新佐剂——Montanide ISA 50V2在马免疫中的应用研究

・４２・　微生物学免疫学进展２０１３年第４ｌ卷第４期Ｐｒｏｇ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ａｕｇ．２０１３，Ｖｏ１．４１，Ｎｏ．４　・论著・　新佐剂　Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２在马免疫中的　应用研究　刘卫涛，柳洲，李育合，谢小荣，孟祥玉，张廷芬，高建军　（兰州生物制品研究所有限责任公司，兰州７３００４６）　摘要：目的方法研究新佐剂一Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２在马免疫中的应用，制定合理的免疫程序，提高马免疫血清效价。　在马免疫程序中，Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２与福氏不完全佐剂交替使用效果更好，免疫效价较高。结论　用Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２乳化Ａ型和Ｆ型肉毒类毒素制备成油乳抗原，免疫家兔和马，并与福氏不完全佐剂进　行对比。结果在进一步试验确证后，将Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２作为佐剂应用于马免疫中，以获得更高的免疫血清的效价。　关键词：Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２；福氏不完全佐剂；免疫程序　中图分类号：Ｒ３９２　文献标志码：Ａ　文章编号：１００５—５６７３（２０１３）０４—００４２—０３　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ａｄｊｕｖａｎｔ－Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２　ｉｎ　ｈｏｒｓｅ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｇｒａｍ　ＬＩＵ　Ｗｅ—ｔａｏ，ＬＩＵ　Ｚｈｏｕ，ＬＩ　Ｙｕ—ｈｅ，ＸＩＥ　Ｘｉａｏ—ｒｏｎｇ，ＭＥＮＧ　Ｘｉａｎｇ—ｙｕ，ＺＨＡＮＧ　Ｔｉｎｇ—ｆｅｎ，ＧＡＯ　Ｊｉａｎ－ｊｕｎ　（Ｌａｎｚｈｏｕ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００４６，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ｔｉｔｅｒｓ　ｏｆ　ａｎｔｉｔｏｘｉｎ　ｓｅｒｕｍ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｉｎ　ｈｏｒｓｅｓ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｇｒａｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｎ—　ｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａ　ｎｅｗ　ａｄｊｕｖａｎｔ　ｉｎ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｇｒａｍ　ｆｏｒ　ｒａｂｂｉｔｓ　ａｎｄ　ｈｏｒｓｅｓ．Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＳＡ　５０Ｖ２　ａｎｄ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ　ｔｙｐｅ　Ａ　ａｎｄ　Ｆ　ｔｏｘｏｉｄｓ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｗｅｒｅ　ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｄ　ｔｏ　Ｏ／Ｗ　ｅｍｕｌｓｉｏｎ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｉｓ　ｅｍｕｌｓｉｏｎ　ｔｏ　ｉｍ—　ｍｕｎｉｚｅ　ｔｈｅ　ｈｏｒｓｅｓ，ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ￣ａｄｊｕｖａｎｔ（ＦＩＡ）ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｏｆ　ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ　ｔｙｐｅ　Ａ　ａｎｄ　Ｆ　ｔｏｘｏｉｄｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｉｍｎｍｎｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｗｈｅｎ　ｔｗｏ　ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ　ｕｓｅｄ，ｔｈｅ　ｔｉｔｅｒ　ｏｆ　ａｎｔｉｔｏｘｉｎ　ｓｅｒｕｍ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａ　ａｄｊｕｖａｎｔ　ｉｎ　ｈｏｒｓｅｓ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｇｒａｍ　ｆｏｒ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｉｔｅｒｓ　ｏｆ　ａｎｔｉｔｏｘｉｎ　ｓｅｒｕｍ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２；ＦＩＡ；Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２是一种基于矿物油设计的　ｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２在不同动物体上进行了验证其免疫　效果的试验　，在猪体分别以Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２　和氢氧化铝为佐剂进行了效力比较　，在实验中，　将Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２佐剂用于家兔和马的免疫　程序。　佐剂，被开发以１：１的体积比用于稳定的油包水乳　剂的生产。通过诱导强而持久的免疫应答提高疫苗　的效力。它包含高级的注射用矿物油和植物来源的　甘露醇和油酸高度精炼的乳化剂。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２不含任何动物成分，与传统的油乳剂相比，　Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２制备的油乳剂非常稳定且易于　１材料和方法　１．１材料　注射。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２能诱导强的ｌｇＧ　抗体和　长期的免疫反应，同时还能提高淋巴细胞增殖反应，　因此这种佐剂能提高细胞免疫反应。佐剂Ｍｏｎ一　１．１．１　类毒素　１．１．２　佐剂　精制肉毒Ａ型、Ｆ型类毒素由兰　福氏不完全佐剂（ＦＩＡ）由兰州生　州生物制品研究所有限责任公司免疫室提供。　物制品研究所有限责任公司免疫室制备。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２由法国ＳＥＰＰＩＣ公司提供。　收稿日期：２０１３．０５－１７；修回日期：２０１３—０６—２１　作者简介：刘卫涛（１９７２一），男，医学生物助理工程师，主要从事肉毒　免疫马血浆生产及马免疫用抗原制备。　通信作者：高建军，Ｅ—ｍａｉｌ：ｇａｏ５３６９＠１６３．（￣ｏｌｎ　１．１．３实验动物　家兔由兰州生物制品研究所　有限责任公司动物室提供，马由兰州生物制品研究　微生物学免疫学进展２０１３年第４１卷第４期Ｐｒｏｇ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ａｕｇ．２０１３，Ｖｏ１．４１，Ｎｏ．４　・４３・　所有限责任公司免疫室提供。　１．１．４设备　恒温培养振荡器，型号为ＺＨＷＹ一　１００Ｂ，购自上海智城分析仪器制造有限公司；Ｔ２５　ｄｉｇｉｔａｌ　ＵＬＴＲＡ—ＴＵＲＲＡＸ分散机，购自德国ＩＫＡ混合　分散生产设备公司。　１．２方法　二组（第２针使用Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２，其余使用福　氏不完全佐剂）最好，免疫效价最高。家兔免疫血　清效价见表３，家兔死亡统计见表４。　表２马免疫程序（Ｆ型肉毒类毒素）　Ｔａｂ．２　Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｇｒａｍ　ｆｏｒ　ｈｏｒｓｅｓ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｏｆ　１．２．１抗原制备　肉毒Ａ型、Ｆ型类毒素由肉毒　ｅｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ　ｔｙｐｅ　Ｆ　ｔｏｘｏｉｄｓ　ｍＬ／匹　Ａ型、Ｆ型毒素经甲醛脱毒，硫酸铵精制而成。使用　Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２佐剂配制，Ａ型、Ｆ型类毒素与　Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２混合后经过高剪切力的分散机　剧烈搅拌获得稳定的乳剂。使用福氏不完全佐剂配　制，福氏不完全佐剂由羊毛脂与液体石蜡以１：２的　质量比混合而成，经１２１℃３０　ｍｉｎ灭菌，冷却后分　别与Ａ型、Ｆ型类毒素按一定比例混合由恒温培养　振荡器震荡乳化３０　ｍｉｎ。　１．２．２免疫方法　所有实验动物均用福氏不完　全佐剂基础免疫后开始分组试验。第一组：第１针　用Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２佐剂，第２、３针用福氏不完　全佐剂；第二组：第２针用Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２佐　剂，第１、２针用福氏不完全佐剂；第三组：第３针用　Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２佐剂，第１、２针用福氏不完全佐　剂；第四组：第１、２、３针全程使用福氏不完全佐剂；　第五组：第１、２、３针全程使用Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２　佐剂。家兔免疫程序（Ａ型肉毒类毒素）见表１，马　免疫程序（Ｆ型肉毒类毒素）见表２。　表１家兔免疫程序（Ａ型肉毒类毒素）　Ｔａｂ．