高致病性h7n9流感病毒rt-lamp检测方法的建立

高致病性H7N9流感病毒RT⁃LAMP检测方法的建立

黄海超，徐日文，杨素，陈轩*，邵建宏，沙才华，罗宝正，赵福振，廖秀云

（拱北海关技术中心，广东珠海519000）

摘要∶2017年2月广东CDC首次报告了一种新的H7N9流感病毒变异株，该变异株在血凝素（HA）基因的裂解位点发生了插入型突变，从而成为对禽高致病性的H7N9流感病毒（HP⁃H7N9）。因此，急需建立一种快速简便的H7N9流感病毒检测方法。根据HP⁃H7N9的HA基因序列，设计一组HP⁃H7N9特异性的RT⁃LAMP引物，在对反应体系进行优化的基础上，建立了HP⁃H7N9的RT⁃LAMP检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验。结果显示，本方法只对HP⁃H7N9特异性扩增，而对低致病性H7N9病毒（LP⁃H7N9）、H7N3流感病毒（H7N3）、H3N2流感病毒（H3N2）、H5N1禽流感病毒（H5N1）、H9亚型禽流感病毒（H9）、新城疫病毒（NDV）、甲型H1N1流感病毒（H1N1）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）等病原未见扩度。本方法操作简便，对设备需求较低，试验耗时短，反应结果可直接肉眼观察判读，适用于基层兽医站所、养殖场及野外监测点的HP⁃H7N9的快速筛查和监测。

关键词∶高致病性；H7N9；流感病毒；RT⁃LAMP；检测方法中图分类号∶S852.65文献标识码∶A

文章编码∶1005⁃8567（2020）01⁃0039⁃04

增。该方法最低能够检测到2.97×105copies（10-6稀释度）的阳性质粒，具有良好的检测灵敏

DevelopmentofRT⁃LAMPdetectionmethodforhighly

pathogenicH7N9influenzavirus

HUANGHaichao，XURiwen，YANGSu，CHENXuan*，SHAOJianhong，

（TechnicalcenterofGongbeiCustoms，Zhuhai519000，China）

aninsertionalmutationatthecleavagesiteofthehemagglutinin（HA）gene，thusbecomingahighlypathogenicH7N9influenzavirus（HP⁃H7N9）foravian.AccordingtotheHAgenesequenceofHP⁃H7N9，asetofHP⁃H7N9⁃specificRT⁃LAMPprimerswasdesigned.Basedontheoptimizationofthereactionsystem，theRT⁃LAMPdetectionmethodofHP⁃H7N9wasestablishedandthespecificityandsensitivitytestwascarriedout.Theresultsshowedthatthismethod

Abstract∶InFebruary2017，GuangdongCDCfirstreportedanewvariantofH7N9influenzavirus，whichhas

SHACaihua，LUOBaozheng，ZHAOFuzhen，LIAOXiuyun

onlyspecificallyamplifiedHP⁃H7N9，otherRNAsamplesincludinglowpathogenicH7N9virus（LP⁃H7N9），H7N3influenzavirus（H7N3），H3N2influenzavirus（H3N2），H5N1avianinfluenzavirus（H5N1），H9subtypeavianinfluenzavirus（H9），Newcastlediseasevirus（NDV），influenzaAH1N1influenzavirus（H1N1），infectiousbursaldiseasevirus（IBDV）andavianinfectiousbronchitisvirus（IBV）didnotgiveamplificationcurves.Theminimumdetectionlimitforthepositiveplasmidwas2.97×105copies（10-6dilution），thisshowsthatthemethodhasagood

sensitivity.Themethodissimpleinoperation，lowinequipmentdemand，shortintesttime，andthetestresultcanbe

收稿日期：2019⁃10⁃23

基金项目：海关总署科技项目（2017IK153）；拱北海关科技项目（ZH2017⁃9）

作者简介：黄海超（1993⁃），男，广东珠海人，助理研究员，主要从事动物检验检疫技术研究。Email:514742430@qq.com*通信作者：陈轩（1983⁃），男，高级兽医师，研究方向：动物检疫技术。E⁃mail:65561977@qq.com

·40·试验研究高致病性H7N9流感病毒RT⁃LAMP检测方法的建立⁃黄海超，等

directlyobservedbyeyes，andissuitableforrapidscreeningandmonitoringofHP⁃H7N9ingrassrootsveterinarystations，farmsandfieldmonitoringpoints.

