DNA提取实验报告

实验名称：质粒扩增、提取和鉴定实验

实验目的 通过对智力扩增、提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作，加深对分子生物学基本技术的理解和掌握。

实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。

实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的培养来实现对质粒的扩增。经过处理的线状dna在外界环境恢复正常的时候不能够复性 而质粒dna可以复性，从而可以实现质粒dna和染色体dna的分离。限制性内切酶能特意地结合于一端被称为限制性酶识别系列的dna系列之内或其附近的特异位点上，并切割dna。当对提取的质粒dna进行电泳时，同一质粒dna其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。

实验步骤： 一 质粒扩增

（1）普通lb固体培养基制备：

制备lb培养基，倒入灭菌瓶中高压灭菌，待完全冷却后，保存备用。 （2）将大肠杆菌接种于lb培养基中，37℃振荡培养过夜(200转/分) 二 质粒dna的提取(碱法)

1将菌液倒入的微量离心管中， 12000rpm离心一分30秒，弃去上清液，以得到较多的细菌沉淀；

2、 将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。

3、 加入100μl用冰预冷的溶液i，剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。 4、 加入200μl现配的溶液ii，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免dna断裂），使混合物混匀，冰浴5～10分钟。

5、 加入150μl预冷的溶液iii，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液iii中，冰浴5分钟。

6、 取上部水相，移入新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇（也可同时加入1/10倍体积的醋酸钠），震荡混匀，室温放置10分钟沉淀双链dna，然后4℃，12000rpm离心10min。

7、 弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使离心管底部的液体流尽后，加 入预冷的1ml 70％乙醇。

8、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使液体流尽，置dna干燥5～10分钟。 9、吸除上清液，将管口倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。 10 、 将沉淀溶于34υlte缓冲液或灭菌水（）中，储于-20℃冰箱中 三dna酶切反应

1、 将洁净干燥并经灭菌的eppendorf 管（最好）编号，用微量移液枪分别加入dna（υl）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2υl，将管内溶液混匀后加入υl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可以用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。

2、 混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴锅保温2-3小时，使酶切反应完全。

3、 每管加入2υl edta（），混匀，以停止反应，置于冰箱之保存备用。 四 dna的琼脂糖凝胶电泳

1、 取5×tbe缓冲液100ml加蒸馏水至1000ml，配成×tbe稀释缓冲液，待用。

2、 胶液的制备：称取3g琼脂糖置于1000ml锥形瓶中，加入300ml ×tbe稀释缓冲液，加入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，此为1%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使其附于瓶盖上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发。

3、 胶版的制备：想冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭（eb）溶液使其终浓度为υlg/ml。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则溶液出现气泡，待胶完全凝固后，拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入υ×tbe稀释缓冲液至页面恰好没过胶板上表面

4、 加样：取20υl的酶解液与2υl10×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中，每加完一个样品要更换tip头以防止互相污染，注意上样时要小心操做，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿

5、 电泳：加完样后合上电泳槽盖，立即接通电源，控制电压保持在60-80v，电流在40ma以上，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿2cm时停止电泳

6、 观察和拍照 五 实验结果 六 实验结论

通过本次试验加深了对分子生物学以及基因工程的深入了解，右上第三第四根亮柱是我的结果。结果显示，第三条中酶切效果良好，rna被降解的很完全，第四根没有被酶切，质粒dna跟rna同时存在，出现了两条亮带，质粒dna跟rna分离效果较好。

本实验需要细致认真的完成，所以特别在凝胶电泳中要十分注意以下事项：

（1） 取出梳子之前，一定要耐心等待琼脂糖凝胶的凝固，拔梳子是一定要手稳，而且要 垂直拔出；

（2） 点样要细心，枪头不要碰到凝胶，以免点样枪刺破凝胶； （3） 电泳时，电极一定要连接正确

（4） 染色剂溴化乙锭是强诱变剂，有致癌性和强毒性，使用时一定要带一次性手套，使 用后废液不可不可随意丢弃。

生物科学 071班 姓名：刘欢 学号：篇二：dna的提取和电泳实验报告 基因组dna的提取和电泳（实验五）实验报告 一、实验目的

了解dna提取的方法，以及琼脂糖凝胶电泳分析dna技术。 二、器材和试剂 1. 器材

水平琼脂糖电泳仪，离心机，水浴锅，研钵，离心管、移液枪、水稻幼苗等 2. 试剂

1. 1mol/l 的配制：称取 的tris，置于80 ml的ddh20,加入浓盐酸 （约 ml）,调节ph值至，定容至100 ml。 2. mol/l edta的配制： na2edta·2h2o，加入80 ml的ddh2o,用naoh颗粒调ph值至（约需

