一种利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 110229852 A(43)申请公布日 2019.09.13

(21)申请号 201910538323.9(22)申请日 2019.06.20

(83)生物保藏信息

GDMCC No:60626 2019.04.09

(71)申请人 东莞理工学院

地址 523808 广东省东莞市松山湖科技产

业园区大学路1号东莞理工学院化学工程与能源技术学院

申请人 中储粮油脂工业东莞有限公司(72)发明人 邹水洋　张乐　叶植湘　陈旭　

张书艳　苏沛　(74)专利代理机构 天津市北洋有限责任专利代

理事务所 12201

代理人 潘俊达　郭宝煊

权利要求书1页 说明书5页

(51)Int.Cl.

C12P 13/02(2006.01)C12R 1/125(2006.01)

CN 110229852 A(54)发明名称

一种利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法(57)摘要

本发明属于微生物工程技术领域，尤其涉及一种利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：以大豆或豆粕为原料制备大豆浆液；大豆浆液经蛋白酶适度酶解使大豆

将大豆蛋白酶解蛋白的水解度控制在10～35％；

物中固形物质量百分浓度调整为1～6％，添加葡萄糖或蔗糖，谷氨酸钠，用作培养枯草芽孢杆菌的培养基；将枯草芽孢杆菌种子液按1～8％的接种量接种于大豆蛋白酶解物培养基，摇床培养或发酵罐通气培养36～54h后终止发酵，收获γ-聚谷氨酸。本发明提供的利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法能显著提高γ-聚谷氨酸产量，且原料价廉易得，能有效降低成本，因而具有良好的应用前景。

CN 110229852 A

权　利　要　求　书

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1.一种利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：清洗大豆或豆粕，加入8～15倍质量的去离子水，在20～30℃浸泡4～10h，用豆浆机打浆过滤去渣，得大豆浆液；

步骤二：调节步骤一得到的大豆浆液至pH值为8～11，加入碱性蛋白酶20～200万u/L，40～65℃保温酶解1～8h，控制蛋白质水解度为10～35％，然后加热灭酶活，冷却，5000r/min离心分离20min，取上清液，得大豆蛋白酶解物；

步骤三：调节步骤二得到的大豆蛋白酶解物浓度，加入碳源及聚谷氨酸合成前体物质，调节pH6～8，于110～121℃灭菌20～30min后冷却至室温备用，得大豆蛋白酶解物培养基；

步骤四：取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)接种到种子液培养基，37℃摇床培养或通气培养16～24h，得枯草芽孢杆菌种子液；

步骤五：将步骤四得到的枯草芽孢杆菌种子液按1～8％的接种量接种于步骤三得到的大豆蛋白酶解物培养基，33～39℃恒温摇床培养或通气培养36～54h后，终止发酵，得发酵液；

步骤六：将步骤五得到的发酵液离心分离、去菌体，测定发酵液中γ-聚谷氨酸含量。2.根据权利要求1所述的利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：在步骤三中，所述大豆蛋白酶解物中的固形物质量百分浓度为1～6％。

3.根据权利要求1所述的利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：在步骤三中，所述碳源为10～30g/L，所述聚谷氨酸合成前体物质为20～50g/L。

4.根据权利要求1所述的利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：在步骤三中，所述碳源为葡萄糖或蔗糖，所述聚谷氨酸合成前体物质为谷氨酸钠。

5.根据权利要求1所述的利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：在步骤四中，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为枯草芽孢杆菌DG02。

6.根据权利要求1所述的利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：在步骤四中，所述种子液培养基的制备方法为在1000mL豆芽汁中加入50g蔗糖，自然pH，121℃灭菌20min。

7.根据权利要求6所述的枯草芽孢杆菌种子液的制备方法，其特征在于：所述豆芽汁的制备方法为在500g大豆芽中加入1000mL水，煮沸浓缩至500mL后，过滤去渣。

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一种利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法

技术领域

[0001]本发明属于微生物工程技术领域，尤其涉及一种利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。

背景技术

[0002]γ-聚谷氨酸(简称γ-PGA)，一种由微生物合成的高分子氨基酸聚合物，分子质量一般都在5万到200万道尔顿之间。γ-聚谷氨酸作为一种新型天然高分子材料，配合其无毒无害的特性，被广泛应用于化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等多个领域。γ-聚谷氨酸的工业生产方法一般采用微生物发酵合成法。在过去的几十年中，产业界和学术界对γ-聚谷氨酸的生产工艺进行了大量探索，虽然取得了重大进展，但γ-聚谷氨酸产品的价格依然昂贵，这在很大程度上限制了γ-聚谷氨酸的广泛应用。究其原因，是γ-聚谷氨酸生产效率低、生产成本高所致。因此，改进发酵工艺是提高γ-聚谷氨酸生产水平的重要途径。

