料中添加质量分数0.30%酵母培养物对凡纳滨对虾生长性能影响最佳。鉴于此，在凡纳滨对虾基础饲料中添加质量分数0（对照）、0.30%酵母培养物，并根据凡纳

[11]

滨对虾对必需氨基酸的需要量，平衡饲料中的氨基酸含量，配制两种等氮等能饲料，记为Y0、Y0.3。饲料配方组成和营养成分见表1。将鱼粉等原料粉碎后过孔径180 μm，按配方准确称量，微量成分采用逐级扩大法混匀后用双螺杆挤条机加工成1.00、

1.50 mm两种规格的饲料，于60℃下熟化30 min。

所制备饲料风干后，用自封袋密封，于-20℃冰箱中保存备用。

表1 饲料配方及主要营养成分（干物质）质量分数 Table 1 Diet ingredients and nutrition composition (dry basis)

%

原料及营养成分 饲料 Diets

Ingredients and nutrient composition Y0 Y0.3

红鱼粉Red fish meal 25.00 25.00 豆粕 Soybean meal 21.55 21.55 玉米蛋白粉 Corn gluten meal 5.00 5.00

花生粕 Peanut meal 6.00 6.00 虾壳粉 Shrimp shell meal 3.00 3.00

面粉 Wheat flour 26.00 26.00 大豆磷脂 Soybean lecithin 2.00 2.00

鱼油 Fish oil 2.00 2.00 豆油 Soy oil 2.00 2.00

1)

多维预混料 Vitamin premix 0.50 0.50

2)

多矿预混料Mineral premix 2.00 2.00

维生素C Vitamin C 0.03 0.03 氯化胆碱Choline chloride 0.03 0.03 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2·H2O 2.80 2.80 酵母培养物Yeast culture 0.00 0.30

纤维素 Cellulose 1.99 1.69 抗氧化剂 Antioxidant 0.05 0.05 蛋氨酸Methionine 0.05 0.05

1 材料与方法

1.1 实验饲料

酵母培养物，北京英惠尔生物技术有限公司，主要成分质量分数葡聚糖≥50%，甘露寡糖≥1 %，

第4期 何远法等：酵母培养物对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响 23 续表1（Continued） 原料及营养成分

饲料 Diets Ingredients and nutrient composition

Y0 Y0.3 粗蛋白 Crude protein 42.84 42.88

粗脂肪 Crude lipid 8.71 9.03 粗灰分 Ash 8.05 7.92 水 分 Moisture

8.40

8.99

1）每千克维生素预混料含有Contained the following per kg of vitamin premix: 盐酸硫胺素 thiamine hydrochloride 25.50 g，核黄素 riboflavin 25.00 g，盐酸吡哆醇 pyridoxine hydrochloride 50.00 g，VB12 0.10 g，VK 5.00 g，VE 99.00 g，维生素A醋酸酯 retinyl acetate 10.0 g，VD 50 g，烟酸 nicotinic acid 101.00 g，D-泛酸钙 D-calcium-pantothenate 61.00 g，生物素 biotin 25.00 g，叶酸 folic acid 6.25 g，肌醇 inositol 153.06 g，VC 0.30 g，氯化胆碱 choline chloride 0.30 g，抗氧化剂 antioxidant 0.50 g，蛋氨酸 Met 0.50 g，纤维素 cellulose 381.84 g。

2）每千克矿物质预混料含有Contained the following per kg of mineral premix: FeC6H5O7 13.71 g，ZnSO4·7H2O 28.28 g，MgSO4·7H2O 0.12 g，MnSO4·H2O 12.43 g，CuSO4·5H2O 19.84 g，CoCl2·7H2O 4.07 g，KI 0.03 g，KCl 15.32 g，Na2 SeO3 0.02 g，Ca(H2PO4)2·H2O 28.00 g，纤维素 cellulose 878.18 g