Keywords∶Highlypathogenic；H7N9；Influenzavirus；RT⁃LAMP；Detectionmethod

低致病性H7N9禽流感病毒自2013年出现以来，已广泛传播并引起了五波人类感染［1］。2017年2月广东CDC报道了两例人类感染H7N9流感病例，首次报告了一种新的H7N9流感病毒变异株，该变异株在血凝素（HA）基因的裂解位点发生了插入型突变［2⁃3］。这种插入型突变被认为是对禽高致病性的标志［4］。鉴于近年来冬春季节人类感染高致病性H7N9病毒对家禽业和公共卫生造成严重损害，流感病毒H7N9病毒的风险增加，（HP⁃H7N9）的诊断和监测，为加强对高致病性防止该我们开发了一种快速、敏感、特异的高致病性H7N9禽流感

病毒RT⁃LAMP检测方法。

1材料和方法

1.1

病毒

chicken/Guangdong/Q39/2017灭活的HP⁃H7N9鸡胚尿囊液H7N9流感病毒（LP⁃H7N9）（核酸、H7N9（毒株编号为）H7N3），低流感病毒致病A/

性H7N3）核酸、H3N2流感病毒（H3N2）核酸、H5N1

禽流感病毒（H5N1）核酸、H9亚型禽流感病毒（H9）核酸、新城疫病毒（NDV）核酸、甲型H1N1流感病毒

H1N1）核酸、传染性法氏囊病病毒（IBDV）核酸、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）核酸由华南农大兽医学院禽病研究室惠赠，H5亚型（Re⁃6疫苗株）、H5亚型（Re⁃8疫苗株）和H7亚型（Re⁃1疫苗株）禽流感病毒血凝抑制试验抗原来自哈尔滨维科生物技术开发公司。1.2

RNA主要试剂

基因技术有限公司产品；扩增试剂盒（恒温扩增法Plus、RNase⁃freeWater为宝生物工程RNA纯化试剂）为广州双螺旋

（大连）RNAiso品；其它常规试剂均为国产分析纯试剂。公司产

1.3

主要仪器

OptiGeneGenieII等温扩增荧光检测系统离心机为德国公司产品；SartoriusSigma为英国

公司产品；3⁃18K小型高速冰冻台式NanoDropND⁃

1000NanoDropSpectrophotometer紫外分光光度计为1.4

引物和探针的设计合成

Technologies公司产品。美国PrimerExplore利用Eiken（http：//primerexplorer.jp/e/Chemical公司的），在选取线HA软基件

因序列进行RT⁃LAMP的引物设计。引物序列如表1所示。将序列送华大基因科技有限公司合成，用DEPC

处理水溶解，-20℃避光保存。扩增目的片段序列如下GTTGGAAAATGTCCGAGATATGTTAAGCAAAGGA：ACTTGCCATTTCAGAACATAGATAGCAGGGCAGTCTTCTGCTGGCAACAGGGATGAAGAATGTTCCTGAGGTTCCAAAGAGAAAACGGACTGCGAGAGGGATGGGAAGGCCTAATTGATGGTTGGTATGGTTTCCTATTTGGTGCTATAGCGGGTTTCATTGAAAATGCAGACACCAGAATGCACAGGGAGAGGGAACTGCTGCAGATTACAAAAGCACTCAATCGGCAATTGATCAAATAACAGGGAAATTAAACCGGCTTATAGCAAAAACCAACCAACAATTTAAGTTGATAG分为外引物F3、B3对应区域；阴影部分为内引物（注：方框部FIP对应区域；下划线部分为内引物BIP对应区域）

表1

HP⁃H7N9RT⁃LAMP引物序列

引物序列（5’→3’）

F3B3

5’5⁃’CTATCAACTTAAATTGTTGGTTGGT⁃ACTTGCCATTTCAGAACATAGA⁃3⁃3’’