2 g），定容至100 ml。

3. 提取缓冲液的配制： 100 mmol/l , 20 mmol/ledta, 500 mmol/l nacl, 1. 5%sds

4. 80/4/16氯仿：异戊醇：乙醇

5. 6loading buffer：％溴酚蓝，％二甲苯青ff，5 mmol/l edta，50％甘油 三、实验步骤

1. 在15ml的离心管中加入5ml的提取缓冲液，60℃水浴预热。

2. 植物叶1-2g，剪碎，在钵体中加入石英砂，加入预热的提取缓冲液，磨成粉末状， 60℃水浴保温20 min，其间不时缓慢摇动。

3. 5000 rpm离心5分钟，仔细吸取上清液至另一离心管中，

4. 加入5 ml 氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀（需带手套，防止皮肤损伤），室温下静置

5-10分钟，使水相和有机相混匀。 5. 室温下离心5000 rpm离心5分钟。

6. 仔细吸取上清液至另一离心管中，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出 现絮状沉淀。

7. 离心5000 rpm，离心5 min，弃去异丙醇，室温晾干。

8. 视沉淀多少，加入1ml左右ddh2o溶解，可在60℃水浴中放置15分钟以上助溶。 9. 取dna样品5 μl，加入1 μl6loading buffer，混匀，加入%的琼脂糖凝胶加样孔 中，电泳，检测dna的分子大小。 4、实验结果和讨论

实验分析：本次实验由于种种原因我是和植保102班的同学一起做的，我们组3人，实验过程比较严谨，受到了老师的表扬，实验结果也很令人满意。

下面是实验过程中的注意点：1、研磨不能太久太用力，会导致dna片段断掉。2、实验室的某些试剂，如氯仿，有毒性，应带手套进行。

电泳的时候不知是时间的原因还是都做得不错，结果相差不是很远（如上图），第五组和第六组是我们的，第六组是我自己加的。实验过程中要耐心细心，这样才能得到满意的结果。

园艺101 石颖

011篇三：浙大生化实验报告dna的提取 实验报告

课程名称： 生化实验甲 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称：植物基因组dna的提取 实验类型： 生化定性实验 同组学生姓名： 及纯度与含量的测定 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习并掌握植物基因组dna的提取原理和方法； 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3、学习并掌握对电泳检测基因组dna结果的初步分析； 4、学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法； 5、学习并掌握紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量的方法。 二、实验基本原理 植物基因组dna的提取方法就其提取原理主要有二种：十六烷基三乙基溴化铵（ctab)法、十二烷基硫酸钠 (sds)法。十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和

核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使dna得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(dna、rna)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使dna沉淀，沉淀dna溶于te溶液中，即得植物基因组 dna溶液。

由于植物中的次生代谢产物——多酚类化合物可介导dna降解，而多糖的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及dna聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。传统的ctab-dna提取法步骤多，较烦琐，dna产率低，而且由于酚很难完全去除，容易影响以后的酶切等工作的效率。sds法操作简单，温和,也可提取到较高分子量dna，但所得产物含糖类杂质较多,这将直接影响dna的限制性核酸内切酶酶切效果。由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对dna的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。

本实验采用十二烷基硫酸钠 (sds)法提取植物基因组dna，基因组dna提取后， ①通过琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组dna分子量大小、纯度；②用紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量。

dna的琼脂糖凝胶电泳鉴定:

dna分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。dna分子在高于等电点的溶液中带负电荷，它在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，dna分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的dna片段泳动速度不同。dna片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（eb）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定dna片断在凝胶中的位置。

紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量

核酸——dna和rna所含碱基的苯环结构（嘌呤环和嘧啶环）的共轭双键具有紫外吸收的性质，它们在260nm处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长进行核酸含量的测定。

波长为260nm时，dna或rna的光密度的大小不仅与总含量有关，也与它们的不同构型而有差异。

对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，dna钠盐的od260＝。 当od260＝1时，双链dna含量约为50μg / ml 单链dna含量约为37μg / ml rna含量约为40μg / ml

寡核苷酸含量约为30μg / ml（由于底物不同有差异） 1、核酸样品dna、rna含量的测定：

如用1cm光径石英比色皿，用 h2o稀释dna或rna样品n倍并以h2o为空白对照，根据此时读出的od260值即可计算出样品稀释前dna的含量：

dna（μg/μl）=50×od260读数× dna样品稀释倍数/1000 rna（μg/μl）=40×od260读数× rna样品稀释倍数/1000

若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用溴化乙锭法或其他方法进行估算。

当dna样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响dna吸光度的准确测定。由于 dna在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。所以，一般情况下同时检测同一样品的od260、od280和od230，计算它们的比值来判断核酸样品的纯度。

2、核酸样品纯度判断的一般标准：

⑴ dna纯度：od260/od280≈，表示为纯的dna； od260/od280 ＞，表示有rna污染；

od260/od280 ＜，表示有蛋白质、酚等污染。

⑵ rna纯度： ＜od260/od280＜，表示为纯的rna； od260/od280 ＜时，表示有蛋白质或酚污染； od260/od280 ＞时，表示可能有异硫氰酸残存。

⑶ od230/od260的比值应在之间，若比值较高说明有残余的盐和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。

若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量；同时也会影响酶切和pcr的效果。

三、实验材料与试剂

1、实验材料：植物幼嫩叶子 2、实验试剂

（1）基因组dna提取缓冲液 （2）氯仿:异戊醇:乙醇抽提液 （3）te缓冲液 （4）平衡酚： （5）rna酶a （6）酚/氯仿 （7）氯仿/异戊醇

（8）异丙醇、无水乙醇、70%乙醇。 （9） 3mol/l naac （10） 5×tbe缓冲液

（11） 6×电泳上样缓冲液 （12） %琼脂糖凝胶 （13） eb

（14） dna分子量markers：125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23130bp. （15） ddh2o；

四、实验器材与仪器 1、研体

2、离心机、离心管（7ml、5ml）及离心管架； 3、微量移液器10ul、200ul、1000ul及枪头； 4、恒温水浴箱65 ℃ 5、制冰机； 6、冰箱；

7、恒温水浴箱 37℃； 8、微波炉；

9、电泳仪及电泳槽； 10、紫外检测仪。 11、紫外分光光度计；

12、石英比色皿（光径）或1cm光径的微量石英比色皿（50ul、100ul）。 （二）琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna

1、制胶（1％琼脂糖凝胶）（此步骤由实验室老师准备）

在胶模上架好梳子。称取01g琼脂糖，置于250ml锥形瓶中，加100ml ×tbe电泳缓冲液，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，待其冷却至50～60℃后，加入eb，使其终浓度为l，摇匀后立即倒入准备好的胶模中，待胶凝固后，放入电泳槽中，倒入适量×tbe（刚好淹过胶面），拔去梳子备用。（注：eb为诱变剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作）

2、加样

取5ul纯化的dna原溶液样品，与1ul 6×电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中（注：勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡）。若dna含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要换枪头以防互相污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

3、电泳

加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到100v，恒压电泳。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约2cm时，停止电泳（约需30～60min）。

4、观察和拍照

取出胶块置于紫外灯下观察，dna存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带，再用成像仪进行拍照，以便于分析。（注：紫外光对眼睛有害，观察时戴上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察）。 紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量

将提取的植物基因组dna样品吸取20ul，加到新的5ml离心管中，再加一定量的ddh2o 或te缓冲液（ph ）稀释100倍，用光径石英比色皿（约需样品溶液）或微量石英比色皿在紫外分光光度计上测定230nm、260nm、280nm处的吸光度。计算植物基因组dna样品溶液的dna的含量以及dna样品的纯度。

