(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 114544850 A(43)申请公布日 2022.05.27
(21)申请号 202210160736.X(22)申请日 2022.02.22
(71)申请人 苏州正济医药研究有限公司
地址 215000 江苏省苏州市高新区浒青路
122号(72)发明人 梁燕娜 邓瑜
(74)专利代理机构 南京华讯知识产权代理事务
所(普通合伙) 32413
专利代理师 郭黄英 王文岩(51)Int.Cl.
G01N 30/89(2006.01)
权利要求书2页 说明书8页 附图2页
(54)发明名称
一种达格列净中间体及杂质的检测方法(57)摘要
本发明提供了一种达格列净中间体及杂质的检测方法，该方法采用液相色谱法对达格列净中间体进行检测分析，采用苯己基键合硅胶为填充剂的反相色谱柱，采用水溶液为流动相A，低级烷基醇、乙腈、四氢呋喃中的一种或两种以上的混合溶液为流动相B，进行梯度洗脱。使用该检测方法能够有效分离出各杂质，且该检测方法准确度高、重复性好、灵敏度高、专属性好、操作简单且高效。
CN 114544850 ACN 114544850 A
权 利 要 求 书
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1.一种达格列净中间体及杂质的检测方法，其特征在于，采用液相色谱法对达格列净中间体进行检测分析，采用苯己基键合硅胶为填充剂的反相色谱柱，采用水溶液为流动相A，低级烷基醇、乙腈、四氢呋喃中的一种或两种以上的混合溶液为流动相B，进行梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述达格列净中间体为5‑溴‑2‑氯‑4′‑乙氧基二苯甲酮：
所述杂质为杂质1：
杂
质2：杂质3：
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述水溶液为三氟乙酸水溶液或纯化水；所述混合溶液为甲醇、乙腈、四氢呋喃中的一种或两种以上的混合溶液。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述水溶液为纯化水，所述有机溶剂为甲醇：乙腈＝1：9(V/V)。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，柱温为20℃～40℃，检测波长为220nm～300nm。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，进样量为5μl～50μl，流动相流速为0.5ml/min～1.5ml/min。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：洗脱时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0min27‑3763‑7328min27‑3763‑73
。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：洗脱时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0min326828min3268
。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：洗脱时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0min326828min326838min59543min59543.1min326855min3268柱温为25℃，检测波长为220nm，进样量为10μl，流动相流速为0.8ml/min。10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括供试品溶液配
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权 利 要 求 书
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制：取达格列净中间体供试品，用稀释液溶解并稀释，作为供试品溶液，其中所述稀释液为甲醇。
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说 明 书
一种达格列净中间体及杂质的检测方法
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技术领域
[0001]本发明涉及药物检测分析技术领域，具体涉及一种达格列净中间体及杂质的检测方法。
背景技术