。

1.2 实验动物与饲养管理

养殖实验在广东海洋大学东海岛海洋生物研究基地容积为0.3 m3的玻璃钢桶中进行，实验用凡纳滨对虾幼虾购自湛江粤海水产种苗有限公司，幼虾在室外水泥池暂养2周，实验前停饲24 h，将同一遗传背景的初始体质量为（1.20±0.01）g的健康凡纳滨对虾幼虾随机分为2组，饲喂对应的实验饲料。每组设5个重复组，每重复组对虾40尾，养殖期为8周。初始日投喂量为体质量的5%～8%，分别在07:00、11:00、17:00和21:00各投喂1次，投喂1 h后观察对虾的摄食情况，根据摄食、天气等适当调整投喂量，试验初期每2 d换水2/3，养殖结束前10 d每天换水1/2。实验期间水温为28.5～30.0 ℃，盐度为26.5～28.0，连续充氧，溶氧6.8 mg/L以上，pH 7.8～8.2，氨氮低于0.03 mg/L。 1.3 样品的采集和DNA提取

养殖实验结束前停饲24 h，每重复组取凡纳滨对虾5 尾，用体积分数75%的酒精擦拭对虾，无菌条件下剖取完整肠道，5尾虾的肠道合并为一个样本，用无菌生理盐水漂洗后装入无菌防冻管迅速置于液氮中，于- 80 ℃超低温冰箱中保存备用。对虾肠道DNA提取根据DNA Isolation Kit（美国Hipurte PowerSoil®）说明书进行。 1.4 PCR扩增及产物回收

1.4.1 引物设计 采用16S rDNA 基因 V3+V4 区片段通用引物[12]。341F：5′ -CCTAYGGGRBGCA SCAG-3′ ；806 R：5′ -GGACTACNNGGGTATCTA

AT-3′ 。

1.4.2 PCR扩增条件 反应体系：5×FastPfu Buffer 4.0 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 2.0 µL，5 μmol/L上下游引物 0.8 µL，FastPfu Polymerase（美国, GeneAmp® 9700）0.4 µL，模版DNA 10 µL，补ddH2O至20 µL。反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27循环；72 ℃ 10 min。

1.4.3 PCR产物回收纯化和Miseq测序 不同样品的V3+V4区片段PCR产物经10 mg/mL琼脂糖凝胶电泳，成像系统检测后在紫外灯下割取目的条带，称质量，按照凝胶回收试剂盒说明书纯化目的产物，最后用20 mg/mL琼脂糖凝胶电泳检测纯化。扩增产物经定量后，将 DNA 浓度调节至25 ng/μL，所有样品按照 1∶1 混匀后，用Illumina Miseq 测序平台进行建库与测序。 1.5 生物学信息统计

对1.4.3所测序列进行分类单元（Operational taxonomic unit，OTU）划分聚类， 根据OTU总数和每 OTU相对丰度计算样品Alpha多样性指数，包括物种丰富度指数（Chao1、ACE值）、多样性指数（Shannon、Simpson指数）[13]，以反映单个样品物种多样性，其中，Chao1值和ACE值反映样品中微生物的种类（OTU数量），Shannon指数是代表物种多样性的指数，Shannon指数越高，物种越丰富，而Simpson指数取值范围是 [0, 1]，数值越小，则物种越丰富。Shannon稀释曲线是通过n个目标序列（tags）抽样计算Shannon指数的期望值，然后根据一组n值（一般为一组小于总序列数的等差数列）与其相对应的 Shannon期望值作曲线，当曲线趋于平缓或达到平台期时可认为测序深度增加

已不影响物种多样性，测序量趋于饱和。

用 Mothur（v.1.34.0）软件分析Alpha多样性和Shannon稀释

曲线。利用perl脚本挑选所有样本中丰度较高的物种分类单元，用R作图软件分析物种分类树。用SPSS

Statistics 17.0软件进行基本统计学分析及图表制作。用t检验比较组间差异，显著性水平α = 0.05或0.01。

2 结 果

2.1 凡纳滨对虾肠道有效 OTUs 数量统计

从图1可知，Y0.3组对虾肠道OUTs数量较Y0组差异无统计学意义（P＞0.05），但在数值上略高于

Y0组。

24 广 东 海 洋 大 学 学 报 第37卷

2 0001 599.331 6001 429.001 200800 400 0 Y0Y0.3组别

图1 凡纳滨对虾肠道OTUs数量

Fig. 1

Number of OTUs in Litopenaeus vannamei intestine

2.2 多样性分析

表2为凡纳滨对虾肠道菌群的Alpha多样性。Y0.3组对虾肠道Chao1、ACE、Shannon和npShannon指数与Y0组差异无统计学意义（P＞0.05）。Y0.3组Shannon