六、结果与分析 （一）

这是电泳后得到的照片，其中从右往左数第七条带为我所做样品的基因组。 （二）紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量

1、植物基因组dna样品溶液的dna的含量： dna（μg/μl ）=ul

2、植物基因组dna样品溶液的dna的纯度： od260/od280＝ od230/od260＝ 3、样品纯度判断：

⑴ od260/od280 ≈，表示为纯的dna； ⑵ od260/od280 ＞，表示有rna污染；

⑶ od260/od280 ＜，表示有蛋白质、酚等污染。 由od260/od280＝可知，样品含有rna杂质。 七、讨论、心得

注意事项：影响dna泳动速率（迁移率）的因素有：

⑴ dna分子质量的影响：双链dna分子迁移的速率与dna分子量对数成反比。分 子量越大，迁移率越小。

⑵ dna构型的影响：超螺旋dna＞线状dna＞开环dna

⑶ 胶浓度的影响： 浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度为1％～2％；

⑷ 电场强度的影响：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般5v/cm）（电场强度） 。而对于大片段电泳，甚至用～cm电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。

⑸ eb的影响：溴化乙锭（eb）插入双链dna造成其负电荷减少、刚性和长度增加。 ⑹ 电泳缓冲液的影响:核酸电泳常采用tae、tbe、tpe三种缓冲系统，但它们各有利弊。tae价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。tpe在进行dna回收时，会使dna污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用tbe缓冲液。在缓冲液中加入edta，可以鳌合二价离子，抑制dnase，保护dna。缓冲液ph常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。

⑺ 碱基组成与电泳温度的影响: 一般影响不大

在dna提取过程中必须始终注意以下几个关键问题：

（1）dna的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。

（2）抑制内外源dnase的活力。dnase就象一把刀，它能把大分子的dna切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、调节ph，使偏碱

（）；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂（edta）除去酶的铺助因子（mg2+），使酶活性丧失。

（3）防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使dna降解，一般综合考虑，取左右为宜。

（4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，dna分子特别大，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使dna断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。

（5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取dna的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，dna含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。

由结果可知，在加入rna酶的时候可适当多加一点，以免造成得到的dna样品含较多rna杂质。篇四：dna提取实验报告

注：1、报告内的项目或内容设置，可根据实际情况加以调整和补充。

2、学生提交实验报告时间为实验后10日内。篇五：dna提取及pcr扩增实验报告 pcr扩增及dna琼脂糖凝胶电泳 刘琳 1131428 环境科学

一、实验目的

1．学习并掌握pcr扩增的基本原理与实验技术。

2．对扩增后的dna进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。 二、实验原理 1. pcr扩增

多聚酶链反应（pcr）技术的原理类似于dna的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板dna、四种脱氧核苷酸（dntp）、耐热taq聚合酶及两个合成dna的引物，而后加热使模板dna在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板dna互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72℃），在tap酶作用下，用四种dntp为原料，引物为复制起点，模板dna的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和dna合成这一循环，使产物dna重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物dna可作为后一循环的模板dna而参与dna的合成，使产物dna的量按指数方式扩增。经过30～40个循环，dna扩增即可完成。

2. dna琼脂糖凝胶电泳实验

dna分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，dna分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。dna分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的dna分子的迁移速度不同。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用dna分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。

