实验报告计划2荧光分光光度法测定维生素B2含量

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实验项目：荧光分光光度法测定维生素 B2 的含量

【实验题目】

荧光分光光度法测定维生素

【实验目的】

1、掌握标准曲线法定量解析维生素 【实验原理】

维生素 B2( 又叫核黄素， VB 2 )是橘黄色无臭的针状结晶。其结构式为：

由于分子中有三个芳香环，拥有平面刚性结构，因此

它能够发射荧光。维生素 B2 易溶于水而不溶于乙醚等有 机溶剂，在中性或酸性溶液中牢固，光照易分解，对热稳 定。

维生素 B 2 溶液在 430~440nm 蓝光的照射下，发出绿 色荧光， 荧光峰在 535nm 周边。维生素 B2 在 pH＝ 6~7 的 溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素 浓度呈线性关系，因此能够用荧光光谱法测维生素 转变成另一物质——光黄素， 内，且在避光条件下进行。

在稀溶液中，荧光强度

这是荧光光语法定量解析的依据。 【主要仪器与试剂】

杯；胶头滴管 【实验内容及步骤】

1、系列标准溶液的制备

取维生素 B 2 标准溶液μ g/mL)1.00mL 、2.00mL 、3.00mL 、4.00mL 、5.00mL 分别置于 50mL 的容量瓶中， 各加入去离子水稀释至刻度，摇匀。标记为①②③④⑤的一系列维生 素 B 2 标准溶液。待测。 2、待测液制备

取 5.00mL 未知液 4 置于 50mL 容量瓶中，加入去离子水稀释至刻度，摇匀。待测。

3、激发光谱和荧光发射光谱的绘制

设置λ em＝ 540nm 为发射波长，在 250~500nm 范围内扫描标准溶液③，记录荧光发射

强度和激发波长的关系曲线，便获取激发光谱。从激发光谱图上找出其最大激发波长λ ex。在此激发波长下，在 400~600nm 范围内扫描，记录发射强度与发射波长间的函数关系，便 获取荧光发射光谱。从荧光发射光谱上找出其最大荧光发射波长λ 4、标准溶液及样品的荧光测定

将激发波长固定在最大激发波长λ

ex，荧光发射波长固定在最大荧光发射波长处λ

em。

B2 的含量

B2 的基根源理。

2、认识荧光分光光度计的基根源理、结构及性能，掌握其基本操作。

B2 溶液 B 2 的

含量。维生素 B 2 在碱性溶液中经光辉照射会发生分解而 物质，其荧光比维生素 B 2 的荧光强得多，故测维生素

光黄素也是一个能发荧光的

B2 的荧光时溶液要控制在酸性范围

F 与物质的浓度 c 有以下关系： F ＝Ф I 0ε bc

F=Kc

当实验条件一准时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：

主要仪器： F-2500 HiTachi 荧光分光光度计；

1cm 石英皿； 50mL 容量瓶； 5mL 移液管；烧

试剂：维生素 B 2 标准溶液：未知液 4

em。

扫描蒸馏水和上述 5 个标准液的荧光发射强度。 数据记录于表 1 中。以溶液的荧光发射强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，制作标准曲线。

在同样条件下测定未知溶液的荧光强度，并由标准曲线确定未知试样中维生素

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B2 的浓

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度，计算待测样品溶液中的维生素

B2 的含量。

【数据记录与结果解析】

①、维生素 B 2 激发光谱图：

最大激发波长λ ex=373nm

②、维生素 B 2 荧光发射光谱图：

最大荧光发射波长处λ em=524nm

③表 1：标准溶液及待测溶液的浓度和荧光强度数据记录：

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维生素 B2 溶液浓度 /（μ g/mL ）

相对荧光强度

④、系列标准溶液浓度与荧光发射强度的标准曲线图：

由计算机办理得标准曲线方程为

相关系数 r=

则待测溶液的浓度

μ g/mL

【问题谈论】

1、试讲解荧光光度法较吸取光度法矫捷度高的原因？

答：原因是由于现代电子技术拥有检测十分稍微光信号的能力，

而且荧光强度与激发光强度

成正比，提高激发光强度也能够增大荧光强度，使测定的矫捷度提高；而吸取光度法测定的是吸光度，无论是增大入射光强度，还是提高检测器的矫捷度，都会使透射光信号与入射光信号以同样的比率增大，吸光度值不会改变，因此矫捷度不能够提高。

2、维生素 B 2 在 pH=6~7 时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？

答：由于维生素 B 2 在碱性溶液中经光辉照射，会发生分解而转变成光黄素，后者的荧光比

维生素 B 2 的荧光强的多。因此，测量时溶液要控制在酸性范围内进行。

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