稀释曲线明显高于Y0组（图2）。

表2 凡纳滨对虾肠道Alpha多样性

Table 2 Alpha diversity of Litopenaeus vannamei intestine

指数Indexes 多样性Diversity Y0组 Y0.3组 P 物种丰富度指数Chao1 2 297.93±68.38 2 559.72±375.75 0.53 ACE指数ACE 2 428.83±180.55 2 709.99±146.49 0.50 Shannon指数 3.14±0.25 3.39±0.14 0.44 npShannon指数 3.19±0.25 3.45±0.14 0.43 Simpson指数 0.17±0.06 0.15±0.01 0.70 注: P＜0.05, 差异显著；P＜0.01, 差异极显著；n = 5。

Notes: P＜0.05 means significant difference, and P＜0.01 means extremely significant difference;

n = 5.

xedni nonnahS数指农香

图2 凡纳滨对虾肠道OTUs Shannon稀释曲线

Fig.2 OUTs Shannon rarefaction curve of Litopenaeus

vannamei intestine

2.3 凡纳滨对虾肠道优势菌群分析

表3可见，Y0组对虾肠道的优势菌群主要为

盐单胞菌属（Halomonas）、发光杆菌属（Photobacterium）、弧菌属（Vibrio）及未分类（Unclassified）属，分别占肠道菌群比例为24.58%、24.11%、21.18%、21.21%；其次是乳球菌属（Lactococcus）和希瓦氏菌属（Shewanella）。Y0.3组对虾肠道优势菌主要为盐单胞菌属、弧菌属以及未分类属，分别占整个肠道菌群比例为32.32%、18.44%以及29.19 %；其次是乳球菌属和希瓦氏菌属，分别占6.78%和4.42%。Y0.3组对虾肠道乳球菌属高于Y0组，差异有统计学意义（P＜0.01）；Y0.3组对虾肠道发光杆菌属低于Y0组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 凡纳滨对虾肠道物种分类树

由图3可见，从门分类水平看，对虾肠道主要的菌群数为变形菌门（Proteobacteria），所占比例为71.644%，其中，γ-变形菌纲（Gamma-proteobacteria）所占比例达69.481%；从属分类水平看，Y0.3组乳球菌属、

弧菌属以及盐单胞菌属数量也高于Y0组。

表3 凡纳滨对虾肠道菌群优势属结构

Table 3 Dominant bacterial genus of intestinal microflora

of Litopenaeus vannamei

属Genus

比例Percentage / % Y0组

Y0.3组

P

盐单胞菌属Halomonas

24.58±4.18 32.32±5.99 0.14 弧菌属Vibrio 18.44±3.63 21.18±2.31 0.33 发光杆菌属Photobacterium 24.11±4.94 1.27 ± 0.25 0.02

乳球菌属Lactococcus 5.17 ± 0.33 6.78 ± 0.21 0.00 希瓦氏菌属Shewanella

2.71 ± 0.58 4.42 ±0.20 0.03 Leadbetterella 0.78 ± 0.11 0.77 ± 0.03 0.95 其他Others 3.01 ± 0.32 2.35 ± 0.25 0.05 未分类Unclassified

21.21±3.46 28.98±3.52 0.05

注: P＜0.05，差异显著；P＜0.01，差异极显著; n = 5。

Notes: P＜0.05 means significant difference, and P＜0.01 means extremely significant difference; n = 5.

3 讨 论

肠道黏膜是病原菌侵袭的第一道屏障，肠道细菌有利于维护肠道黏膜体系的屏障作用[14]。肠道有益菌属可对宿主完成免疫应答平衡、营养吸收、内环境稳定等有益功能的调节[15-17]，但有害菌会使黏膜层渗透性增加，让细菌和食物中大分子穿过黏膜屏障[18]。因此，建立良好的肠道微生态系统有助于提高对虾生长性能[19]。研究认为，对虾肠道菌群结构的动态平衡受自身生理状态、饲料组成、外界应

激和水体环境等诸多因素影响

[20-23]

。本研究通过评 第4期 何远法等：酵母培养物对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响 25

图3 凡纳滨对虾肠道菌群优势OTUs序列系统分类树

Fig. 3 Phylogenetic tree of dominant OTUs sequences of intestinal microbiota of Litopenaeus vannamei.