FIP（F2⁃F1C）BIP（B1C⁃B2）

5’⁃GCCTAATTGATGGTTGGTATGGTT⁃

TCTTCTGCTGGCAACAGG5’⁃GCCTCTCGCAGTCCGTT⁃

⁃3’ATTGCCGATTGAGTGCTT⁃3’注：F3、B3为外引物；FIP、BIP为内引物

1.5病毒RNA提取

按照RNA纯化试剂说明书进行。1.6

阳性对照和阴性对照的准备

将扩增目的片段提交华大基因科技有限公司

进LAMP330行基因作为阳性对照。无菌采取合成，制作重组质粒SPFWHC183645鸡胚尿囊

⁃

（（高致病性H7N9流感病毒RT⁃LAMP检测方法的建立⁃黄海超，等试验研究·41·

液，经检测通用A型流感病毒、IBDV、IBV和NDV等病毒核酸，结果均为阴性，作为阴性对照。1.7

RT⁃LAMP反应体系及优化

1.7.1内外引物浓度组合的优化

1.6从0.05μmol/L内引物（μmol/L以0.4FIP/BIP至μmol/L）终0.2μmol/L递增，浓度以外引物浓度从0.4μmol/L0.05μmol/L（F3/B3至递增，

）其它条件完全一致，反应温度为60℃，反应时间为60min，采用矩阵法进行筛选试验，以确定内外引物的最佳浓度和比例。1.7.2反应温度的优化

58℃以优化后的引物浓度为条件，60min为开始，，以确定最佳的一步法以1℃递增，直到RT⁃LAMP6℃，反应温度从

反应时间为1.8

特异性试验

反应温度。

使用优化确定的反应温度，以优化后的引物浓度配制反应体系，H3N2亚型禽流感病毒、H5N1、H5以HP⁃H7N9、LP⁃H7N9、H7N3、（亚型禽流感病毒Re⁃8疫苗株）、H7（Re⁃6亚型禽流感病毒疫苗株）、H5Re⁃1疫苗株）、H9、H1N1、IBDV、IBV、NDV等病毒核酸作为模板进行RT⁃LAMP，反应时间为60min，评价其特异性。同时使用显色法进行特异性评价，配制反应体系并在各反应管管盖内侧中央加1μl显色液钙黄绿素荧光染料），加入模板后反应60min，反应结束后颠倒反应管数次，使反应混合液与显色液充分混匀，观察反应液颜色情况。1.9

灵敏度试验

10⁃11阳性质粒测定浓度后，进行10倍梯度稀释至

引物浓度和反应温度进行的稀释度，对梯度稀释的样品按照优化后的LAMP检测，以评价方法敏感性。

测定HP⁃H7N9鸡胚尿囊液的血凝效价，将其倍比稀释至2-28，提取各稀释度尿囊液的病毒核酸，2以稀释度分别为2-1、2-4、2-8、2-12、2-16、2-16、2-20、-24、2-28的尿囊液所提核酸为模版，进行HP⁃H7N9囊液最高稀释倍数。

RT⁃LAMP检测，测试能检测到HP⁃H7N9核酸的尿

2

结果

2.1

引物浓度的优化

实验结果显示，16组内外引物终浓度组合中，除

内引物（FIP/BIP）浓度为0.4μM的4组未出现扩增曲线外，其余12组引物组合均能产生扩增曲线（见图1，图见第52页）。内引物浓度为1.2μM和1.6μM时，扩增曲线进入指数增长期的时间明显早于内引物浓度为0.8μM的实验组。扩增曲线最早到达峰值平台的内外引物浓度组合为1.2～0.10μM，扩增曲线荧光峰值最高的内外引物浓度组合为1.6～0.20μM。基于时间效率及检测成本的考虑，选择1.2～0.1μM作为HP⁃H7N9LAMP反应体系的内引物和外引物终浓度。通过优化确定的反应体系为：12.5µL、Bst聚合酶0.8μL、逆转录酶反应液0.2μLRM、内引物

（2X）0.5FIP/BIPμL、荧光染料，20μM）Ⅰ各1.50.5μLμL、、外引物RNA模板（F3/B35.0，μL5、μMRNase

）各Free2.2

dHRT⁃LAMP2O2.0μL反应温度的优化

，总体积为25µl。用优化的引物浓度，58~65℃条件下均能产生扩增曲线（图2，图见第52页），60℃、63℃、64℃时反应效率和扩增曲线最优（图2中编号为3、6、7的扩增曲线）。综合考虑扩增曲线进入指数增长期的时间和荧光峰值强度，RT⁃LAMP选择60℃作为HP⁃H7N92.3