[0002]达格列净，化学名为(2S，3R，4R，5S，6R)‑2‑[4‑氯‑3‑(4‑乙氧基苄基)苯基]‑6‑(羟基甲基)四氢‑2H‑吡喃‑3，4，5‑三醇，是由美国百时美施贵宝公司和阿斯利康公司联合开发的钠依赖性葡萄糖转运蛋白2(Sodium‑glucose Linked Transporter 2，SGLT2)抑制剂。其
461432‑26‑8，分子式为C21H25ClO6，分子量为：408.88，化学结构如下：CAS号为：
[0003]
[0004]
5‑溴‑2‑氯‑4′‑乙氧基二苯甲酮是达格列净合成过程中的关键中间体，其CAS号
为：461432‑22‑4，分子式为C15H12BrClO2，分子量为：337.97，结构式为：
[0005]
在达格列净合成的过程中，除形成上述中间体外，还会产生以下杂质：杂质1：
杂质2：
杂质3：
上述中间体及杂质的分析检测对达格列净的合成控制和收率提高有着重要的作用，同时也直接影响着达格列净终产品的质量。然而，目前没有相关文献对上述达格列净中间体及杂质的分析检测方法进行公开，且上述中间体与杂质的结构相近，所以建立一种操作简单、稳定有效的、完善的分析检测方法对达格列净中间体及杂质进行分析检测是非常有必要的。
发明内容
[0007]本发明的目的是提供一种达格列净中间体及杂质的检测方法，使用该方法能够有效分离出各杂质，且该检测方法准确度高、重复性好、灵敏度高、专属性好、操作简单且高效。
[0008]本发明提供如下技术方案：
[0009]一种达格列净中间体及杂质的检测方法，采用液相色谱法对达格列净中间体进行检测分析，采用苯己基键合硅胶为填充剂的反相色谱柱，采用水溶液为流动相A，低级烷基
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[0006]
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说 明 书
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醇、乙腈、四氢呋喃中的一种或两种以上的混合溶液为流动相B，进行梯度洗脱。[0010]在一些实施方案中，达格列净中间体为5‑溴‑2‑氯‑4′‑乙氧基二苯甲酮：
杂质为杂质1：
杂质2：
杂质3：
在一些实施方案中，水溶液为三氟乙酸水溶液或纯化水；混合溶液为甲醇、乙腈、四氢呋喃中的一种或两种以上的混合溶液。[0012]在一些优选实施方案中，水溶液为纯化水，有机溶剂为甲醇：乙腈＝1：9(V/V)。[0013]在一些实施方案中，反相色谱柱为：填料粒径3.0μm～5.0μm，色谱柱长100mm～250mm，色谱柱内径2.0mm～4.6mm。在一些优选实施方案中，填料粒径3.5μm，色谱柱长250mm，色谱柱内径4.6mm。[0014]在一些实施方案中，柱温为20℃～40℃，检测波长为220nm～300nm。在一些优选实施方案中，柱温为25℃，检测波长为220nm。[0015]在一些实施方案中，进样量为5μl～50μl，流速为0.5ml/min～1.5ml/min。在一些优选实施方案中，进样量为10μl，流速为0.8ml/min。[0016]在一些实施方案中，梯度洗脱的程序为：
[0017][0011]
洗脱时间(min)
0min28min流动相A(％)27‑3727‑37流动相B(％)63‑7363‑73
。
[0018][0019]
在一些实施方案中，梯度洗脱的程序为：洗脱时间(min)0min28min
流动相A(％)3232
流动相B(％)6868
。
[0020][0021]
在一些实施方案中，梯度洗脱的程序为：
洗脱时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0min326828min326838min59543min59543.1min326855min3268柱温为25℃，检测波长为220nm，进样量为10μl，流动相流速为0.8ml/min。在一些实施方案中，检测方法还包括供试品溶液配制：取达格列净中间体供试品，
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[0022][0023]
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用稀释液溶解并稀释，作为供试品溶液，其中稀释液为甲醇。在一些其他实施方案中，稀释液可以是任何其他适合的溶剂。在一些优选实施方案中，每1ml达格列净中间体供试品溶液中，达格列净中间体含量为0.3mg。[0024]在一些实施方案中，检测方法还包括系统适用性溶液配制：取达格列净中间体对照品、杂质1、杂质2和杂质3对照品适量，精密称定，用稀释液溶解并稀释，制成系统适用性溶液。在一些优选实施方案中，每1ml系统适用性溶液中，达格列净中间体(5‑溴‑2‑氯‑4′‑乙氧基二苯甲酮)含量为约0.3mg，杂质1、杂质2和杂质3含量分别为约0.45μg、0.45μg和0.45μg。
[0025]在一些实施方案中，色谱柱为SVEA PhHex色谱柱，4.6×250mm，填料粒径为3.5μm，进样量为10μl。[0026]有益效果：