估摄食含酵母培养物饲料的凡纳滨对虾肠道菌群组成，发现酵母培养物对肠道菌群结构产生一定影响。从门分类水平来看，对虾肠道主要的菌群为变形菌门(Proteobacteria)，且γ-变形菌纲 (Gammaproteobacte ria)丰度较高。郑婷婷[24]认为，对虾肠道内的优势群落均是γ-变形菌纲和α-变形菌纲，占肠道菌群的69% ~ 84%，与本研究结果一致。

饲料中添加酵母培养物可改善动物肠道菌群结构。张琴[5]研究发现，饲料中添加酵母培养物可显

促进生长，著增加刺参肠道总菌数，降低肠道弧菌数，

显著提高刺参感染灿烂弧菌（Vibro splendidus）后的抗病力。赵贵萍[7]发现，以豆粕替代鱼粉后，大菱鲆肠道菌群结构极为单一，且弧菌属（Vibro）占绝对优势，添加酵母培养物后，有益菌芽孢杆菌（Bacillus）为优势菌。解洛香等[25]也认为，酵母培养物可显著促进双歧杆菌（Bifidobacterium）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和植物乳杆菌（L. plantarum）体外增殖，并缩短延滞期，延长对数期，大幅提高生物量。本研究表明，在饲料中添加质量分数0.3%酵母培养物后，凡纳滨对虾肠道同属于弧菌科的发光杆菌属和弧菌属，尤其是发光杆菌属所占比例下降，乳球菌属比例上升，表明添加酵母培养物抑制了对虾肠道弧菌的生长，促进了乳球菌属的生长。有报道称，乳球菌属由鱼乳球菌（Lactococcus piscium）和乳酸乳球菌（L. lactis）构成，这些乳酸菌对水生和陆生动物均未见致病性，其中乳酸乳球菌可用作水产动物益生菌[26]。乳

球菌在对虾肠道中有维持菌群平衡、抵御病原菌入侵、提高抗病力等重要作用[27-28]。因此，本研究酵母培养物的添加使凡纳滨对虾的肠道菌群结构得以改善。肠道菌群结构的优化可促进胃肠道营养物

提高免疫力和抗病力，进而促进生质的消化和吸收，[32]

长[2, 29-31]。Qiao等指出，对虾肠道菌群应作为一项营养指标来反映水生动物的生长和生理情况。饲料中添加酵母培养物可提高草鱼（Ctenopharyngodon idellus）[29]、牙鲆（Paralichthys olivaceus)[31]、异育银鲫(Carassiusauratus gibelio)[33]、团头鲂（Megalobrama amblephala）[34]、凡纳滨对虾[10]等的生长性能，肠道菌群结构的改善可认为是促生长的原因之一。

本研究中，添加酵母培养物可提高对虾肠道乳球菌数量，可能与酵母培养物中的甘露寡糖有关。甘露寡糖作为一种益生菌的增殖因子，主要通过减少致病菌的黏附，进而改善动物肠道微生物区系，维持肠道微生态平衡，增强有益菌竞争优势，阻断其致病性产生，提高对虾的非特异性免疫力[35, 36]，虽然酵母培养物甘露寡糖含量不高，但动物在摄食含有较低水平的甘露寡糖日粮时，其免疫机能即可得以改善[37]。此外，

有机酸可有效抑制消化道内有害细菌增殖，增加乳酸菌等益生菌的生长代谢[38]，因此，本研究乳球菌的增加还可能与酵母培养物富含有机酸有关。

综上所述，本实验条件下，饲料中添加质量分数0.30%酵母培养物使肠道乳球菌增加，改善了凡纳滨对虾肠道菌群结构。对虾肠道乳球菌等可作为

26 广 东 海 洋 大 学 学 报 第37卷 今后开发的潜在益生菌，但其可靠性受饲料组成、养殖模式、水环境等条件影响，具体的促生长机制尚有待更多的研究验证。

参 考 文 献

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（责任编辑：刘庆颖）