特异性试验

的最佳反应温度。特异性试验中，只有阳性对照和HP⁃H7N9模板H5N1出现禽流感病毒、H5扩亚型禽流感病毒增曲线，而LP（Re⁃8疫苗株）（⁃Re⁃6H7N9、H7疫苗株、H7N3亚型禽流感病毒）、、H5H3N2亚型、Re⁃1疫苗株）、H9、H1N1、IBDV、IBV、NDV和阴性对照均未观察到S型扩增曲线（图3，图见第52页）。显色法试验结果显示只有HP⁃H7N9模板和阳性对照的反应产物呈绿色，其余模板反应产物皆呈橙色为阴性，表明本方法具有良好的特异性。2.4

敏感性试验

阳性质粒溶解后浓度为50ng/µl，换算成拷贝

数浓度为5.94×1010方法最低可检测到阳性质粒的copies/μl。试验结果表明，1010-6稀释倍数（5.94×本4结果见图copies/μlHP⁃H7N94（图见第），换算成拷贝数为52页）。

2.97×105copies，度分别为2-1、2鸡胚尿囊液的血凝效价为-4、2-8、2-12、2-16、2-16、2-20、2-2425、。以稀释

2-28的尿

囊液所提核酸为模版，进行HP⁃H7N9RT⁃LAMP检测，能检测到HP⁃H7N9核酸的尿囊液最低稀释度为2-24，

（（（（·42·试验研究高致病性H7N9流感病毒RT⁃LAMP检测方法的建立⁃黄海超，等

荧光扩增曲线见图5（图见第52页）。

3讨论

造成严重疾病甚至死亡2013年出现的H7N9［5］

，流感病毒能感染人类并

由于该病毒对家禽表现

为低致病性［6］，在禽群中常无症状传播，因此尽管主管部门和行业采取了诸多措施来预防和控制H7N9性限制了相关监测和净化行动的效果，病毒对家禽及人类的感染，但病毒的低致病使得该病H7N9毒能持续在禽鸟中传播和进化。变异株在HA裂解位点插入了多个碱基，2017年初出现的而成为对禽高致病性的毒株［7⁃8］。为加强对高致病从性H7N9流感病毒的监测，开展了高致病性H7N9流感病毒RT⁃LAMP检测方法的研究。

内外引物的浓度和比例是影响RT⁃LAMP反应

效率的重要因素［9］1.2时间显著短于内引物浓度为μM和1.6μM时，。试验结果表明，扩增反应进入指数增长期的内引物浓度在

0.8μM的时间（图1），

即内引物的浓度越高，起始阶段开始的合成反应就越多，反应效率越高；内引物浓度为0.4μM时未

出现扩增曲线。扩增曲线荧光峰值最高的内外引物浓度组合为1.6μM、0.20μM。内外引物浓度的最适比例为8∶1~16∶1，在此范围内都能取得较好的扩增效果。基于时间效率和检测成本的考虑，本方法确定的内外引物最佳浓度分别为0.1μM1.2μM、本方法只对。

HP⁃H7N9进行了特异性扩增，而

对H5N1LP⁃株）、H5禽流感病毒、H7N9、H7N3亚型禽流感病毒H5流亚型禽流感病毒感病毒、H3N2流感病毒、（Re⁃8疫苗株）（、H7Re⁃6亚型禽

疫苗流感病毒H1N1禽流感病毒流感病毒（Re⁃1（Re⁃1（疫苗株H1N1）、H9亚型禽流感病毒、甲型疫苗株））、IBDV等核酸不发生扩增，、IBV、NDV、H7亚型具有极高的特异性。

本方法最低能够检测到5.94×104

性质粒，与HP⁃H7N9荧光定量RT⁃PCRcopies/μL检测方法

的阳

［10］相比，RT⁃LAMP检测法的灵敏度相对较低。可能的原因是目的基因片段为LAMP330bp，长度略大，影响RT⁃囊液的血凝效价为扩增效率。试验所用的25，提取倍比稀释的各稀释度尿

