(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 110907256 A(43)申请公布日 2020.03.24
(21)申请号 201911316879.X(22)申请日 2019.12.19
(71)申请人 广州达安临床检验中心有限公司
地址 510000 广东省广州市萝岗区科学城
荔枝山路6号
申请人 云康健康产业集团有限公司
成都高新达安医学检验有限公司 云康健康产业投资股份有限公司 上海达安医学检验所有限公司(72)发明人 虞其红 徐卫 陶维井 王忠源
杨帆 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理
有限公司 44224
代理人 林青中
权利要求书1页 说明书6页 附图13页
(51)Int.Cl.
G01N 1/30(2006.01)
(54)发明名称
染色体N显带方法(57)摘要
本发明提供了一种染色体N显带方法，包括以下步骤：将染色体标本玻片置于平面上，所述染色体标本玻片的含有染色体标本的一面与所
所述染色体标本玻片与所述平面之述平面贴合，
间具有缝隙层；在所述染色体标本玻片的边缘缓慢滴加反应液，反应液通过虹吸渗入至所述缝隙层，水浴加热孵育；所述反应液的组分包括AgNO3溶液，洗净后可以直接镜检，且可以清晰看到随体。该方法相对于传统的覆盖擦镜纸并滴加反应液的方法，试剂用量更少，而且，无需使用传统方法中的Giemsa染色，步骤更加精简、快捷。
CN 110907256 ACN 110907256 A
权 利 要 求 书
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1.一种染色体N显带方法，其特征在于，包括以下步骤：将染色体标本玻片置于平面上，所述染色体标本玻片的含有染色体标本的一面与所述平面贴合，所述染色体标本玻片与所述平面之间具有缝隙层；
在所述染色体标本玻片的边缘缓慢滴加反应液，反应液通过虹吸渗入至所述缝隙层，水浴加热孵育；
所述反应液的组分包括AgNO3溶液。
2.根据权利要求1所述的染色体N显带方法，其特征在于，所述水浴加热的温度为55-70℃。
3.根据权利要求2述的染色体N显带方法，其特征在于，所述孵育的时间为2-5min。4.根据权利要求1所述的染色体N显带方法，其特征在于，所述AgNO3溶液的质量浓度为40％-55％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的染色体N显带方法，其特征在于，所述反应液的组分还包括明胶显影液。
6.根据权利要求5述的染色体N显带方法，其特征在于，所述反应液中，所述AgNO3溶液与所述明胶显影液按14-18：4的体积比混合。
7.根据权利要求6述的染色体N显带方法，其特征在于，所述AgNO3溶液与所述明胶显影液按照15-16：4的体积比混合。
8.根据权利要求6所述的染色体N显带方法，其特征在于，所述明胶显影液包括明胶，甲酸和水；每49.5ml的水中加入0.8-1.2g明胶以及0.4-0.6ml甲酸。
9.根据权利要求1-4和6-8任一项所述的染色体N显带方法，其特征在于，所述水浴加热孵育后，还包括以下步骤：用水洗净所述染色体标本玻片、镜检。
10.根据权利要求1-4和6-8任一项所述的染色体N显带方法，其特征在于，所述染色体标本玻片的制备包括培养细胞并对所得细胞进行秋水仙素处理、低渗处理、固定以及对所述固定后的细胞进行制片的步骤。
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说 明 书染色体N显带方法
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技术领域
[0001]本发明属于细胞遗传学领域，特别涉及一种染色体N显带方法。
背景技术
[0002]染色体分带技术是经物理、化学因素处理后，再用染料对染色体进行分化染色，使其呈现特定的深浅不同带纹的方法。染色体分带技术可以分为两大类，一类是产生染色带分布在整个染色体的长度上，如G显带、Q显带和R显带。另一类是局部性显带，它只能使少数特定区域显带，如C显带、T显带和N显带。[0003]人类的近端着丝粒染色体(即13、14、15、21和22染色体)的次缢痕处与核仁形成有关，故称核仁形成区(Nucleolar-Organizing Region，NOR)，它是中期染色体上的明显结构之一。利用硝酸银将具有转录活性的核仁形成区(rRNA基因)特异性的染成黑色，这种银染阳性的核仁形成区称为Ag-NOR，称为N-显带，它们是具有转录活性的18SrRNA基因和28SrRNA基因所在的部位。由于具有转录活性的rRNA基因(rDNA)往往伴有丰富的酸性蛋白质，该类蛋白质含有巯基(-SH)和二硫键(-S-S-)，能使AgNO3中的Ag+还原成Ag颗粒，因此有转录活性的核仁形成区常被镀上银颗粒而呈现黑色，没有转录活性的NOR则不着色。[0004]传统的N显带方法利用50％AgNO3溶液与明胶显影液按照一定比例(4：1或者15：4)混合均匀或者单独使用50％AgNO3进行显带，显带时需将染色体标本玻片上含有染色体标本的一面用4层干净擦镜纸(略小于玻片大小)盖好。用吸管将AgNO3混合溶液慢慢滴于擦镜纸上使之浸润整张玻片，直至擦镜纸呈棕黄色或黑色为止，一般6-8ml能滴2张标本玻片。该方法显带过程操作复杂且需消耗较多的试剂，且标本片背景不清晰。发明内容