[0003]对于发酵工艺而言，优化培养基是获得高产的必要环节。优良的菌种必须与其相适应的培养基及培养条件结合，才能充分发挥其生产潜力。如中国专利申请第02151746号公开了枯草芽孢杆菌NX-2及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法；中国专利申请第200410010509号公开了枯草芽孢杆菌zju-7及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法；中国专利申请200610155278号公开了利用枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和制备γ-聚谷氨酸的方法。上述现有技术都涉及将培养基优化使之适于生产菌的生长及促进γ-聚谷氨酸的合成。在枯草芽孢杆菌发酵合成γ-聚谷氨酸的代谢过程中，培养基中必须有充足的可利用碳源和氮源，有些谷氨酸依赖型菌株还需要提供充足的谷氨酸或谷氨酸钠作为前体来合成γ-聚谷氨酸。文献报道常用的使γ-聚谷氨酸增产的氮源物质有各种蛋白胨、酵母膏、牛肉膏等生化试剂，这些昂贵的生化试剂是γ-聚谷氨酸生产成本高昂的重要原因之一。另外，这些生化试剂作为氮源对我们试验的枯草芽孢杆菌而言，其γ-聚谷氨酸的增产效果并不明显。因此，开发新型的价格低廉、增产效果显著的氮源对提高γ-聚谷氨酸的生产水平和降低生产成本具有重要意义。

发明内容

[0004]本发明的目的在于：针对现有γ-聚谷氨酸生产技术中原料成本高、生产效率低的不足，以廉价易得的大豆或豆粕为原料制浆，经适度酶解后将大豆蛋白酶解物用作培养枯草芽孢杆菌的氮源物质来发酵生产γ-聚谷氨酸，达到提高γ-聚谷氨酸的产量，降低生产成本的目的。

[0005]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0006]本发明提供的利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：[0007]步骤一：清洗大豆或豆粕，加入8～15倍质量的去离子水，在20～30℃浸泡4～10h，用豆浆机打浆过滤去渣，得大豆浆液；

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说　明　书

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步骤二：调节步骤一得到的大豆浆液至pH值为8～11，加入碱性蛋白酶20～200万

u/L，40～65℃保温酶解1～8h，控制蛋白质水解度为10～35％，然后加热灭酶活，冷却，5000r/min离心分离20min，取上清液，得大豆蛋白酶解物；[0009]其中，碱性蛋白酶活力单位定义为：在40℃，pH 10的测定条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸所需要的酶量即为一个酶活力单位，用u表示。[0010]步骤三：调节步骤二得到的大豆蛋白酶解物浓度，加入碳源及聚谷氨酸合成前体物质，调节pH 6～8，于110～121℃灭菌20～30min后冷却至室温备用，得大豆蛋白酶解物培养基；

[0011]其中，大豆蛋白酶解物培养基的组成为：大豆蛋白酶解物中固形物质量百分浓度为1～6％，添加碳源(葡萄糖或蔗糖)10～30g/L，谷氨酸钠(聚谷氨酸合成前体物质)20～50g/L。