HP⁃H7N9攻毒鸡胚尿囊液的病毒核酸，进行HP⁃H7N9RT⁃LAMP，能检测

到HP⁃H7N9核酸的尿囊液最低稀释度为2-24，表明本方法的敏感性远高于经典的血清学方法。

本研究基于HP⁃H7N9的HA基因序列设计了四条特异性引物，LAMP成功建立了HP⁃H7N9的RT⁃程，只需水浴锅即可完成相关检测，检测方法。由于本方法不需复杂的变温过并且可肉眼观察钙黄绿素染料荧光显色情况进行结果判定，减少了假阳性结果的干扰。本方法操作简便，对设备需求较低，试验耗时短，反应结果可直接肉眼观察判读，适用于设备条件有限的基层兽医站所、养殖场及野外监测点的HP⁃H7N9的快速筛查和监测。参考文献：

［1］DANIELLEHumanthefifthinfectionsLULIANOepidemicwithA，JANGY，JONESJ，etal.Increasein

⁃⁃Chinaavian，Octoberinfluenza2016A（⁃H7N9February）virus2017duringMorbidityandMortalityWeeklyReport，2017，66（9）：254⁃255.

［R］.［2］KEHighlyCWPathogenic，MokKPAvianC，ZHUInfluenzaWF，Aet（H7N9al.Human）VirusInfection，China［with

3］Emerging李艳华，高海女，Infectious杨仕贵，Diseases，等2017.H7N9，23（禽流感病毒分子生物学

8）：1332⁃1340.

J］.

［变异的研究进展［J］.病毒学报，2018，34（6）：904⁃910.［4］ZHANGrecently⁃FemergingC，BIYhighlyH，WANGpathogenicJ，etal.H7N9Humanavianinfectionsinfluenzawith

China［J］.TheJournalofInfection，2017，75：71⁃75.

in

［5］GAOnovelRavianB，CAOB，HUYW，etal.Humaninfectionwitha

6］EnglandZHANGJournal⁃originofMedicineinfluenza，2013A（，H7N9368（）20）virus：1888⁃1897.

［J］.TheNew

［virusesareQYtransmissible，SHIJZ，inDENGferretsGbyH，respiratoryetal.H7N9dropletinfluenza

Science，2013，341（6144）：410⁃414.

［J］.

［7］ZHOUhumanLinfections，TANY，withKANGhighlyM，etpathogenical.Preliminaryavianepidemiologyinfluenzaof

（H7N9）virus［J］.EmergingInfectiousDiseases，2017，23A

：［8］刘东，1355⁃1359.

张竹君，胡娇，等.2013～2017年我国H7N9亚型禽流

感病毒在家禽中的流行情况分析［J］.病毒学报，2018，34（6）：800⁃809.

［9］NOTOMImediatedT，OKAYAMAH，MASUBUCHIH，etal.Loop10］ResearchWANG，isothermal2000，28（amplification12）：E63.doi：of10.1093/nar/28.12.e63DNA.［J］.NucleicAcids⁃

RTpathogenic⁃PCRXRmethod，GULL，SHIJZ，etal.Developmentofareal⁃time

H7N9influenzaforthedetectionofnewlyemergedhighlyAgriculture，2017，16（09）：：viruses60345⁃60347.

［J］.JournalofIntegrative

［·52·

注：内引物和外引物浓度依次为1：1.6μM、0.2μMμM；μM、20.05：1.6μMμM；、50.15：μM；3：1.6μM、0.1μM；4：1.6μM；μM、70.2：1.2μMμM；10、0.11.2μM、0.2μM；6：1.2μM、0.15：μM；8：1.2μM、0.05μM；9：0.80.4；0.05μM12：μM

、0.80.15μMμM、0.050.8μM、0.15μM；11：0.8μM、0.1；15：μM0.4；μM13：、0.40.1μMμM、；0.216：μM0.4；μM14：、黄海超等图1

引物浓度的优化结果

AB注：A:特异性试验结果；B:特异性试验结果（显色法）

黄海超等图3

特异性试验结果

邓智昕等图1A、B型菌落不同摇菌时间活菌数曲线图

广东畜牧兽医科技

2020年（第45卷）第1期

黄海超等图2反应温度优化结果

AB注：A：阳性质粒模版，扩增曲线1~7所用质粒模板稀释度为10-1黄海超等~10-7；B：显色法

图4

灵敏度试验结果

黄海超等图5灵敏度试验结果（病毒核酸模版）