三、实验材料

仪器：pcr扩增仪、薄壁管、离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。

试剂： tapdna聚合酶、dntp、buffer、两种引物、16s全长dna样本、无菌ddh2o、模板dna 、tbe、琼脂糖、eb、显色剂。

四、 实验步骤 1. pcr扩增

本次试验选择细菌16s rdna v3区片段进行扩增。

1.1. 根据计算，首先取离心管按照 10×buffer 、1 ul dntp、 ul 341gc、 ul 534、 ul taq、

ddh2o的比例配置足量的pcr反应体系。

1.2. 分别向9个薄壁管中分别加入24 ul的反应体系，并分别添加8种不同的模版，并

于第9个薄壁管中加入无菌ddh2o作为阴性对照。

1.3. 将薄壁管放入pcr扩增仪中，按照预定程序进行pcr扩增。其中循环过程需要达到

30~40次。程序如下： 预变性： 94℃ 3min 循环： 94℃ 变性30s 55℃ 退火30s 72℃ 延伸30s

末次延伸：72℃ 5min

1.4. pcr扩增完成后，将样品取出并保存于15℃环境中。 2. dna琼脂糖凝胶电泳实验

3. 1称取琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入适量的×tbe电泳缓冲液。然后置微波炉加

热至完全溶化，溶液透明。摇匀，待冷却至60℃左右，在胶液内加入适量的eb。 取有机玻璃制胶板槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。

待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。

在槽内加入×tbe电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。取1μl缓冲液和5μl待测dna样品混合后，用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。

接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5v/cm，开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。

观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。 在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯，通过观察孔进行观察。

五、实验结果与讨论

如图所示：从左至右，分别是模版 1-8号，第9列为阴性对照。

前8列均有明显的条带出现，而阴 性对照无显示，说明扩增整体效果很 好。图中有上下两条线，上面一条线所 覆盖的条带基本可以代表扩增的产生 的片段位置，参照图可以看出扩增片段 在200bp左右。在第9个阴性对照的第 二条线处可以看到较为模糊的条带，并 非是出现假阴性，而是由于二聚物而产 生的条带。通过该条带与最右侧的

marker对比可知该片段出现在100bp左 右，并非由于实验操作等问题而产生的 污染。

实验的照片显示实验结果有拖尾

现象，但是并不影响后续实验。在实验 过程中由于有些试剂加到了管壁上面， 并没有完全加入，可能会出现一些误

差。另外在第1列条带中出现了其他的亮带，可能是由于在前期的扩增实验中滴加试剂时由于量过少而进行的摇匀和融合等操作产生了非特异性扩增，也有可能是因为胶板制作过程中梳子的位置不合适或者胶板制作时边缘处不够均匀导致产生污染。但总体而言，实验结果较为满意。

六、实验注意事项

1. 由于pcr技术非常敏感，可使一个dna分子得以扩增，装有pcr试剂的离心管打开之

前，应先在微量离心机上作瞬间离心使液体沉积于管底。pcr扩增反应的条件，要控制好温度、时间和循环次数。

2. 最好在加完所有其它反应成分后才加模板dna。 3. 配琼脂糖时应使其完全溶化后方可制胶。

4. eb具有致癌作用，配制及使用时应带一次性手套。并在专门的实验室内使用。 七、实验收获

1. 通过本次实验学习并掌握了pcr反应的基本原理、实验过程及技术。 2. 通过本次实验掌握了电泳实验分离dna的原理和方法。 八、思考题

1、如果你的研究中要扩增大肠杆菌某个酶的基因，你如何进行相关实验

通过pcr扩增出想要的片段，然后通过凝胶电泳实验进行回收，并与合适的载体连接，转化进感受态细胞。经过培养提取质粒，进行酶切或pcr验证，测序最终验证，保存菌种

3. 一对引物序列为5‘-gactccagtcgaatctacca-3’和

5‘-aaccgtggcgacaccgctaa请计算它们的tm值及选择合适的退火温度，如果按你算的退火温度做pcr时没有得到相应的产物，你怎么解决

5‘-gactccagtcgaatctacca-3’

tm值=4（g+c）+2(a+t)-(5～10℃) =4（3+7）+2（6+4）-(5～10℃) =60℃-(5～10℃) =50~55℃

5‘-aaccgtggcgacaccgctaa’

tm值=4（g+c）+2(a+t) -(5～10℃) =4(5+7)+2(6+2) -(5～10℃) =64℃-(5～10℃)=54~59℃

因此退火温度可以选择在55℃

可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的tm值。引物对的tm差异如果超过5℃，就会令引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物tm不同，将退火温度设定为比最低的tm低5℃ 或者为了提高特异性，可以在根据较高tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。