[0012]步骤四：取活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种接种到种子液培养基，种子液培养基在250mL锥形瓶的装液量为50～70mL，37℃摇床培养或通气培养16～24h，得枯草芽孢杆菌种子液。[0013]其中，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为枯草芽孢杆菌DG02(分类命名：Bacillus subtilis；保藏日期：2019年4月9日；保藏编号：GDMCC No：60626；保藏单位全称：广东省微生物菌种保藏中心；保藏单位简称：GDMCC；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)。枯草芽孢杆菌种子液培养基的组成为：豆芽汁1000mL，蔗糖50g，自然pH，121℃灭菌20min。豆芽汁的制备方法为：500g黄豆芽加入1000mL水，煮沸浓缩至500mL后，过滤去渣即为豆芽汁。[0014]步骤五：将步骤四得到的枯草芽孢杆菌种子液按1～8％的接种量接种于步骤三得到的大豆蛋白酶解物培养基，然后在33～39℃摇床培养或发酵罐通气培养36～54h后，终止发酵，得发酵液。[0015]步骤六：将步骤五所得的发酵液经离心去除菌体，用高效液相色谱或CTAB沉淀法测定发酵液中γ-聚谷氨酸的含量。[0016]本发明的有益效果在于：大豆及豆粕来源广、蛋白质含量高、价格低，本发明以大豆或豆粕为原料制浆后用蛋白酶将豆浆中的蛋白质进行水解获得大豆蛋白酶解物，较其它蛋白酶解物具有原料价廉易得、品质稳定的优势；豆浆中除蛋白质外还含有丰富的可溶性糖类、矿物质、磷脂、维生素等营养成分，较大豆分离蛋白更适于微生物生长；所用碱性蛋白酶较中性蛋白酶，酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶等其他蛋白酶更适于水解大豆蛋白，具有水解速率高、酶用量少的优势；以大豆蛋白酶解物作为培养基氮源较采用其它蛋白胨、酵母膏(酵母粉)、牛肉膏等生化试剂作氮源显著节省原料成本；由于大豆活性肽具有促进多种微生物生长及发酵产物合成的生物活性，通过控制大豆蛋白酶解物的水解度及优化培养基组成、培养条件可使γ-聚谷氨酸产量比采用生化试剂培养基发酵提高一倍以上。[0017]保藏证明[0018]分类命名：Bacillus subtilis[0019]拉丁文学名：Bacillus subtilis DG02[0020]保藏日期：2019年4月9日[0021]保藏编号：GDMCC No：60626

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CN 110229852 A[0022][0023][0024]

说　明　书

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保藏单位全称：广东省微生物菌种保藏中心保藏单位简称：GDMCC保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼

具体实施方式

[0025]下面结合具体实施方式，对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不限于此。

[0026]实施例1[0027](1)种子液培养基的制备

[0028]在500g大豆芽中加水1000mL，煮沸浓缩至500mL时，过滤弃渣得豆芽汁；取豆芽汁200mL，蔗糖10g，自然pH，121℃灭菌20min，冷却后即为枯草芽孢杆菌种子液培养基。[0029](2)大豆蛋白酶解物培养基的制备[0030]步骤一：大豆清洗后加入10倍质量的去离子水25℃浸泡8h，用豆浆机打浆过滤去渣得大豆浆液，固形物浓度约为6％。[0031]步骤二：在500mL锥形瓶中加入大豆浆液200mL，调节pH至10，加入碱性蛋白酶160万u/L，60℃、120r/min水浴振荡酶解2h，100℃加热10min灭酶活，冷却后5000r/min离心20min，过滤去除沉淀物及漂浮的脂肪，所得浅黄色清液即为大豆蛋白酶解物，测得其水解度为18.34％。[0032]步骤三：将大豆蛋白酶解物稀释至固形物质量百分浓度为3％，添加碳源葡萄糖20g/L，谷氨酸钠(聚谷氨酸合成前体物质)50g/L，调pH 7.0；250mL锥形瓶中培养基装液量60mL；在110℃，20min灭菌后冷却至室温备用，得大豆蛋白酶解物培养基。[0033](3)γ-聚谷氨酸的发酵合成

[0034]取活化的枯草芽孢杆菌DG02斜面菌种接种到种子液培养基，于37℃、150r/min恒温摇床培养18h得到枯草芽孢杆菌种子液；按5％接种量将种子液接入大豆蛋白酶解物培养基，于37℃、150r/min恒温摇床培养48h后终止发酵。将发酵液离心分离(5000r/min、20min)去除菌体及固体颗粒，用CTAB沉淀法测定γ-聚谷氨酸含量为39.12g/L。[0035]实施例2[0036](1)种子液的制备[0037]同实施例1。[0038](2)大豆蛋白酶解物培养基的制备[0039]步骤一：同实施例1。[0040]步骤二：在5L液体发酵罐中加入大豆浆液2.0L，调节pH至10，加入碱性蛋白酶160万u/L，60℃、120r/min保温酶解2h，100℃加热10min灭酶活，冷却后5000r/min离心20min，过滤去除沉淀物及漂浮的脂肪，所得浅黄色清液即为大豆蛋白酶解物，测得其水解度为17.53％。

[0041]步骤三：将大豆蛋白酶解物稀释至固形物质量百分浓度为3％，添加碳源蔗糖20g/L，谷氨酸钠(聚谷氨酸合成前体物质)50g/L，调pH 7.0；发酵罐中培养基装液量3.0L；在121℃，30min灭菌后冷却至室温备用，得大豆蛋白酶解物培养基。[0042](3)γ-聚谷氨酸的发酵合成

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说　明　书

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取活化的枯草芽孢杆菌DG02斜面菌种接种到种子液培养基，500mL锥形瓶装液量