[0005]基于此，本发明的目的在于提供一种简便、显色效果好、背景清晰的外周血淋巴细胞的染色体N显带方法。
[0006]具体技术方案如下：[0007]一种染色体N显带方法，包括以下步骤：[0008]一种染色体N显带方法，包括以下步骤：[0009]将染色体标本玻片置于平面上，所述染色体标本玻片的含有染色体标本的一面与所述平面贴合，所述染色体标本玻片与所述平面之间具有缝隙层；[0010]在所述染色体标本玻片的边缘缓慢滴加反应液，反应液通过虹吸渗入至所述缝隙层，水浴加热孵育；
[0011]所述反应液的组分包括AgNO3溶液。[0012]在其中一个实施例中，所述水浴加热的温度为55-70℃。[0013]在其中一个实施例中所述孵育的时间为2-5min。[0014]在其中一个实施例中，所述AgNO3溶液为的质量浓度为40％-55％(浓度低有可能导致部分染色体核仁形成区没有着色，太高试剂成本会增加)。
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CN 110907256 A[0015][0016]
说 明 书
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在其中一个实施例中，所述反应液的组分还包括明胶显影液。在其中一个实施例中，所述AgNO3溶液与所述明胶显影液按14-18：4的体积比混在其中一个实施例中，所述AgNO3溶液与所述明胶显影液按照14-16：4的体积比混
合。
[0017]
合。
在其中一个实施例中，所述明胶显影液包括以下组分：明胶，甲酸，纯水。
[0019]在其中一个实施例中，所述水浴加热孵育后，还包括以下步骤：用热水(温度同孵育温度55-70℃)洗净所述染色体标本玻片、镜检。[0020]在其中一个实施例中，所述染色体标本玻片的制备包括培养细胞并对所得细胞进行秋水仙素处理、低渗处理、固定以及对所述固定后的细胞进行制片的步骤。[0021]基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：[0022]本发明利用虹吸原理，将染色体标本玻片置于平面上，玻片的含有染色体标本的一面与所述平面贴合，并在染色体标本玻片的边缘缓慢滴加含有AgNO3的反应液，反应液通过虹吸渗入至染色体标本玻片和平面之间的缝隙，在通过水浴加热孵育染色，至反应液变为棕色，洗净后可以直接镜检，且可以清晰看到随体。该方法相对于传统的覆盖擦镜纸并滴加反应液的方法，试剂用量更少，且由于玻片的含有染色体标本的一面反置后与所述平面贴合，染色液染色时不不会有杂质沉淀在染色体标本上，N显带明显且背景清晰。而且，无需使用传统方法中的Giemsa染色，步骤更加精简、快捷。附图说明
[0023]图1为本发明实施例2操作示意图；
[0024]图2为本发明实施例2玻片与培养皿底通过虹吸原理吸入反应液后的效果图；[0025]图3为对比例1的操作示意图；[0026]图4为实施例2的背景效果图；[0027]图5为实施例2的镜检效果图；[0028]图6为对比例1的背景效果图；[0029]图7为对比例1的镜检效果图；[0030]图8为对比例2的背景效果图；[0031]图9为对比例2的镜检效果图；[0032]图10为对比例3的背景效果图；[0033]图11为对比例3的镜检效果图；[0034]图12为对比例4的背景效果图；[0035]图13为对比例4的镜检效果图。
具体实施方式
[0036]为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的
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[0018]
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说 明 书
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条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。[0037]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0038]本发明的实施例提供一种染色体N显带方法，包括以下步骤：[0039]将染色体标本玻片置于平面上，所述染色体标本玻片的含有染色体标本的一面与所述平面贴合，所述染色体标本玻片与所述平面之间具有缝隙层；[0040]在所述染色体标本玻片的边缘缓慢滴加反应液，反应液通过虹吸渗入至所述缝隙层，水浴加热孵育；