[0027]本发明提供的检测方法，采用苯己基键合硅胶为填充剂的反相色谱柱，可以对达格列净中间体及杂质进行有效的分离与检测，专属性强，分离度好，灵敏度高，便于达格列净中间体的控制和杂质研究，进而有利于成品达格列净的质量控制。附图说明
[0028]图1为本发明对比例1的HPLC色谱图；[0029]图2为本发明对比例2的HPLC色谱图；[0030]图3为本发明对比例3的HPLC色谱图；[0031]图4为本发明实施例1的HPLC色谱图。
具体实施方式
[0032]下面将对本发明实施例中的技术方案进行详细描述，但不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。除非另有说明，否则以下实施例中所用的试剂、材料及仪器均可通过常规条件和方法，或者常规商业手段获得。[0033]对比例1[0034]仪器：安捷伦1260[0035]色谱柱：Titank Phenyl‑Hexyl(4.6×250mm，3.0μm)[0036]流动相：A相：0.05％三氟乙酸水溶液[0037]B相：三氟乙酸：甲醇：乙腈＝0.05：20：80(V/V/V)[0038]检测波长：220nm[0039]流速：1.0ml/min[0040]柱温：25℃[0041]进样量：10μl[0042]洗脱程序：[0043]表1：对比例1梯度洗脱程序
[0044]
洗脱时间(min)
020A相(％)8530
6
B相(％)1570
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25307035109040109045595468515558515
[0045]稀释液(空白溶液)：甲醇。[0046]杂质定位溶液配制：分别取杂质1、杂质2和杂质3对照品适量，精密称定，分别加甲醇溶解并稀释，制成每1ml中杂质1、杂质2和杂质3的含量分别为约0.45μg、0.45μg和0.45μg的溶液，分别作为杂质1定位溶液、杂质2定位溶液和杂质3定位溶液。[0047]系统适用性溶液配制：取达格列净中间体(5‑溴‑2‑氯‑4′‑乙氧基二苯甲酮)对照品、杂质1、杂质2和杂质3对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释，制成每1ml中达格列净中间体含量为约0.45μg，杂质1、杂质2和杂质3含量分别为约0.45μg、0.45μg和0.45μg的溶液，作为系统适用性溶液。
[0048]在上述配制过程中使用的甲醇为稀释液，甲醇视情况可以替换为其他任何适合的溶剂。
[0049]样品测定：分别量取空白溶液、杂质1定位溶液、杂质2定位溶液、杂质3定位溶液及系统适用性溶液各10μl，分别注入液相色谱柱，记录色谱图。[0050]检测结果：结果参见附图1，故可知在本对比例中RT＝23.693min为杂质1的峰，RT＝23.970min为杂质2的峰，RT＝24.280min为达格列净中间体的峰，RT＝24.683min为杂质3的峰，杂质1与杂质2之间分离度为1.23，杂质2与达格列净中间体之间分离度为1.33，不符合分离度不得小于1.5的要求。[0051]对比例2[0052]仪器：Ultimate 3000[0053]色谱柱：SVEA PhHex(4.6×250mm，3.5μm)(苯己基键合硅胶)[0054]流动相：A相：水[0055]B相：80(V/V)甲醇：乙腈＝20：[0056]检测波长：220nm[0057]流速：1.0ml/min[0058]柱温：25℃[0059]进样量：10μl[0060]洗脱程序：[0061]表2：对比例2梯度洗脱程序
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[0063]
稀释液(空白溶液)：甲醇。
[0065]杂质定位溶液配制：分别取杂质1、杂质2和杂质3对照品适量，精密称定，分别加甲醇溶解并稀释，制成每1ml中杂质1、杂质2和杂质3的含量分别为约0.45μg、0.45μg和0.45μg的溶液，分别作为杂质1定位溶液、杂质2定位溶液和杂质3定位溶液。[0066]系统适用性溶液配制：取达格列净中间体对照品、杂质1、杂质2和杂质3对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释，制成每1ml中达格列净中间体含量为约0.3mg，杂质1、杂质2和杂质3含量分别为约0.45μg、0.45μg和0.45μg的溶液，作为系统适用性溶液。[0067]在上述配制过程中使用的甲醇为稀释液，甲醇视情况可以替换为其他任何适合的溶剂。
[0068]样品测定：分别量取空白溶液、杂质1定位溶液、杂质2定位溶液、杂质3定位溶液及
μl，分别注入液相色谱柱，记录色谱图。系统适用性溶液各10