１　Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｇｒａｍ　ｆｏｒ　ｒａｂｂｉｔｓ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｏｆ　ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ　ｔｙｐｅ　Ａ　ｔｏｘｏｉｄｓ　ｍＬ／只　２　结果　２．１家兔免疫结果　２．１．１　家兔免疫血清效价　从家兔免疫血清结　果来看，全程使用福氏不完全佐剂免疫效价低。家　兔免疫全程使用Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２免疫效价低于　所有交替使用组，高于福氏不完全佐剂组。家兔第　表３家兔免疫血清效价（Ａ型肉毒类毒素）　Ｔａｂ．３　Ｔｉｔｅｒｓ　ｆｏｒ　ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ　ｉｍｍｕｎｉｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ　ｔｙｐｅ　Ａ　ｔｏｘｏｉｄｓ　ＩＵ／ｍＬ　家兔　第一组第二组第三组第四组第五组　死亡数（只）　３　１　２　１　３　２．２马免疫结果　２．２．１　马免疫血清效价　从马免疫血清结果来　看，全程使用福氏不完全佐剂免疫效价低。马免疫　全程使用Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２免疫效价上升较快，　但随着免疫程次的增加，效价逐渐下降。两种佐剂　交替使用效果较好，以第二、三组（分别在第２、３针　使用Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２，其余使用福氏不完全佐　剂）最好，免疫效价较高。马免疫血清效价见表５。　・４４・　微生物学免疫学进展２０１３年第４１卷第４期Ｐｒｏｇ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　ｌｍｍｕｎｏｌ　Ａｕｇ．２０１３，Ｖｏ１．４１，Ｎｏ．４　２．２．２马死亡统计　马试验免疫至第四程时，第　泻和感染性休克，由此判断该马死亡的原因是急性　结肠炎，该病的发生有可能是这匹马在实验中曾饲　五组（第１、２、３针全部使用Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２佐　剂）马死亡一匹。在实验中死亡的马出现了急性腹　喂过多精料或这匹马曾有上呼吸道感染病史。　表５马免疫血清效价（Ｆ型肉毒类毒素）　Ｔａｂ．５　Ｔｉｔｅｒ　ｆｏｒ　ｈｏｒｓｅ　ａｎｔＪｓｅｒｍｎ　ｉｍｍｕｎｉｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ　ｔｙｐｅ　Ｆ　ｔｏｘｏｉｄｓ　１Ｕ／ｍＬ　３讨论　马免疫效果决定于免疫血浆效价的高低，而佐　剂的选择对马免疫效果具有很重要的作用。免疫佐　剂使用福氏不完全佐剂，在液体石蜡加羊毛脂（乳　化剂）的作用下，血清免疫效价有所提高。但是福　氏不完全佐剂对马的刺激性强，化脓多，容易造成肝　脏破裂，其中免疫佐剂所含液体石蜡是矿物油，为　致癌性物质，对马刺激大，不易被吸收。使用福氏　５０Ｖ２，其余注射用福氏不完全佐剂）最好，免疫效　价较高。实验为Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２在马免疫中的　应用，提供了一个试验平台和相应的数据。在免疫　马血浆生产中，由于马免疫时间较长，所以仅免疫四　程其结果还不能作为最终的结论判断是否适宜用于　免疫马血浆生产中，因此Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２佐剂　在马肉毒免疫血浆生产中的应用，还须进一步验证　确定　一一　一～一～一一～　一～一一～不完全佐剂在冬季注射时由于其黏度高容易凝固，　使用水浴融化时温度控制不好容易造成免疫原性降　低。而使用Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２抗原乳剂能诱导强　而持久的免疫效果，与福氏不完全佐剂相比，使用　Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２制备的乳剂非常稳定且易于注　参考文献　射，对Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２进行的毒理学试验也证　实该佐剂无毒。　在实验中，从家兔和马的免疫结果来看，全程使　用福氏不完全佐剂免疫效价低，死亡率也低。家兔　免疫全程使用Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２免疫效价低于所　有交替使用组，高于福氏不完全佐剂组，死亡率最　高。马免疫全程使用Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０Ｖ２免疫效价　上升较快，但随着免疫程次的增加，效价逐渐下降。　两种佐剂交替使用效果较好，其中家兔以第二组　（第２针注射用Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５０　Ｖ２，其余注射用福　氏不完全佐剂）最好，免疫效价最高而死亡率最低。　马以第二、三组（分别以第２、３针用Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