120mL，于37℃、150r/min恒温摇床培养18h得到枯草芽孢杆菌种子液；按5％接种量将种子液接入大豆蛋白酶解物培养基，于37℃培养；培养阶段1～6h通气比逐渐增大并维持在0.3～0.6(v/v)，搅拌转速150～200r/min；培养阶段7～18h通气比维持0.6～0.8(v/v)，搅拌转速200～300r/min；培养阶段19～42h通气比逐渐减小并维持0.5～0.3(v/v)，搅拌转速150～200r/min；培养过程监控调节pH在6.5～7.5，加入适量消泡剂消除泡沫，总培养时间42h后终止发酵。将发酵液离心分离(5000r/min、20min)去除菌体及固体颗粒，用CTAB沉淀法测定γ-聚谷氨酸含量为38.86g/L。5L发酵罐发酵比摇瓶实验缩短发酵周期约6h，γ-聚谷氨酸产量与摇瓶发酵结果接近。[0044]对比例1[0045](1)种子液培养基的制备[0046]同实施例1。[0047](2)大豆蛋白培养基的制备[0048]步骤一：大豆制浆过程同实施例1。[0049]步骤二：直接将豆浆稀释至固形物质量百分浓度为3％，添加碳源葡萄糖20g/L，谷氨酸钠(聚谷氨酸合成前体物质)50g/L，调pH7.0；250mL锥形瓶中培养基装液量60mL；在110℃，20min灭菌后冷却至室温备用，得大豆蛋白培养基。[0050](3)γ-聚谷氨酸的发酵合成[0051]实施步骤同实施例1。用CTAB沉淀法测定γ-聚谷氨酸含量为11.43g/L。[0052]对比例2[0053](1)种子液培养基的制备[0054]同实施例1。[0055](2)生化试剂培养基的制备

[0056]以酵母膏为氮源的生化试剂培养基组成为：葡萄糖35g/L，酵母膏10g/L，谷氨酸钠40g/L，MgSO4 1.0g/L，K2HPO4 2.0g/L，MnSO40.5g/L，pH 7.0，250mL锥形瓶装液量50mL；在110℃，20min灭菌后冷却至室温备用。[0057](3)γ-聚谷氨酸的发酵合成

[0058]取活化的枯草芽孢杆菌DG02斜面菌种接种到种子液培养基，于37℃，摇床转速150r/min培养24h；按3％接种量将种子液接入大豆蛋白酶解物培养基，于37℃、150r/min培养48h后终止发酵。将发酵液离心分离(5000r/min、20min)去除菌体及固体颗粒，用CTAB沉淀法测定γ-聚谷氨酸含量为17.83g/L。[0059]由实施例1、2与对比例1比较可以看出，大豆蛋白经适度酶解后作为氮源的大豆蛋白酶解物培养基可显著提高γ-聚谷氨酸产量，比直接用豆浆作氮源的大豆蛋白培养基增加200％以上；其原因是大豆蛋白经碱性蛋白酶适度水解后产生的多种生物活性肽对枯草芽孢杆菌合成γ-聚谷氨酸有促进作用，而大豆蛋白不具备这种生物活性。[0060]由实施例1、2与对比例2比较可以看出，大豆蛋白酶解物培养基比酵母膏作氮源的生化试剂培养基更能促进枯草芽孢杆菌合成γ-聚谷氨酸，其γ-聚谷氨酸产量提高100％以上；酵母膏是前期对常用氮源优化实验中选出的最佳氮源，通过对比说明了大豆蛋白酶解物比酵母膏这类发酵工业常用氮源更具优势。

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说　明　书

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综上，本发明以大豆或豆粕为原料制浆后用蛋白酶将豆浆中的蛋白质进行水解获

得大豆蛋白酶解物，较其它蛋白质来源具有原料价廉易得的优势；豆浆中除蛋白质外还含有丰富的可溶性糖类、矿物质、磷脂、维生素等营养成分，较大豆分离蛋白更适于微生物生长；所用碱性蛋白酶较中性蛋白酶，酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶更适于水解大豆蛋白，具有水解速率高、酶用量少的优势；以大豆蛋白酶解物作为培养基氮源较采用各类蛋白胨、酵母膏(酵母粉)、牛肉膏等生化试剂显著节省原料成本；通过控制大豆蛋白酶解物的水解度及优化培养基的组成及培养条件可使γ-聚谷氨酸产量比生化试剂培养基发酵产量提高一倍以上。

[0062]根据上述说明书的揭示和启发，本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上述的具体实施方式，凡是本领域技术人员在本发明的基础上所作出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

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