[0041]所述反应液的组分包括AgNO3溶液。[0042]优选地，所述水浴加热的温度为55-70℃。进一步优选为60±1℃。其中，水浴加热对于N显带的着色效果主要有：①促进反应液的反应速度；②延长反应液的反应时间，避免加热过程中反应液挥发速度过快而粘附在玻片上难以清洗。当温度过低时，反应液反应速度过慢，而温度过高时，反应速度难以掌控，导致着色深浅不一，实验过程不稳定。[0043]优选地，所述孵育的时间为2-5min。孵育时间根据反应液的颜色变化程度而定，通常以变为棕色既可，时间不够会导致核仁区无法完全上色，时间过久会导致整条染色体染色过深，影响镜下对随体的观察。[0044]优选地，所述AgNO3溶液为的质量浓度为40％-55％(浓度低有可能导致部分染色体核仁形成区没有着色，太高试剂成本会增加)。[0045]更优选地，所述反应液的组分还包括明胶显影液。明胶显影液的主要成分包括：明胶，甲酸和水；每49.5ml的水中加入0.8-1.2g明胶以及0.4-0.6ml甲酸。在反应液中添加明胶显影液与AgNO3溶液配合使用，有利于促进反应的进行。[0046]进一步优选地，所述AgNO3溶液与所述明胶显影液按14-18：4的体积比混合。更优选为14-16：4的体积比。[0047]优选地，所述水浴加热孵育后，还包括以下步骤：用热水洗净所述染色体标本玻片、镜检。
[0048]优选地，所述染色体标本玻片的制备包括培养细胞并对所得细胞进行秋水仙素处理、低渗处理、固定以及对所述固定后的细胞进行制片的步骤。[0049]以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。[0050]实施例1染色体标本玻片的制备方法[0051]以外周血淋巴细胞培养为例：[0052]①细胞培养：密闭式培养箱培养66小时-72小时。外周血淋巴细胞培养环境的温度为37℃±0.5℃，且一定要以温箱内部温度为准，每隔24小时左右轻摇1次，以促进细胞生长增殖；
[0053]②秋水仙素处理：培养终止前在培养基中加入浓度为20μg/ml的秋水仙素0.01ml-0.02ml(用7号注射器针头垂直滴加1滴-2滴)，使最终浓度为0.04μg/ml-0.08μg/ml，37℃±0.5℃培养箱中处理4小时；[0054]③低渗处理：秋水仙素处理完毕后，小心地从温箱取出培养瓶，用吸管吸取培养物
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说 明 书
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入离心管，离心(1500rpm，10min)。然后加入37℃温育的0.075mol/L的KCl低渗溶液8ml，用吸管吹打成细胞悬液，置37℃水浴处理30min；[0055]④预固定：在每个离心管中加入1.5ml的固定液，混匀，静置5min后离心(1500rpm，10min)，弃上清液；[0056]⑤固定：在离心管中加入固定液6ml-8ml，立即用吸管轻轻混匀细胞悬液，在37℃水浴中固定30min后，离心，1500rpm，10min，弃上清液；[0057]⑥再固定：重复第6步或置于2℃-8℃冰箱过夜；[0058]⑦制片：在离心管中滴入适量新固定液，用吸管将淋巴细胞团轻轻混匀，从冰箱的冷冻室内取出冰片，每片滴加悬液1滴-2滴，晾干即可。[0059]实施例2外周血淋巴细胞的染色体N显带方法[0060]溶液配制：[0061]质量浓度为50％的AgNO3溶液：称取50g AgNO3置于棕色试剂瓶内，然后加入100ml超纯水，混匀，室温避光保存，有效期2个月。[0062]明胶显影液：称取1g明胶，置于试剂瓶内，加入49.5ml超纯水，0.5ml甲酸混匀，室温保存，有效期10天(2-8℃保存1个月)。因为明胶显影液时间放置过久，会影响玻片整体的洁净度。染色体N显带步骤：[0063]1、50％AgNO3溶液与明胶显影液按照体积比为15.5：4的比例混匀，得反应液；[0064]2、将染色体标本玻片置于干净的培养皿中，其中，染色体标本玻片上含有染色体标本的一面与培养皿底部接触，在玻片边缘缓慢滴加反应液，如图1所示，利用玻片与培养皿底部之间的缝隙，通过虹吸原理将反应液吸入，吸入后效果如图2所示；[0065]3、置于60℃水浴箱内孵育3分钟，待反应液变为棕色后取出；[0066]4、用预热的蒸馏水洗净后即可镜检。[0067]实施例3[0068]溶液配制：