[0069]检测结果：结果参见附图2，故可知在本对比例中RT＝31.127min为杂质1的峰，RT＝31.363min为杂质2的峰，RT＝32.047min为达格列净中间体的峰，RT＝32.537min为杂质3的峰，达格列净中间体与杂质3分离度为0.15，不符合分离度不得小于1.5的要求。[0070]对比例3
[0071]采用与对比例2中一致的仪器、试剂、方法、洗脱程序，仅改变流动相为：A相：水；B相：甲醇：乙腈＝30：70(V/V)[0072]稀释液、杂质定位溶液、系统适用性溶液配制与对比例2中的一致，样品测定的方法也与对比例2一致。[0073]检测结果：结果参见附图3，其中，故可知在本对比例中RT＝16.108min为杂质1的峰，RT＝16.700min为杂质2的峰，RT＝17.656min为达格列净中间体的峰，RT＝18.792min为杂质3的峰，杂质1、杂质2、达格列净中间体、杂质3之间的分离度依次为1.62、2.50、2.77，符合分离度不得小于1.5的要求，杂质1与相邻未知杂质间分离度为1.32，不符合分离度不得小于1.5的要求。[0074]实施例1[0075]仪器：Ultimate 3000[0076]色谱柱：3.5μm)(苯己基键合硅胶)SVEA PhHex(4.6×250mm，
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CN 114544850 A[0077][0078][0079][0080][0081][0082][0083][0084][0085]
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流动相：A相：水B相：甲醇：乙腈＝10：90(V/V)检测波长：220nm流速：0.8ml/min柱温：25℃进样量：10μl洗脱程序：表3：实施例1梯度洗脱程序
洗脱时间(min)流动相A(％)流动相B(％)03268283268385954359543.13268553268
[0086]稀释液、杂质定位溶液、系统适用性溶液配制与对比例2中的一致，样品测定的方法也与对比例2一致。[0087]检测结果：结果参见附图4，其中，故可知在本实施例中RT＝18.418min为杂质1的峰，RT＝19.093min为杂质2的峰，RT＝20.282min为达格列净中间体的峰，RT＝21.651min为杂质3的峰，杂质1、杂质2、达格列净中间体、杂质3之间的分离度依次为1.62、2.72、2.79，杂质1与相邻未知杂质间分离度为1.65，均符合分离度不得小于1.5的要求。[0088]实施例1中的方法学验证结果如下表4：[0089]表4：验证结果与结论
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结论：由表4的数据可知，本发明提供的检测方法专属性强：空白溶液对检测无干
扰；杂质1、杂质2、达格列净中间体、杂质3之间的最小分离度大于1.5；线性关系良好，达格列净中间体在线性范围0.0405μg/ml～0.405μg/ml的相关系数r为0.9997，Y轴截距偏差0.41％，低于2％；杂质1在线性范围0.0445μg/ml～0.40278μg/ml的相关系数r为0.9997；杂质2在线性范围0.0445μg/ml～0.40278μg/ml的相关系数r为0.9996；杂质3在线性范围0.0416μg/ml～0.41580μg/ml的相关系数r为0.9996；灵敏度高，对于杂质1的检测限低至0.0121μg/ml，定量限低至0.0403μg/ml，对于杂质2的检测限低至0.0134μg/ml，定量限低至0.0445μg/ml，对于杂质3的检测限低至0.0125μg/ml，定量限低至0.0416μg/ml；重复性好，杂质1的回收率的RSD为0.89％，保留时间的RSD为0.02％，杂质2的回收率的RSD为1.3％，保留时间的RSD为0.03％，杂质3的回收率的RSD为0.39％，保留时间的RSD为0.01％，回收率的RSD均远低于5.0％，保留时间的RSD均远低于1.0％；准确度高，限度浓度80％、100％、120％加样回收溶液中各杂质的加标回收率在85％～110％之间；在对色谱条件中的流动相起始梯度、流速、柱温、检测波长进行微小改变时，系统适应性溶液中，按照杂质1、杂质2、达格列净中间体、杂质3的顺序依次出峰，杂质间的分离度≥1.5，符合耐用性要求，且变化并不太大，表明该方法有良好的溶液稳定性和耐用性，可以实现对达格列净中间体及杂质的检测。[0094]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节；而且在
能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论不背离本发明的精神或基本特征的情况下，
从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
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