牛白血病前病毒Taqman荧光PCR检测方法的建立

・　１２　・　《上海畜牧兽医通讯》２０１４年第１期　牛白血病前病毒Ｔａｑｍａｎ荧光ＰＣＲ检测方法的建立　李凯航鞠厚斌杨显超　宁　昆　王　建　（上海市动物疫病预防控制中心　上海　２０１１０３）　【摘要】设计并合成荧光引物，建立了Ｔａｑｍａｎ荧光ＰＣＲ体系，可快速检测全血样品中的牛白　血病前病毒ＤＮＡ。所建立的荧光ＰＣＲ体系可特异检测牛白血病病毒核酸，而对牛病毒性腹泻一　粘膜病毒（ＢＶＤＶ）、牛传染性鼻气管炎病毒（ＩＢＲＶ）以及羊胎肾细胞（ＦＬＫ）、牛布鲁氏菌扩增均呈　阴性反应，对ｐＢＳＴ—ｐｏｌ重组质粒的检测敏感性可达０．３２拷贝。重复性实验的Ｃｔ值变异系数介于　０．６７　～１．１６　之间，稳定性实验的Ｃｔ值变异系数为３．１４　。采用建立的Ｔａｑｍａｎ荧光ＰＣＲ体　系和ＯＩＥ推荐的套式ＰＣＲ对９４份临床样品进行检测，两者定性符合率达到９７．８７　。　关键词：牛白血病前病毒；Ｔａｑｍａｎ荧光ＰＣＲ；引物　地方流行性牛白血病是由牛白血病病毒　（ＢＬＶ）引起的牛的一种慢性肿瘤性疾病。其特征　为淋巴样细胞恶性增生，进行性恶病质和发病后的　高死亡率　。此病在１９世纪末被发现，但到１９６９　年才由美国的Ｍｉｌｌｅｒ从病牛外周血液淋巴细胞中　分离到　。目前此病遍及全世界，我国７Ｏ年代在安　徽发现首例后，继而在各省市发生　。近年，我国牛　群该病血清阳性率已从４％升高至３Ｏ　～１．４　阳性对照质粒的构建　ＢＬＶ的ｐｏｌ基因由ＰＣＲ扩增获得，通过ＴＡ克　隆得到ｐＢＳＴ—ｐｏｌ重组质粒并经序列证实，确定为　该基因阳性质粒后，用紫外分光光度计Ａ２６Ｏ／Ａ２８Ｏ　吸光值测定质粒浓度，一３０℃保存备用。ｐＢＳＴ质　粒购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司，胶回收试剂盒购自ＴＡＫＡ—　ＲＡ。　１．５　荧光ＰＣＲ反应体系的建立　荧光ＰＣＲ试验在ＡＢＩ７５００荧光ＰＣＲ仪上进　行，对引物浓度、ｄＮＴＰ浓度、探针浓度和热启动　Ｔａｑ酶浓度等反应条件进行了优化。ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ　酶等均购自ＴＡＫＡＲＡ公司，引物和探针由ｉｎｖｉｔｒｏ—　ｇｅｎ公司合成。　６０　“　。　目前对于牛群内ＢＬＶ感染的普查通常基于血　清学试验如ＥＬＩＳＡ，可以很好地估计ＢＬＶ在牛群　内的流行情况。但样品仅依靠血清学检测并不　够，Ｍａｒｔｉｎ等　报道同样一批可疑样品，间接　ＥＬＩＳＡ的检出率为１０　，而依靠ＰＣＲ方法的检出　率可达到１７　。对于大量样品ＢＬＶ的检测，有必　要建立特异性强、灵敏度高的ＰＣＲ检测方法，这有　利于针对牛白血病流行病学感染情况彻底进行　调查。　１．６特异性、敏感性和重复性试验　将牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病　毒、牛布鲁氏菌、羊胎肾细胞（ＦＬＫ）作为４个对照样　本提取核酸，各取２　作为模板进行ＰＣＲ扩增，同　时设蒸馏水为阴性对照组。　将计数后的ｐＢＳＴ—ｐｏｌ质粒进行１Ｏ倍梯度稀　释，阳性质粒（３．２×１０　ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ）按１：１０　～１：　１０　进行相同的３组稀释，从每个梯度中各取３　ｐ．Ｌ　模板进行荧光ＰＣＲ检测。　以相同稀释度的阳性质粒作为模板，并以１０倍　梯度稀释成３个不同梯度的模板（１：１０　，１：１０　，　１：１０。），重复１０次反应。　１材料和方法　１．１　病毒与临床样品　牛病毒性腹泻一粘膜病毒（ＢＶＤＶ，种毒　ＡＶ６９）、牛传染性鼻气管炎病毒（ＩＢＲＶ，种毒　ＡＶ２０）、羊胎肾细胞（ＦＩ　Ｋ）购自中国兽医药品监察　所，牛布鲁氏菌样本为牛布病ＩＩ型活疫苗，血清学　阳性牛的ＥＤＴＡ抗凝血样品由本中心采集保存。　１．２核酸提取　样品的核酸提取采用ＡＸＹＧＥＮ公司ＡｘｙＰｒｅｐ　体液病毒ＤＮＡ／ＲＮＡ小量试剂盒（Ｃａｔ　Ｎｏ．　５１３０４），一２０℃保存备用。　１．７　荧光ＰＣＲ与套式ＰＣＲ的比对　１．７．１样本的前处理：无菌尾根采集上海市１Ｏ个　规模化奶牛场临床疑似牛ＥＤＴＡ抗凝血样本共９４　１．３　引物的设计　采用ＡＢ公司Ｐｒｉｍｅｒ　５．０软件，根据ＢＬＶ　ｐｏｌ　份，４℃冰箱待检。样本核酸提取参考ＡＸＹＧＥＮ　公司ＡｘｙＰｒｅｐ体液病毒ＤＮＡ／ＲＮＡ小量试剂盒说　明书。　基因序列设计的特异性引物和荧光探针序列如下：　上游引物Ｃ１：５，＿ＡＡＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＴＧＡＣ一　３’；下游引物Ｃ２：５，＿ＴＧＧＴＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＴＣＴ—　ＧＡＴＴＧＴＧＡＧＴ一３’。ＦＡＭ－ＣＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＴＣ—　１．７．２　套式ＰＣＲ检测：参考ＯＩＥ推荐的套式ＰＣＲ　引物序列合成，ＰＣＲ结束后克隆取阳性重组质粒进　行序列测定，最后将采集的９４份全血样品同时进行　荧光ＰＣＲ方法检测，将结果进行对比。　ＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧ—ＴＡＭＲＡ引物由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司　合成并标记荧光基团，扩增全长７１　ｂｐ。　２　结果　２．１建立了３Ｏ　ｕＬ荧光ＰＣＲ反应体系：上、下游