[0069]参照实施例2的方法配制质量浓度为40％的AgNO3溶液。[0070]参照实施例2的方法配制明胶显影液：称取0.8g明胶，置于试剂瓶内，加入49.5ml超纯水，0.6ml甲酸混匀，室温保存，有效期10天(2-8℃保存1个月)。因为明胶显影液时间放置过久，会影响玻片整体的洁净度。[0071]染色体N显带步骤：[0072]1、40％AgNO3溶液与明胶显影液按照体积比为14：4的比例混匀，得反应液；[0073]2、将染色体标本玻片置于干净的培养皿中，其中，染色体标本玻片上含有染色体标本的一面与培养皿底部接触，在玻片边缘缓慢滴加反应液，如图1所示，利用玻片与培养皿底部之间的缝隙，通过虹吸原理将反应液吸入，吸入后效果如图2所示；[0074]3、置于55℃水浴箱内孵育2分钟，待反应液变为棕色后取出；[0075]4、用预热的蒸馏水洗净后即可镜检。染色背景及镜检效果与实施例2接近。[0076]实施例4[0077]溶液配制：
[0078]参照实施例2的方法配制质量浓度为55％的AgNO3溶液。[0079]参照实施例2的方法配制明胶显影液：称取1.2g明胶，置于试剂瓶内，加入49.5ml
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超纯水，0.4ml甲酸混匀，室温保存，有效期10天(2-8℃保存1个月)。因为明胶显影液时间放置过久，会影响玻片整体的洁净度。[0080]染色体N显带步骤：[0081]1、55％AgNO3溶液与明胶显影液按照体积比为18：4的比例混匀，得反应液；[0082]2、将染色体标本玻片置于干净的培养皿中，其中，染色体标本玻片上含有染色体标本的一面与培养皿底部接触，在玻片边缘缓慢滴加反应液，如图1所示，利用玻片与培养皿底部之间的缝隙，通过虹吸原理将反应液吸入，吸入后效果如图2所示；[0083]3、置于70℃水浴箱内孵育5分钟，待反应液变为棕色后取出；[0084]4、用预热的蒸馏水洗净后即可镜检。染色背景及镜检效果与实施例2接近。[0085]对比例1
[0086]一种外周血淋巴细胞的染色体N显带方法，具体步骤如下：[0087]1、50％AgNO3溶液与明胶显影液按照4:1比例混合均匀，得反应液；[0088]2、玻片上含有染色体标本的一面用4层干净擦镜纸(略小于玻片大小)盖好，如图3所示；
[0089]3、将反应液缓慢滴加至擦镜纸上；[0090]4、置于60℃水浴箱内3分钟，待反应液变为棕色后取出；[0091]5、用镊子轻轻启开擦镜纸，用预热的水洗净。[0092]对比例2
[0093]本对比例是实施例2的对比例，相对于实施例2的主要差别包括采用过高的温度进行水浴加热孵育。具体地，本对比例的步骤3为：[0094]置于75℃水浴箱内孵育3分钟，待反应液变为棕色后取出。其余步骤同实施例2。[0095]对比例3
[0096]本对比例是实施例2的对比例，相对于实施例2的主要差别包括水浴加热孵育的时间过久。具体地，本对比例的步骤3为：[0097]置于60℃水浴箱内孵育7分钟，待反应液变为棕色后取出。其余步骤同实施例2。[0098]对比例4
[0099]本对比例是实施例2的对比例，相对于实施例2的主要差别包括采用25℃的水进行洗片。具体地，本对比例的步骤4为：[0100]用25℃蒸馏水洗净后即可镜检。其余步骤同实施例2。[0101]上述实施例、对比例的N显带染色效果及消耗试剂的体积，如表1所示：[0102]表1实施例和对比例的N显带染色效果
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实施例2的结果参照图4、图5，根据图4、图5可知：本实验方法所获得的标本玻片背
景清晰，显带清晰，便于镜下分析。[0106]对比例1的结果参照图6、图7，根据图6、图7可知：传统方法所获得的标本玻片背景杂质较多，核型易被杂质包裹，显带之后会出现较多的杂质干扰。[0107]对比例2的结果参见图8、图9，根据图8、图9可知：温度过高反应液挥发过快，导致反应液干燥吸附在玻片上清洗困难，背景脏差且由于反应液反应时间不够导致显带不够。[0108]对比例3的结果参见图10、图11，根据图10、图11可知：反应液作用时间过久会导致整条染色体颜色深染，与随体染色相近，难以分析。[0109]对比例4的结果参见图12、图13，根据图12、图13可知：由于反应液中的明胶在温度较低的时候出现凝固，多余的反应液容易粘附在标本玻片上影响显带背景，而热水更容易清洗掉多余的反应液。[0110]整体上讲，采用本发明的方法，相对于对比例，减少了试剂的消耗，解决了标本片背景的不清晰的问题。镜检时可以清晰看到随体，无需再使用Giemsa染色。主要原理是因为将标本片反置，显影混合液产生的多余沉淀物不会沉积在玻片上，使得玻片较传统N显带方法所得的玻片背景要干净；同时由于利用玻片与玻璃皿之间的缝隙填充试剂，会比通过浸润附着物然后才有试剂附着在玻片上要节省一半以上的试剂。[0111]以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0112]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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