ChIP protocol

一、细胞固定：

1. 准备一盘100mm培养皿培养的细胞，生长80－90％满。（此细胞量足够做一次ChiP，本次以293T细胞为例）除去培养基。

2. 加入新鲜配制的1％甲醛PBS溶液5mL室温固定10min（不同细胞可能会用不同的固定条件，如果下一步超声无法将DNA超到小于1000bp，应减少甲醛浓度或者降低固定的温度，如4℃固定），轻柔晃动，除去甲醛溶液，加入新鲜配置的 1×甘氨酸（0.125M）PBS溶液5mL，室温5min。

3. 除去甘氨酸溶液，用PBS洗一次，将细胞收集到离心管中（冰上操作），4℃，4000r/min离心细胞5min（细胞固定后可能会不太容易离心下来，如有必要可加大离心转速）除掉PBS溶液。

4. 加入1mL含有蛋白酶抑制剂（cocktail 50x）的细胞裂解液，吹打均匀，放在冰上20min，每5min晃动一次。

5. 4℃，2000r离心细胞5min，除去上清，加入500mL含有蛋白酶抑制剂（cocktail 50x）的核裂解液。（不同细胞可能会加入不同量的核裂解液） 二、超声

1. 第一次做超声应摸一下超声条件（所有超声应在冰上进行）：将上述核裂解液放入超声仪中，超声仪条件为：30s on，30s off。取4min、6min、8min、10min、12/14/16min超声产物各20ul，加入1ul蛋白酶k（20mg/mL），65℃孵育至少6h，加入1ul RNase A，37℃ 30min。电泳检测染色质超声片段的大小应在200－1000bp之间为最佳。

2. 超声结束后用4℃，12500g离心10min，取上清，用nanodrop测定超声液浓度。（此浓度大小与细胞量和加入核裂解液的量有关），此浓度应大于1ug/ul。（超声液可在－80℃保存） 三、免疫沉淀

每次做免疫沉淀至少应该有阴性和阳性对照，即样品对照和IgG的对照。 1. 在1.5mL离心管中加入200ul超声液，400ul ChIP Dilution Buffer，12ul Cocktail，20ul磁珠（加入之前充分混匀），5ug抗体，4℃慢摇过夜（用旋转仪最慢速旋转）。

2. 依次用低盐，高盐，TE缓冲液500mL去洗磁珠，各2次。（整个过程在冰上进行，用不同的缓冲液洗之间应该换管子，洗涤过程中用真空泵彻底吸干管壁上残留的液体。注意最后一次用TE洗涤时不能用真空泵，应用枪吸走上清，否则会将磁珠一起吸走） 四、解交联

1. 将ChiP elution buffer室温孵育让其中SDS完全溶解，在上述磁珠中加入100ul chip elution buffer，1ul蛋白酶k（20mg/mL），充分混匀，65℃过夜。

2. 将管子放入磁力架中，将上清转移至另一EP管中，酚氯仿抽提，乙醇沉淀（多少体积无水乙醇沉淀，写清楚），最后用50ul水溶解，测浓度，一般不会大于20ng/ul，否则说明ChIP的非特异结合太多。 3. 设计合适的PCR引物进行检测。

所用试剂：

Low Salt Wash Buffer（低盐洗脱液）:

0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl. High Salt Wash Buffer（高盐洗脱液）:

0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl. ChIP Dilution Buffer:

0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl. TE buffer:

20mM Tris–HCl, 1mM EDTA, pH 8 Cell lysis buffer（细胞裂解液）：

10mM HEPES, pH7.9, 0.5% IGEPAL-CA630,1.5mM MgCl2, 10mM KCl Nuclear lysis buffer（核裂解液）： 50mM Tris, pH 8.1, 10mM EDTA, 0.3% SDS 蛋白酶抑制剂 cocktail PBS溶液 特异蛋白的抗体