蛋白质测定

一、概述

（一）蛋白质测定的意义

1、人体需要的蛋白质必须从食物中摄取。

2、食品在加工贮存过程中，蛋白质的变化可影响食品的色、香、味及产品质量。

3、蛋白质是食品中重要的营养指标。 （二）食品中蛋白质的含量

在各种不同的食品中蛋白质含量各不相同，一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，例如牛肉中蛋白质含量为 20．0％左右，猪肉中为9．5％，兔肉为21％，鸡肉为20％，牛乳为 3．5％，黄鱼为17．0%，带鱼为18．0％，大豆为40％，稻米为8．5％，面粉为9．9％，菠菜为2．4％，黄瓜为1．0％，桃为0．8％，柑桔为 0．9%，苹果为0．4％和油菜为1．5％左右。 （三）蛋白质的含氮量

蛋白质是复杂含氮有机化合物，所含化学元素为C、H、O、N，在某些蛋白质中还含有微量的P、Cu 、Fe、I等元素，但含氮则是蛋白区别于其它有机化合物的主要标志。

（四）测定法概述

根据上述蛋白质的性质和成分，测定蛋白质的方法可分为两大类：

1、利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；

2、是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基因和芳香基团等测定蛋白质含量。

但因食品种类繁多，食品中蛋白质含量各异，特别是其他成分，如碳水化合物、脂肪和维生素等干扰成分很多，因此蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法，它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一，在国内外应用普遍。它是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量，由于样品中常含有少量非蛋白质含氮化合物，故此法的结果称为粗蛋白质含量。此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定。

二、凯氏定氮法

凯氏定氮法由Kieldahl于1833年首先提出，经长期改进，迄今已演变成常量法、微量法、自动定氮仪法、半微

量法及改良凯氏法等多种。 （一）常量凯氏定氮法 1、适用范围与特点

本法适用于各类物质中蛋白质测定。最低检出量为．0．05mg氮，相当0.3mg蛋白质。 2、实验原理

蛋白质是含氮的有机化合物。样品与浓硫酸和催化剂（加速蛋白质的分解，缩短消化时间）一同加热消化，使蛋白质分解，其中的碳和氢分别被氧化为CO2和H2O，样品中的有机氮则转化为氨后与硫酸结合生成硫酸铵，然后加40%氢氧化钠蒸馏，使氨蒸出，用4%硼酸吸收后再用硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，可得蛋白质含量。（反应方程式见书） 3、说明及注意事项：

（1）用专用的装置：凯氏烧瓶（500ml）和定氮蒸馏装置 （2）混合指示剂（最后滴定时指示终点）的配制：1份0.1％甲基红乙醇溶液+5份0. 1％溴甲酚绿乙醇溶液（用时混合）或2份0.1％甲基红乙醇溶液+1份0. 1％次甲基蓝乙醇溶液（用时混合）

（3）消化时加入浓硫酸是因为浓硫酸具有脱水性，使有机

物脱水并炭化为碳、氢、氮，浓硫酸又有氧化性，使炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫。 （4）作为催化剂，加入硫酸钾目的是为了提高溶液的沸点，加快有机物的分解。但硫酸钾加入量也不能太大，否则消化体系温度过高，会引起已生成的铵盐发生热分解析出氨而造成损失。除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。

（5）加入硫酸铜CuSO4不仅起催化剂的作用，还可指示消化终点的到达（液体变为蓝绿色时），以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。除硫酸铜外，还可用HgO、Hg（效果好，但有毒）、鱼粉（浑浊）、Se（效果较好，但价格较贵）。

（6）用0.1000N盐酸标准溶液滴定

（7）不同食物中蛋白质换算系数不同：乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为5.30。

（8）一般样品中尚有其他含氮物质，测出的蛋白质为粗蛋白。

（9）～（20）见书P161

（二）、微量凯氏定氮法 ＊ 与常量凯氏定氮法不同之处：

1、装置为100ml的凯氏烧瓶和微量凯氏定氮装置（见书） 2、所用的HCL标准溶液为0.01000N的盐酸标准溶液。 3、消化步骤相同，蒸馏过程稍有不同。

三、双缩脲法 （一）适用范围及特点

双缩脲法是测定蛋白质浓度常用方法之一。此法简单、快速，有较好的精密度，分析对象也较广泛，适于快速分析。本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。 （二）原理

双缩脲反应：脲小心加热至150～160℃时，两个分子的脲脱去一个氨分子生成双缩脲，可与铜离子形成有色复合物。

蛋白质分子中含有两个以上的肽键，与双缩脲结构相似，也有双缩脲反应(而氨基酸没有此结构)，因此，在碱性溶液中蛋白质与二价铜离子(如硫酸铜)形成可溶性的紫红色复合物(在540一560nm波长范围有最大吸收)，在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的分子质量及氨基酸成分无关。 （三）说明及注意事项：

1、所用主要仪器为分光光度计；离心机(4 000 r／min)；恒温水浴锅 2～6、见书P171